Name: isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells
Uploaded: 2016-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells at JoVE.com

This study is supported by American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 and the National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). We thank Roberto Mendez from Wayne State University for assisting in the preparation of the manuscript.

1. Isolamento di Aorta di topi Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della Wayne State University. <ol><li> Mettere il mouse nella camera di induzione della macchina per anestesia. Impostare il flusso isoflurano al 4% in congiunzione con il 25% di aria fresca e il 75% O 2. Anestetizzare il mouse per inalazione di isoflurano (4% per l&#39;induzione, ± 1,0% per la manutenzione) in combinazione con il 25% di aria fresca e il 75% O 2 con camera di induzione seguita da un&#39;ogiva dedicata. NOTA: anestesia con isoflurano può essere consegnato nel 75% di ossigeno / 25% di aria o ossigeno al 100%. </li><li> Controllare il mouse ogni 5 minuti fino a quando il livello appropriato di anestesia viene raggiunta (mancanza di recesso a pizzico tep). </li><li> Prendere il mouse fuori dalla camera di induzione e continuare isoflurano inalazione se l&#39;ogiva dedicato che è collegato alla macchina per anestesia. Accendere ilisoflurano flusso al 1% per mantenere l&#39;anestesia. </li><li> Mentre è sotto anestesia, mettere il mouse su un tampone chirurgico, posizionata sul dorso. Utilizzare nastro di laboratorio per fissare gli arti. </li><li> Utilizzare una lampada riscaldante per mantenere caldo il mouse. Mantenere la lampada in una distanza appropriata dal mouse in modo che il mouse non surriscaldamento. </li><li> Spruzzare il petto con il 70% di etanolo. </li><li> Usare le forbici dissezione per aprire l&#39;addome dalla linea mediana, ed esporre l&#39;aorta addominale. Aprire la cavità toracica ed esporre il cuore ei polmoni. </li><li> Tagliare l&#39;aorta addominale a metà con le forbici dissezione per rilasciare il sangue. </li><li> Riempire una siringa da 1 ml (con il 25 ago G) con 1 ml di PBS contenente 1.000 U / mL di eparina. Iniettare PBS contenente 1,000 U / mL di eparina al ventricolo sinistro e l&#39;aorta profumato. Premere il cuore e il polmone con una pinza a grandi arterie al lato destro dei topi per esporre l&#39;aorta toracica. </li><li> Rimuovere rapidamente l&#39;aorta toracica utilizzando micro-diforcipe ssection e metterlo in ghiaccio freddo 1x PBS (sterile), poi trasportare il contenitore in una cappa di flusso d&#39;aria laminare. </li><li> Inserire una siringa da 1 ml munito 25 ago G in un&#39;estremità dell&#39;aorta, e lavare delicatamente l&#39;aorta con PBS freddo per rimuovere il sangue. </li><li> Utilizzare pinze micro-dissezione per rimuovere la maggior quantità di tessuto adiposo allegato e piccoli vasi laterali possibile. </li><li> Trasferire immediatamente l&#39;aorta a endoteliali terreno di coltura. </li><li> Tagliare l&#39;aorta in anelli di 1 mm con una lama di bisturi sterile. Harvest circa 8 - 10 anelli per aorta. </li><li> Aprire ogni anello aortico utilizzando un paio di forbici micro-dissezione. </li></ol> 2. Seed i segmenti aortici su matrice <ol><li> Quando non in uso, mantenere la matrice fattore-ridotto la crescita in -20 ° C per evitare la solidificazione. Mettere la matrice fattore-ridotto la crescita in 4 ° C almeno per una notte per consentire un disgelo completo. </li><li> Preraffreddare a 6 pozzetti punte piastra e pipette a -20 ° C per almeno10 minuti. Mettere il 6 pozzetti su ghiaccio e cappotto un pozzetto della piastra con 1 mL di matrice senza introdurre bolle d&#39;aria. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° per 20 minuti per consentire la matrice solidificazione. </li><li> Impiantare i pezzi aortica sulla matrice solidificata utilizzando sterili pinze micro-dissezione. Mettere i pezzi lume-side-down sulla matrice senza toccare l&#39;endotelio. Posizionare 3 - 4 segmenti aortici vicini tra loro sulla matrice. </li><li> Aggiungere appena abbastanza terreno di crescita delle cellule endoteliali per mantenere i segmenti bagnato (~ 200 mL). </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C sotto 5% di CO 2 per 4 a 6 ore. Alla fine della giornata, aggiungere sufficiente medio per coprire i segmenti aortici. </li><li> Osservare il segmento aortico germinazione periodicamente al microscopio a contrasto di fase. Controllare il livello medio e la crescita cellulare ogni giorno. Aggiungere mezzo, se necessario, per mantenere i segmenti aortici coperti. </li><li> Al 4 ° giorno, rimuovere delicatamente il supporto e rimuovere il segmento aortico FROM la matrice utilizzando un ago sterile senza interrompere le crescenti cellule endoteliali. </li><li> Aggiungere 2 ml di nuovo terreno di coltura delle cellule endoteliali e permettono alle cellule endoteliali continuano a proliferare sulla matrice per 2 - 3 giorni. </li></ol> 3. Passaging iniziale delle cellule di topo aortica endoteliali <ol><li> Coat un pallone nuovo T12.5 con gelatina (0,1%), incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Lavare le piastre di matrice accuratamente con sterile 37 ° C PBS. </li><li> Aggiungere 2 ml di proteinasi neutro (50 U / mL) per le piastre di matrice e incubare a temperatura sulla piattaforma oscillante con agitazione occasionale stanza. Controllare le cellule al microscopio a contrasto di fase per assicurarsi che la maggior parte delle cellule sono staccato. </li><li> Aggiungere 2 ml di D-Val di inattivare la proteinasi neutro. </li><li> Raccogliere accuratamente il surnatante in una provetta 15 centrifuga. Lavare la piastra con 2 mL D-Val e raccogliere il surnatante. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 900 xg per 5 min a rooTemperatura di m. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 4 ml di terreno di coltura delle cellule endoteliali e la piastra nel pallone T12.5 rivestito con gelatina. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 h. </li><li> Sostituire il medium. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 fino a quando sono 85% - 90% confluenti. </li></ol> 4. Passaging delle cellule di topo aortica endoteliali <ol><li> Coat due nuovi flaconi T12.5 con gelatina (0,1%), incubare a 37 ° C per 30 min. Preriscaldamento Tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 0.02 EDTA in PBS) e sterile PBS a 37 ° C per circa 15 min. </li><li> Lavare le cellule con cura con sterile 37 ° C PBS. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 0.02 EDTA in PBS) e incubare a 37 ° C per 1 min ~ o finché la maggioranza delle cellule girarsi. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno di coltura delle cellule endoteliali per fermare la digestione. Pipetta la sospensione cellulare su e giù nei pallone più volte. Se necessario, utilizzare una cellaraschietto per raccogliere le cellule. </li><li> Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 15. Centrifugare la sospensione cellulare a 900 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 4 ml di terreno di coltura delle cellule endoteliali e la piastra in 2 flaconi T12.5 rivestiti con gelatina. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 h. </li><li> Sostituire il medium. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 fino a quando sono 85% - 90% confluenti. </li><li> Utilizzare il mouse cellule endoteliali aortiche dopo 2 - 3 passaggi. </li></ol> 5. Caratterizzazione delle cellule di topo aortica endoteliali <ol><li> Re-plate cellule. <ol><li> Coat una piastra da 6 pozzetti con gelatina (0,1%), incubare a 37 ° C per 30 min. Sciacquare la piastra con PBS. </li><li> Pre-riscaldare la tripsina-EDTA e sterile PBS a 37 ° C per circa 15 min. </li><li> Lavare le cellule con PBS sterile per 3 volte. Aggiungere 0,5 ml di tripsina / EDTA alle cellule, incubare per ~ 1 min a 37 ° C or finché la maggior parte delle cellule girarsi. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno di coltura delle cellule endoteliali per fermare la digestione. Pipetta la sospensione cellulare su e giù nei pallone più volte. Se necessario, utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere le cellule. </li><li> Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 15. Centrifugare la sospensione cellulare a 900 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante, risospendere le cellule in terreno di coltura delle cellule endoteliali. Seme le cellule in 6 pozzetti rivestiti con gelatina alla densità di 3 x 10 5 / pozzetto. </li><li> Incubare le cellule per una notte a 37 ° C, 5% CO 2 per permettere alle cellule di attaccarsi alla superficie cultura. </li></ol></li><li> Dil-ac-LDL uptaken e Ulex -lectin vincolante. <ol><li> Conservare il 1,1&#39;-diottadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindo carbocyanine perclorato marcato LDL acetilato (Dil-ac-LDL) a -20 ° C. Prima della colorazione, scongelare Dil-ac-LDL sul ghiaccio. Il Solu magazzino Dil-ac-LDLzione è 1 mg / mL. Conservare il europaeus agglutinin coniugati con fluoresceina Ulex (Ulex -Lectin, 1 mg / ml) a 4 ° C. La soluzione madre Ulex -Lectin è di 1 mg / mL. Conservare Hoechst 33342 a 4 ° C. La soluzione madre 33342 Hoechst è di 100 mg / ml. </li><li> Aggiungere 10 ml di Dil-ac-LDL soluzione stock di 1 ml di terreno di coltura per effettuare una concentrazione finale di 10 mg / mL. </li><li> Prima della colorazione, rimuovere il vecchio medie e lavare le cellule in ciascun pozzetto con nuovo mezzo. </li><li> Rimuovere il nuovo mezzo e aggiungere il supporto colorazione Dil-ac-LDL. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 1 h. </li><li> Lavare le cellule con sterili 1x PBS 3 volte. </li><li> Aggiungere 1 ml di formalina al 10% per riparare le cellule. Mettere la piastra in temperatura ambiente per circa 30 min. </li><li> Lavare le cellule con sterili 1x PBS 3 volte. Evitare la luce. </li><li> Aggiungere 1 ml sterile 1x PBS contenente 10 ml di Ulex -Lectin. </li><li> Incubare le cellule a camera tempere al buio per 1 h. </li><li> Rimuovere il Ulex-lectina lavando le cellule con sterili 1x PBS 3 volte. </li><li> Aggiungere Hoechst 33342 alla concentrazione finale di 1 mg / ml, incubare 10 minuti al buio. </li><li> Mostra la fluorescenza di Dil-ac-LDL (rosso, eccitazione lunghezza d&#39;onda di 576 nm), Ulex -Lectin (verde, eccitazione lunghezza d&#39;onda di 519 nm) e Hoechst (blu, eccitazione lunghezza d&#39;onda di 361 nm) con un microscopio a fluorescenza invertito. </li></ol></li><li> colorazione fluorescente per CD31, VEGFR2, eNOS, VE-caderina e Calponin. <ol><li> Conservare FITC-coniugato anticorpo anti-topo CD31, anticorpi eNOS, VE-caderina anticorpi, FITC-coniugato anti-IgG di coniglio a 4 ° C al buio. Conservare l&#39;anticorpo VEGFR2 a -20 ° C. </li><li> Lavare le cellule con sterili 1x PBS 3 volte. </li><li> Aggiungere 1 ml di formalina al 10% per riparare le cellule. Mettere la piastra in temperatura ambiente per circa 30 min. </li><li> Lavare le cellule con sterili 1x PBS 3 volte. </li><li> Per macchiare CD31, aggiungere 1 ml di 1x steriliPBS contenente 10 ml di anticorpi CD31-FITC. Per macchiare o VEGFR2, eNOS, VE-caderina o calponin, aggiungere 1 ml di sterile 1x PBS contenente 4 ml di VEGFR2, eNOS, VE-caderina o calponin anticorpo primario, rispettivamente. </li><li> Incubare le cellule in ghiaccio per 1 ora al buio. </li><li> Rimuovere gli anticorpi lavando le cellule con PBS sterile 3 volte. </li><li> Per la colorazione di VEGFR2, eNOS, VE-caderina o calponin, aggiungere 1 ml di sterile 1x PBS contenente 10 ml di FITC-coniugato IgG anti-coniglio. Incubare le cellule in ghiaccio per 1 ora al buio. Rimuovere la IgG lavando le cellule con PBS sterile 3 volte. </li><li> Aggiungere Hoechst 33342 alla concentrazione finale di 1 mg / ml, incubare 10 minuti al buio. </li><li> Vista la fluorescenza di CD31, VEGFR2, eNOS, VE-caderina, calponin (verde, di eccitazione lunghezza d&#39;onda di 518-535 nm) e Hoechst (blu, l&#39;eccitazione lunghezza d&#39;onda di 361 nm) con un microscopio a fluorescenza invertito. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Questo studio dimostra un metodo semplice per isolare e cultura endoteliali cellule da una aorta mouse senza particolari attrezzature. La colorazione immunofluorescenza indicato che la maggior parte delle cellule erano cellule endoteliali dopo il secondo passaggio. Si suggerisce che le cellule in seconda al terzo passaggio sono adatti in vitro e in vivo per studiare biologia endoteliale. Le note principali del protocollo Presente Ci sono cinque punti critici nella procedura. Innanzitutto, il lume vascolare viene lavata con PBS contenente eparina per minimizzare l&#39;attivazione delle cellule endoteliali e la formazione del coagulo. In secondo luogo, il tempo tra l&#39;arresto cardiaco e la semina del segmento aortico sulla matrice è fondamentale per endotelio redditività. Mentre la compensazione del tessuto adiposo peri-arteriosa e del tessuto connettivo, di evitare che si estende l&#39;aorta e limitare il tempo speso su questo passaggio per 10 - 15 minuti. In terzo luogo, versareappena sufficienti mezzi per coprire i segmenti dopo che sono stati seminati. Troppo mezzi causeranno i segmenti aortici di galleggiare. In quarto luogo, il mezzo di coltura contiene un&#39;alta concentrazione di supplemento di crescita delle cellule endoteliali, rendendo le cellule endoteliali crescono molto più velocemente quando coltivate in mezzo di crescita endoteliale-2. La conseguenza di cellule endoteliali sopprimere altri tipi di cellule, come le cellule muscolari lisce e fibroblasti. Quinto, la temporizzazione per rimuovere segmento aortico dalla matrice è anche fondamentale per la purezza delle cellule endoteliali. Questo passaggio impedisce la contaminazione da parte dei fibroblasti e cellule muscolari lisce. Il segmento deve essere rimosso prima dello sviluppo della rete tubo. rimozione ritardata del segmento aortico provocano contaminazione di altri tipi cellulari quali fibroblasti o cellule muscolari lisce. Si noti che questo approccio è anche usato per studiare l&#39;angiogenesi in vitro e la formazione di capillari come strutture indica la capacità angiogenesi del segmento dell&#39;aorta. Sulla base della nostra experience, se i segmenti vengono rimossi dopo che la struttura capillare come pienamente sviluppa, l&#39;incidenza di cellule muscolari lisce contaminazione aumenta drammaticamente. Pertanto, riteniamo che il punto di tempo per rimuovere il segmento è quando la rete inizia a essere visibili ma non è completamente sviluppato. In questo modo, siamo in grado di raccogliere quante cellule endoteliali possibile, mantenendo la contaminazione da parte delle cellule muscolari lisce al minimo. Le limitazioni del protocollo Presente Vi sono alcune limitazioni dei metodi descritti. Innanzitutto, ci sono possibilità di contaminazione dei fibroblasti e cellule muscolari lisce, se i segmenti aortici non vengono rimossi prima reti tubo sviluppano. I fibroblasti o cellule muscolari lisce possono iniziare a collegare alla matrice e proliferare 3 a 5 giorni dopo la semina. Pertanto, togliere sempre i segmenti aortici in modo tempestivo. Come precauzione secondaria, cambiando il mezzo 2 ore dopo re<html> -plating le cellule su un pallone nuovo aiuta anche a eliminare la possibile contaminazione dei fibroblasti e cellule muscolari lisce. In secondo luogo, queste cellule sono coltivate in vitro per 7 - 10 giorni dopo l&#39;isolamento. È possibile che i loro fenotipi possono essere diverse dalle cellule endoteliali appena isolate. Ad esempio, se le cellule endoteliali da un modello murino di iperlipidemia sono coltivate in terreno di crescita delle cellule endoteliali senza una elevata concentrazione di lipidi, non sono esposti all&#39;ambiente dislipidemico come erano negli animali. Le cellule endoteliali in coltura possono comportarsi in modo diverso da appena isolate cellule endoteliali 8. Questo problema esiste in tutte le cellule primarie in vitro in coltura e linee cellulari. Aggiungendo gli stimoli patologici nel terreno di coltura per imitare l&#39;ambiente in vivo può essere una soluzione. Le cellule endoteliali Dimostrare diversi fenotipi in diversi rami vascolari e_content &quot;&gt; Il sistema vascolare è una struttura gerarchica composta da arterie, vene e capillari. L&#39;eterogeneità delle cellule endoteliali che risiedono nelle specifiche&quot; zone &quot;di vascolarizzazione gioca un ruolo importante nella creazione di diversità funzionale del 9,10 sistema vascolare. Anche in un singolo letto vascolare, come l&#39;aorta, esiste eterogeneità endoteliale. flusso sanguigno laminare con alto sforzo di taglio nella zona rettilinea della aorta induce endoteliale ossido nitrico sintasi e trombomodulina 11. Pertanto, le cellule endoteliali che risiede nella parte diritta l&#39;aorta dimostrare anticoagulante, anti-adesivo e proprietà anti-infiammatorie 12,13. al contrario, turbolento il flusso di sangue in aree in cui le arterie ramo o sterzare bruscamente (arco aortico) riduce endoteliale espressione ossido nitrico sintasi e induce i geni aterogene in endoteliale cellule, cioè, il monociti chemiotattica proteina-1 fattori di crescita derivato dalle piastrine (MCP-1), e (PDGFs), Risultando in un fenotipo endoteliale pro-infiammatorie e aterosclerotica 6. Inoltre, le cellule endoteliali nei vasi di ogni organo subiscono cambiamenti adattativi anatomiche e funzionali che sono specifici per le funzioni che di organi 14,15. Tuttavia, vi è un consenso che i marcatori di superficie cellulare, vari geni funzionali e attività di cellule possono essere utilizzate per caratterizzare endoteliali linea cellulare. Questi marcatori di superficie delle cellule endoteliali includono piastrinica molecola di adesione delle cellule (PCAM-1, CD31), fattore di von Willebrand (vWF), vascolare endoteliale-caderina (VE-caderina, CD144). I geni funzionali di uso più frequente sono sintasi endoteliale dell&#39;ossido nitrico (eNOS) e Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR). Le attività cellulari che di solito si vedono in linea cellulare endoteliale includono assorbimento di Dil-ad-LDL e vincolante lectina, che forma strutture cavo-come sulla matrice. Il significato e future applicazioni di PriLe cellule coltivate mary mouse aortica endoteliali Il metodo qui descritto è usato per studiare le cellule endoteliali macrovascolari. Il significato di questo protocollo è che fornisce una grande opportunità per studiare le attività specifiche endoteliali di molecole bersaglio e può essere realizzata in knockout e modelli di topi transgenici, che rende molto utile nella ricerca cardiovascolare. La capacità di far crescere un numero elevato di topo cellule endoteliali aortiche in condizioni definite rende questa tecnica ideale per definire meglio i fenotipi e le funzioni di endotelio. Questa tecnica migliora la praticità di testare il potenziale potenziale della terapia a base di cellule endoteliali in modelli murini, sia attraverso iniezione endovenosa o attecchimento delle cellule endoteliali.

L&#39;endotelio vascolare non è solo uno strato barriera che separa il sangue e tessuti, è considerato un vasto ghiandola endocrina che si estende per l&#39;intero albero vascolare con una superficie di 400 metri quadrati 1. Il benessere dell&#39;endotelio è essenziale per l&#39;omeostasi vascolare. L&#39;endotelio disfunzionale partecipa a vari disturbi cardiovascolari, tra cui l&#39;aterosclerosi, vasculite e le lesioni da ischemia / riperfusione, ecc 2-4. Fino ad oggi, i meccanismi cellulari e molecolari specifici coinvolti in queste condizioni patologiche non sono ben compresi a causa della natura diffusa anatomica di endotelio. Il mouse è un modello importante per la ricerca perché le tecniche di manipolazione genetica sono più sviluppati nei topi che in tutte le altre specie di mammiferi. Tuttavia, l&#39;isolamento di murine cellule endoteliali aortiche primarie è considerato particolarmente difficile perché le piccole dimensioni dell&#39;aorta rende enzymatic digestione dell&#39;endotelio impraticabile. Alcuni hanno riferito le procedure per isolare e purificare EC richiede 5-7. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare un metodo semplice per isolare ed espandere cellule endoteliali dall&#39;aorta mouse senza utilizzare particolari attrezzature. In questo protocollo, l&#39;aorta fresco isolato viene tagliato in piccoli segmenti e seminate su una matrice con l&#39;endotelio rivolto verso il basso per consentire la germinazione endoteliale. Dopo segmenti vengono rimossi, le cellule endoteliali sono espanse in media endotelio-favorito e sono pronti per esperimenti dopo due o tre passaggi. I vantaggi del metodo descritto sono che: 1) considerevolmente elevato numero di cellule endoteliali sono raccolte da un singolo aorta; 2) la vitalità delle cellule è ben conservato; e 3) è necessaria alcuna attrezzatura speciale o tecnica. Esso fornisce un mezzo efficace per identificare i meccanismi cellulari e molecolari specifici di fisiopatologia delle cellule endoteliali. Per coloro che sono interessati a studiare primary cellule endoteliali coltivate da entrambi i topi knock-out del gene, gene knock-nei topi, o un modello di malattia murino, questo protocollo è molto utile e facile da praticare.

<table><tbody><tr><td>4- or 6-week-old mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>#10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth medium (Dulbeccos&amp;rsquo; Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium [DMEM] with 25&amp;nbsp;mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000&amp;nbsp;U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000&amp;nbsp;U/mL penicillin and 10&amp;nbsp;mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth factor reduced matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Neutral proteinase (Dispase, 1&amp;nbsp;U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034&amp;nbsp;g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos&amp;rsquo; Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1&#039;-dioctadecyl-3,3,3&#039;,3&#039;- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL)</td><td>Life Technologies</td><td>L3484</td><td></td></tr><tr><td>FITC-labeled &lt;em&gt;Ulex europaeus&lt;/em&gt; agglutinin (&lt;em&gt;Ulex&lt;/em&gt;-Lectin)</td><td>Sigma</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553372</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9698</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase</td><td>Abcam</td><td>ab5589</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse vascular endothelium-cadherin</td><td>Abcam</td><td>33168</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse calponin</td><td>Abcam</td><td>700</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-rabbit IgG</td><td>Sigma</td><td>F6005</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe fitted with 25-G needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-900-04222</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Peri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-516</td><td></td></tr><tr><td>Six-well cell culture plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>T12.5 culture flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-076</td><td></td></tr><tr><td>Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine with isoflurane</td><td>Webster Veterianary Supply</td><td>07-806-3204</td><td></td></tr><tr><td>heating lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge machine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted phase-contrast microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inverted fluorescence microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Endoteliale Cavolo cellulare Spontanea delle cellule endoteliali germogliamento ha iniziato da un segmento del mouse dell&#39;aorta. Il segmento del mouse aorta è stato permesso di crescere su una matrice fattore di crescita ridotto poi nel terreno di crescita endoteliale per 4 giorni. La germinazione delle cellule endoteliali di solito appare in 2 - 4 giorni. Microfotografie sono state scattate il giorno 4 (Figura 1). Come mostrato nelle immagini, numerose cellule endoteliali migrano dal segmento. I germogli di nuova formazione continuano ad estendersi dal segmento e il ramo. Fenotipi cellulari endoteliali Queste cellule hanno dimostrato le apparenze a forma di fuso e di ciottoli, come dopo il passaggio iniziale (Figura 2A). Le cellule attaccate sono state marcate con Dil-ac-LDL e Ulex -Lectin per un&#39;ora. Come mostrato nelle figure 2B-2E, la maggior parte delle cellule erano doppio positive per Dil-ac-LDL<html> uptake (rosso) e Ulex -Lectin vincolante (verde). Nel frattempo, dopo il secondo passaggio, più del 95% delle cellule era positivo per piastrine molecola di adesione delle cellule endoteliali 1 (CD31, PECAM-1, Figura 2F), VEGFR2 (figura 2G), VE-caderina (figura 2H), eNOS ( Figura 2I) ma negativi per Calponin (figura 2J) che è un marker delle cellule muscolari lisce. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52965/52965fig1.jpg" /> Figura 1. cellule endoteliali germinazione. Topo segmento aortico è stato seminato sulla matrice fattore-crescita ridotta e coltivate in terreno di coltura delle cellule endoteliali. Cellule endoteliali spuntano iniziare già a partire il giorno 2 (A, bar = 100 micron) e un aumento nei seguenti 2 - 3 giorni (B, C, bar = 100 micron). Il segmento è stato rimosso il giorno 4 (D, bar = 500 micron). ent &quot;&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/52965/52965fig2.jpg" /> Figura 2. endoteliali fenotipi cellulari. Le cellule attaccate visualizzano le apparenze a forma di fuso e di ciottoli simile (A, bar = 100 micron), la fluorescenza doppio positivo di Dil-ac-LDL e Ulex -Lectin (BE, bar = 100 micron). Nel frattempo, piastrine molecola di adesione delle cellule endoteliali 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-caderina, eNOS sono risultati positivi in&gt; 95% delle cellule dopo il secondo passaggio (FI, bar = 100 micron) La maggior parte delle cellule sono stati negativi per Calponin colorazione, che è un marker delle cellule muscolari lisce (J, bar = 100 micron).

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Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K Views.  Wayne State University. The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

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Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Ricerca

Neuroscienze

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Biologia

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Medicina

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo scheletrico

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

Isolamento delle cellule endoteliali polmonari primarie di topo

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunologia e infezioni

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

L&#39;isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolamento di cellule di topo coronarica endoteliali

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Isolamento e cultura delle cellule endoteliali aortiche primarie dai suini in miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...