Qui, dimostriamo il nostro protocollo di isolamento primario delle cellule sinusoidali del fegato di topo o isolamento LSECs. Il protocollo consiste nella perfusione di collagenasi epatica e ultracentrifugazione a bassa velocità per la purificazione delle cellule non parenchimali e la selezione di perline magnetiche CD146. Il nostro metodo di isolamento LSEC è altamente efficiente e applicabile al fegato di topo sano e malato.
Gli LSEC isolati mostrano un'elevata purezza e ne preservano la struttura e la funzione. Gli LSEC isolati utilizzando questo protocollo sono ottimali per studi funzionali e molecolari e generazione di dati multi-omici. Questo protocollo sarà utile per studiare la comunicazione intercellulare nel fegato.
Inizia rivestendo piatti di coltura di 10 centimetri con tre millilitri di soluzione di collagene. Quindi, incubare i piatti a temperatura ambiente per un'ora. Dopo un'ora, rimuovere il liquido in eccesso dalla superficie rivestita.
Lavare i piatti con PBS tre volte e lasciarli asciugare all'aria. Installare l'apparato di perfusione a ricircolo riscaldato e umidificato. Risciacquare il sistema di perfusione con candeggina al 10% per cinque minuti.
Quindi, risciacquare nuovamente il sistema con acqua sterile per altri 10 minuti. Scolare il liquido di risciacquo il più possibile prima di perfonderlo con la soluzione di collagenasi. Infondere la soluzione di collagenasi attraverso il sistema di perfusione per preriscaldarla a 37 gradi Celsius.
Impostare la velocità della pompa su uno veloce sulla ghiera di controllo della velocità. Mantieni la velocità uguale durante l'intera procedura. Pesare il mouse per la procedura.
Quindi fissarlo alla superficie chirurgica. Spruzzare l'addome del topo con il 70% di etanolo. Usando le forbici chirurgiche, fai un'incisione di circa cinque centimetri partendo dalla parte inferiore dell'addome fino al processo xifoide.
Successivamente, fai due tagli laterali usando piccole forbici dell'iride su ciascun lato dell'addome per esporre completamente gli organi addominali. Posizionare la guaina del catetere IV sotto la schiena dell'animale per sollevare e livellare l'addome. Usando una normale pinza da medicazione curva, tirare delicatamente l'intestino e lo stomaco a sinistra dell'animale.
Quindi, posizionare una sutura chirurgica 5-0 sotto la vena cava inferiore, o IVC, appena sotto il rene sinistro esposto. Legare un gancio sciolto nella sutura. Quindi, posizionare un'altra sutura chirurgica 5-0 attorno alla vena porta epatica.
Posizionare la sutura appena sopra il punto di ramificazione della vena splenica della vena porta epatica. Ancora una volta, legare un intoppo sciolto nella sutura. Utilizzando la sutura della vena porta come tensione, inserire il catetere IV calibro 20 nella vena porta epatica un centimetro più in basso dove si ramifica verso la vena porta epatica destra e sinistra.
Quindi, far scorrere il catetere sulla vena, ma tenerlo sotto l'area di ramificazione. Lasciare che il sangue viaggi lungo il catetere fino a quando non inizia a gocciolare. Fissare il catetere IV con la sutura della vena porta.
Utilizzare una linea IV per collegare una bottiglia IV con tampone A al catetere. Quindi, lavare il fegato con questa soluzione evitando l'ingresso di aria nel sistema. Legare la sutura intorno all'IVC sotto il rene.
Successivamente, taglia l'IVC sotto la sutura per consentire all'animale di sanguinare. Una volta perfuso, tagliare via lo stomaco, l'intestino, la milza e altre interiora attaccate al fegato. Quindi, tagliare via il diaframma e i vasi principali dalla cavità toracica.
Rimuovere il fegato dall'animale e posizionarlo sul vassoio di perfusione. Rimuovere con attenzione la linea IV e collegare la soluzione di collagenasi nella camera di ricircolo. Lasciare che il fegato si perfonda fino a quando la capsula diventa modellata e appare molle.
Questo dovrebbe richiedere in genere da 10 a 15 minuti. Una volta digerito, rimuovere il fegato dalla camera e posizionarlo su una capsula di Petri di 10 centimetri con circa 20 millilitri di DMEM senza siero. Raccogliere delicatamente il fegato con un paio di punte di pipetta e scartare l'albero biliare.
Successivamente, filtrare la sospensione epatica attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 50 volte G per due minuti a temperatura ambiente. Quindi, raccogliere il surnatante contenente cellule epatiche non parenchimali.
Centrifugare il surnatante a 300 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, raccogliere il pellet cellulare e risospenderlo in un millilitro di tampone di isolamento. Determinare il numero di cella utilizzando un contatore di celle automatico seguendo le istruzioni del produttore.
Quindi, centrifugare la sospensione cellulare. Aspirare completamente il surnatante e risospescere il pellet con 90 microlitri di tampone di isolamento per 10 milioni di celle. Aggiungi 10 microlitri di CD146 MicroBeads per 10 milioni di celle totali.
Mescolare bene e incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Per lavare le cellule, aggiungere uno o due millilitri di tampone di isolamento per 10 milioni di cellule. Centrifugare la soluzione a 300 volte G per 10 minuti.
Successivamente, aspirare completamente il surnatante e risospendere fino a un miliardo di cellule in 500 microlitri di tampone di isolamento. Quindi, preparare la colonna di separazione risciacquandola con tre millilitri di tampone di isolamento. Applicare la sospensione della cella sulla colonna impilata con filtri di pre-separazione da 70 micrometri.
Lavare la colonna con tre millilitri di tampone di isolamento tre volte. Successivamente, rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su un tubo centrifugo da 15 millilitri. Pipettare cinque millilitri di buffer di isolamento sulla colonna.
Per recuperare le celle con etichetta magnetica con perline, spingere con decisione lo stantuffo nella colonna per scovare le celle. Infine, centrifugare le cellule a 300 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. La purezza e i marcatori di superficie isolati di LSEC sono stati valutati con citometria a flusso.
L'analisi dei dati e la strategia di gating per LSEC gated e singlet si basano su dati di dispersione diretta e diffusione laterale. Le LSECs isolate sono state colorate con un colorante di vitalità e una combinazione di anticorpi CD45, CD146 e Stabilin-2. Le LSEC vitali sono state gated sulla popolazione CD45 negativa e analizzate per l'espressione di CD146 e Stabilin-2.
Da questi dati, è stato confermato che le LSEC isolate avevano una vitalità superiore al 94% e una purezza superiore al 90%. Il fenotipo LSEC-specifico delle cellule isolate è stato ulteriormente confermato utilizzando la microscopia ottica e la microscopia elettronica a scansione. Le LSEC isolate sono state coltivate nel terreno di crescita completo per sei ore ed esaminate al microscopio ottico.
Le frecce bianche nell'immagine SEM indicano LSEC fenestrae, che è una caratteristica morfologica caratteristica delle LSEC. I passaggi critici per garantire la completa perfusione di un tessuto epatico sono il corretto posizionamento del nastro del catetere, evitando l'introduzione di aria nel catetere e i tempi ottimali della digestione della collagenasi. LSEC di alta qualità acquisito utilizzando il nostro protocollo faciliterà l'identificazione del meccanismo molecolare della funzione LSEC e migliorerà la nostra comprensione del loro ruolo nella comunicazione intercellulare nel fegato, nella salute e nella malattia.
