تم تطوير العلاج المربي الخلايا الجذعية لعلاج مرض السكري من النوع الأول وأمراض المناعة الذاتية الأخرى. وقد تم تطوير هذه الطريقة لاستكشاف آلية جزيء الكامنة في الاعتدال المناعي لعلاج مربي الخلايا الجذعية من خلال CB-SC صدر اكسوزومات. يقدم هذا البروتوكول إرشادات حول كيفية تنقية الاكسوس من الخلايا الجذعية لدم الحبل السري البشري وتحديد تحويرها المناعي للوحديات.
إثبات الإجراء سيكون وي هو، طالب دكتوراه، من مختبري. للبدء، الطرد المركزي المشتقة CB-SC المتوسطة مشروطة ثلاث مرات كما هو موضح في مخطوطة النص، وجمع supernatant في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر بعد كل طرد مركزي. بعد الطرد المركزي الثالث، تصفية السوبر التي تم الحصول عليها مع مرشح ميكرولتر 0.22 ونقل 15 ملليلتر من وسائل الإعلام إلى كل وحدة تصفية الطرد المركزي 10 كيلودالون.
أجهزة الطرد المركزي في 4، 000 × ز لمدة 30 دقيقة لعزل وسائط إكسوسوم المركزة. نقل الاكسوسات المركزة إلى أنبوب الطرد الفائق. ثم بيليه اكسوزومات في 100، 000 س ز لمدة 80 دقيقة في أربع درجات مئوية.
ثم تجاهل supernatant وإعادة فرض على exosomes بيليه في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أداء الrifugugation النهائي لجمع بيليه exome و resuspend في 200 microliters من برنامج تلفزيوني. إضافة 30 مليون PBMCs الإنسان إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
Resuspend الخلايا في 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني الباردة وإضافة 60 ميكرولترات من الميكروبات CD14. تخلط جيدا وتحتضن الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة. إضافة ستة ملليلترات إضافية من PBS الباردة والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
ثم إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من المخزن المؤقت الجري البارد. ضع عمود الفصل في فاصل المغناطيس واغسله ثلاث مرات مع ميليلترين من المخزن المؤقت البارد. نقل الخلايا التي تم تعليقها في عمود الفصل والسماح لهم بالمرور.
مرة أخرى، غسل العمود ثلاث مرات مع ملليلتر اثنين من تشغيل العازلة في غسل. ثم ارفع العمود من فاصل المغناطيس وضعه فوق أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر على الجليد. Elute الخلايا إيجابية CD14 مع ملليلترين من الباردة تشغيل العازلة وطاردة في 300 × ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية ل بيليه الخلايا.
Resuspend بيليه في مليلتر اثنين من مادة كيميائية باردة تعريف مصل المتوسطة ونقل 50 ميكرولترات منه في أنبوب 1.5 ملليلتر. وصمة عار الخلايا التي تم الحصول عليها مع 10 ميكرولترات من كروم أورانج مترافق المضادة للإنسان CD14 الأجسام المضادة أحادية النسيلة لمدة 20 دقيقة. إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقائق ل بيليه الخلايا.
إعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى أنبوب خمسة ملليلتر. تحديد نقاء CD14 + monocytes بواسطة تدفق الخلايا. بذور مليون من الخلايا أحادية المنقىة التي تم الحصول عليها في ثقافة الأنسجة معالجة ستة بئر لوحة واحتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد الحضانة التخلص من supernatant وإضافة بلطف ملليلتر من 37 درجة قبل الدافئة الكيميائية المحددة مصل خال من المتوسط الثقافة، ثم إضافة 80 ميكروغرام من الاكسوس المستمدة من CB-SC إلى ثقافة أحادية في لوحة ستة بئر مع حجم إجمالي قدره ملليلتر اثنين. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. ثم صورة مورفولوجيا الخلية باستخدام المجهر المقلوب في التكبير 200X.
إضافة ملليلتر واحد من الخلية القائمة على PBS العازلة لفصل الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا والحصاد الخلايا المتبقية مع مكشطة الخلية. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1، 690 س ز لمدة خمس دقائق وإعادة تعليقها في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. إضافة خمسة microliters من مانع FC لمنع الربط غير محددة، ثم إضافة الأجسام المضادة.
احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا المحتضنة والطرد المركزي لهم في 300 × ز لمدة 10 دقائق. Resuspend بيليه في 200 microliters من برنامج تلفزيوني وإضافة خمسة microliters من يوديد بروبديسيوم لكل عينة.
نقل الخلايا إلى أنبوب تدفق 5 ملليلتر جديدة وتنفيذ عملية استئصال الخلايا تدفق لتقييم مستويات CD14، CD80، CD86، CD163، CD206، وD209 التعبير. تم فحص النمط الظاهري ونقاء CB-SCs بواسطة قياس التدفق بالجراحة مع علامات CB-SC المرتبطة. وأظهر التحليل مستويات عالية من CD45، OCT3/4، SOX2، CD270 وgalectin 9 التعبير ولكن لم يلاحظ أي تعبير من CD34.
تحليل تدفق قياس الاستئصال يؤكد أيضا التعبير عن علامات محددة exome، CD9، CD 81، وD63 على اكسوزومات مشتقة من CB-SC. وقد تميز حجم مورفولوجيا الاحزوم بواسطة TEM وتم تحديد توزيع الحجم من قبل DLS. وصمة عار الغربية تثبت كذلك التعبير عن علامة exome المرتبطة Alix دون التعبير عن علامة ER المرتبطة بها، كالينسين.
ولوحظ التفاعل المباشر بين ديو وعلامة CB-SC-Exo مع PBMC باستخدام المجهر الفلوري. لتحديد أفضل التي تفاعلت مع مجموعة الخلايا الاتصال الهاتفي المسمى CB-SC-Exo، تم بوابات مقصورات الخلايا المختلفة مع علامات الخلية المحددة، مثل CD3 لخلايا T، CD11C للخلايا التشعبية النخاعية، CD14 لـ أحادية الخلايا، CD19 لخلايا B، و CD56 لخلايا NK. تم استهداف الخلايا الأحادية في المقام الأول من قبل الإكسوسوم المشتقة من CB-SC لأنها أظهرت كثافة فلورية متوسطة أعلى من تلك الخلايا المناعية الأخرى.
تم تمييز الطاردات الأحادية المعالجة بنجاح إلى مورفولولوجيا تشبه المغزل. كان هناك رفع في مستوى علامات M2 المرتبطة، مثل CD163، CD206، وD209 بعد العلاج مع اكسوزومات مشتقة من CB-SC. لم تظهر مقارنة الظاهري بين الضامة M2 التقليدية و الضامة M2 الناجمة عن CB-SC أي اختلافات كبيرة.
الخطوة الرئيسية في هذا البروتوكول هي إضافة اكسوزومات مشتقة من CB-SC إلى أحادية الثقافة في لوحة سداسية البئر واحتضانها لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام ، والتي تحتاج إلى تمايز الخلية إلى الضامة من النوع 2 الأخرى مع مورفولوجيا تشبه المغزل. بعد ذلك ، نحن نذهب لاستكشاف مكونات الجزيء داخل اكسوزومات مشتقة من CB -SC التي ساهمت في تحريض تمايز أحادية في نوع 2 الضامة.
