La terapia di educatore delle cellule staminali è stata sviluppata per trattare il diabete di tipo I e l'altra malattia autoimmune. Questo metodo è stato sviluppato per esplorare il meccanismo molecolare alla base della moderazione immunitaria della terapia con educatore delle cellule staminali attraverso esosomi rilasciati dal CB-SC. Questo protocollo fornisce indicazioni su come purificare gli esosomi da colture di cellule staminali del sangue del cordone ombelicale umano e determinare la loro modulazione immunitaria dei monociti.
A dimostrare la procedura sarà Wei Hu, dottorando, del mio laboratorio. Per cominciare, centrifuga il mezzo condizionato derivato dal CB-SC tre volte come descritto nel manoscritto testuale, raccogliendo il supernatante in un nuovo tubo conico da 50 millilitri dopo ogni centrifugazione. Dopo la terza centrifugazione, filtrare il supernatante ottenuto con un filtro a 0,22 microlitri e trasferire 15 millilitri di supporti in ogni unità filtrante centrifuga da 10 kilodalton.
Centrifughe a 4.000 x g per 30 minuti per isolare i mezzi esosomi concentrati. Trasferire gli esosomi concentrati in un tubo ultracentrifugo. Quindi pellet gli esosomi a 100.000 x g per 80 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi scartare il supernatante e rimescolare gli esosomi pelletati in 10 millilitri di PBS. Eseguire un'ultracentrifugazione finale per raccogliere il pellet di esome e riprenosirlo in 200 microlitri di PBS. Aggiungere 30 milioni di PBBC umani a un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Resuspend le cellule in 300 microlitri di PBS freddo e aggiungere 60 microlitri di microperline CD14. Mescolare bene e incubare le cellule sul ghiaccio per 15 minuti. Aggiungere altri sei millilitri di PBS freddo e centrifuga a 300 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi rimospendare le cellule pellettate in 500 microlitri di tampone di funzionamento a freddo. Posizionare la colonna di separazione nel separatore del magnete e lavarla tre volte con due millilitri di tampone di funzionamento a freddo. Trasferire le celle rimorsi nella colonna di separazione e lasciarle passare.
Ancora una volta, lavare la colonna tre volte con due millilitri di tampone di corsa per lavaggio. Quindi sollevare la colonna dal separatore del magnete e posizionarla su un tubo di centrifuga da 15 millilitri sul ghiaccio. Elute le cellule positive CD14 con due millilitri di tampone funzionante a freddo e centrifugate a 300 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare le cellule.
Resuspend il pellet in due millilitri di mezzo siero definito chimica fredda e trasferire 50 microlitri di esso in un tubo da 1,5 millilitri. Macchiare le cellule ottenute con 10 microlitri di anticorpi monoclonali CD14 anti-umani coniugati con Krome Orange per 20 minuti. Aggiungere un millilitro di PBS e centrifugare a 300 x g per 10 minuti per pellettare le cellule.
Resuspend il pellet cellulare in 200 microlitri di PBS e trasferirlo in un tubo da cinque millilitri. Determinare la purezza dei CD14+monociti in base alla citometria a flusso. Sementi un milione dei monociti purificati ottenuti in una coltura tissutale hanno trattato una piastra di sei pozzi e incubato per due ore a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica.
Dopo l'incubazione scartare il supernatante e aggiungere delicatamente due millilitri di 37 gradi di mezzo di coltura senza siero definito chimico pre-riscaldato, quindi aggiungere 80 microgrammi degli esosomi derivati dal CB-SC alla coltura di monociti nella piastra a sei pozzi con un volume totale di due millilitri. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per tre o quattro giorni. Quindi immagini la morfologia cellulare usando un microscopio invertito con ingrandimento 200X.
Aggiungere un millilitro di tampone di dissociazione cellulare a base di PBS per staccare le cellule con pipettando su e giù e raccogliere le cellule rimanenti con un raschietto cellulare. Raccogliere le cellule centrifugandole a 1.690 x g per cinque minuti e rimornerne in 200 microlitri di PBS. Aggiungere cinque microlitri di blocco FC per bloccare il legame non specifico, quindi aggiungere gli anticorpi.
Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere un millilitro di PBS alle cellule incubate e centrifugarle a 300 x g per 10 minuti. Resuspend il pellet in 200 microlitri di PBS e aggiungere cinque microlitri di ioduro di propidio per campione.
Trasferire le celle in un nuovo tubo di flusso a cinque millilitri ed eseguire la citometria di flusso per valutare i livelli di espressione CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 e CD209. Il fenotipo e la purezza dei CB-SC sono stati esaminati per citometria a flusso con marcatori associati al CB-SC. L'analisi ha mostrato alti livelli di espressione CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 e galectin 9, ma non è stata osservata alcuna espressione di CD34.
L'analisi della citometria a flusso conferma anche l'espressione di marcatori specifici dell'esoma, CD9, CD 81 e CD63 su esosomi derivati da CB-SC. La morfologia delle dimensioni degli esosomi era caratterizzata da TEM e la distribuzione delle dimensioni era determinata da DLS. La macchia occidentale dimostra ulteriormente l'espressione del marcatore associato all'esoma Alix senza espressione del marcatore associato al ER, la calnexina.
L'interazione diretta del CB-SC-Exo con pbmc con etichetta Dio è stata osservata utilizzando la microscopia a fluorescenza. Per definire meglio quale popolazione cellulare interagiva con il quadrante etichettato CB-SC-Exo, diversi compartimenti cellulari sono stati recintato con marcatori specifici delle celle, come CD3 per le celle T, CD11C per le cellule dendritiche mieloidi, CD14 per i monociti, CD19 per le celle B e CD56 per le celle NK. I monociti sono stati presi di mira principalmente dagli esosomi derivati dal CB-SC in quanto mostravano intensità di fluorescenza mediana più elevate di quelle di altre cellule immunitarie.
I monociti trattati con esosoma si differenziarono con successo in morfologie simili a mandrino. C'è stato un aumento della regolamentazione nel livello di marcatori associati M2, come CD163, CD206 e CD209 dopo il trattamento con esosomi derivati da CB-SC. Il confronto fenotipico tra i macrofagi M2 convenzionali e i macrofagi M2 indotti dall'esoma CB-SC non ha mostrato differenze significative.
Il passaggio chiave di questo protocollo è l'aggiunta di esosomi derivati da CB-SC al monocita di coltura in piastra a sei pozzi e incubarlo per tre o quattro giorni, che era necessario per la differenziazione della cellula ad altri macrofagi di tipo 2 con morfologia simile al mandrino. Successivamente, esploreremo i componenti molecolari all'interno degli esosomi derivati dal CB-SC che hanno contribuito all'induzione della differenziazione del monocita nei macrofagi di tipo 2.
