Die Stem Cell Educator Therapie wurde entwickelt, um Typ-I-Diabetes und die andere Autoimmunerkrankung zu behandeln. Diese Methode wurde entwickelt, um den Molekülmechanismus zu erforschen, der der Immunmoderation der Stem Cell Educator Therapie durch CB-SC freigesetzte Exosomen zugrunde liegt. Dieses Protokoll bietet Anleitungen, wie Exosomen aus einer menschlichen Nabelschnurblutstammzellenkulturen gereinigt und ihre Immunmodulation von Monozyten bestimmt werden können.
Demonstriert wird das Verfahren von Wei Hu, einem Doktoranden, aus meinem Labor. Zunächst zentrifugieren Sie das von CB-SC abgeleitete konditionierte Medium dreimal, wie im Textmanuskript beschrieben, und sammeln Sie den Überstand nach jeder Zentrifugation in ein neues 50 Milliliter konisches Rohr. Filtern Sie nach der dritten Zentrifugation den erhaltenen Überstand mit einem 0,22-Mikroliter-Filter und übertragen Sie 15 Milliliter Medien auf jede 10 Kilodalton-Zentrifugalfiltereinheit.
Zentrifugen bei 4.000 x g für 30 Minuten, um die konzentrierten Exosomenmedien zu isolieren. Übertragen Sie die konzentrierten Exosomen in ein Ultrazentrifugenrohr. Dann pellet die Exosomen bei 100. 000 x g für 80 Minuten bei vier Grad Celsius.
Dann entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die pelletierten Exosomen in 10 Milliliter PBS wieder auf. Führen Sie eine abschließende Ultrazentrifugation durch, um das Exompellet zu sammeln und in 200 Mikroliter PBS wieder auszusetzen. Fügen Sie 30 Millionen menschliche PBMCs zu einem 15 Milliliter Rohr und Zentrifuge bei 300 x g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius hinzu.
Setzen Sie die Zellen in 300 Mikroliter kalten PBS aus und fügen Sie 60 Mikroliter CD14-Mikroperlen hinzu. Mischen Sie gut und inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 15 Minuten. Fügen Sie sechs weitere Milliliter kalte PBS und Zentrifuge bei 300 x g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius hinzu.
Dann setzen Sie die pelletierten Zellen in 500 Mikroliter kaltlaufenden Puffer wieder aus. Legen Sie die Trennsäule in den Magnetabscheider und waschen Sie sie dreimal mit zwei Millilitern Kaltlaufpuffer. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in die Trennspalte, und lassen Sie sie passieren.
Waschen Sie die Säule erneut dreimal mit zwei Millilitern Laufpuffer pro Wäsche. Heben Sie dann die Säule aus dem Magnetabscheider und legen Sie sie über ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr auf Eis. Elute die CD14-positiven Zellen mit zwei Milliliterkaltlaufpuffer und Zentrifugieren bei 300 x g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Zellen zu pellet.
Das Pellet in zwei Milliliterkaltchemikalien-Definiertem Serummedium wieder aufhängen und 50 Mikroliter davon in ein 1,5-Milliliter-Rohr geben. Färben Sie die erhaltenen Zellen mit 10 Mikrolitern Von Krome Orange-konjugierten antihumanen CD14 monoklonalen Antikörpern für 20 Minuten. Fügen Sie einen Milliliter PBS und Zentrifuge bei 300 x g für 10 Minuten, um die Zellen zu pellet.
Setzen Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter PBS wieder auf und übertragen Sie es in ein Fünf-Milliliter-Rohr. Bestimmen Sie die Reinheit von CD14+Monozyten durch Durchflusszytometrie. Samen eine Million der erhaltenen gereinigten Monozyten in einer Gewebekultur behandelt sechs-Well-Platte und inkubieren für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter 5%Kohlendioxid.
Nach der Inkubation entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter 37 Grad vorgewärmtes chemisch definiertes serumfreies Kulturmedium hinzu, und fügen Sie dann 80 Mikrogramm der CB-SC-abgeleiteten Exosomen in die Monozytenkultur in der Sechs-Well-Platte mit einem Gesamtvolumen von zwei Millilitern hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid für drei bis vier Tage. Dann stellen Sie die Zellmorphologie mit einem invertierten Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung ab.
Fügen Sie einen Milliliter PBS-basierten Zelldissoziationspuffer hinzu, um die Zellen zu lösen, indem Sie nach oben und unten pfeifen und die verbleibenden Zellen mit einem Zellschaber ernten. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 1, 690 x g für fünf Minuten und setzen Sie sie in 200 Mikroliter PBS wieder auf. Fügen Sie fünf Mikroliter FC-Blocker hinzu, um die unspezifische Bindung zu blockieren, und fügen Sie dann die Antikörper hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Fügen Sie den inkubierten Zellen einen Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 300 x g. Setzen Sie das Pellet in 200 Mikroliter PBS wieder auf und fügen Sie fünf Mikroliter Propidiumjodid pro Probe hinzu.
Übertragen Sie die Zellen in ein neues Fünf-Milliliter-Durchflussrohr und führen Sie die Durchflusszytometrie durch, um die Ebenen der EXPRESSION CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 und CD209 auszuwerten. Der Phänotyp und die Reinheit von CB-SCs wurden durch Durchflusszytometrie mit CB-SC-assoziierten Markern untersucht. Die Analyse zeigte hohe Konzentrationen von CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 und Galectin 9 Expression, aber es wurde keine Expression von CD34 beobachtet.
Die Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt auch die Expression von exomspezifischen Markern, CD9, CD 81 und CD63 auf CB-SC-abgeleiteten Exosomen. Die Größenmorphologie der Exosomen wurde durch TEM charakterisiert und die Größenverteilung wurde durch DLS bestimmt. Western Blot beweisen weiter die Expression der Exom-assoziierten Marker Alix ohne Expression des ER-assoziierten Markers, Calnexin.
Die direkte Wechselwirkung von Dio-labeled CB-SC-Exo mit PBMC wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Um besser zu definieren, welche Zellpopulation mit dem Zifferblatt CB-SC-Exo interagierte, wurden verschiedene Zellkompartimente mit zellspezifischen Markern wie CD3 für T-Zellen, CD11C für myeloische dendritische Zellen, CD14 für Monozyten, CD19 für B-Zellen und CD56 für NK-Zellen abgegrenzt. Monozyten wurden in erster Linie von den CB-SC-abgeleiteten Exosomen ins Visier genommen, da sie höhere mediane Fluoreszenzintensitäten aufwiesen als andere Immunzellen.
Die exosomebehandelten Monozyten differenzierten sich erfolgreich in spindelartige Morphologien. Nach der Behandlung mit CB-SC-abgeleiteten Exosomen gab es eine Upregulation in der Anzahl der M2-assoziierten Marker, wie CD163, CD206 und CD209. Der phänotypische Vergleich zwischen konventionellen M2-Makrophagen und den CB-SC-Exom-induzierten M2-Makrophagen zeigte keine signifikanten Unterschiede.
Der schlüsselfertige Schritt in diesem Protokoll besteht darin, CB-SC-abgeleitete Exosomen in sechs Bohrplatten zur Monozytenderung hinzuzufügen und für drei bis vier Tage zu inkubieren, was zur Differenzierung der Zelle zu anderen Typ-2-Makrophagen mit spindelähnlicher Morphologie erforderlich war. Als nächstes werden wir die Molekülkomponenten innerhalb von CB-SC-abgeleiteten Exosomen untersuchen, die zur Induktion der Differenzierung von Monozyten in Typ-2-Makrophagen beigetragen haben.
