Qui descriviamo un protocollo che utilizza immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzazione per determinare la distribuzione della proteina sinaptica rispetto a una proteina di riferimento. Il nostro metodo elude la variabilità intrinseca delle macchie di immunofluorescenza utilizzando un rapporto piuttosto che livelli assoluti di fluorescenza. Inoltre con questo metodo è possibile analizzare l'eterogeneità della distribuzione proteica su diversi livelli.
Dalle fette cerebrali intere alle regioni cerebrali fino a sub regioni come i diversi strati dell'ippocampo. Questa tecnica può essere adattata per determinare la distribuzione proteica in diversi tessuti diversi dal cervello e dai sistemi modello diversi dai topi. Inizia lavando il cervello del topo precedentemente isolato e fisso come descritto nel manoscritto.
Quindi trasferire il cervello in un tubo di reazione da 15 millilitri con 30%saccarosio 0,1 PB molare. Per crio proteggere il cervello incubarlo a 4 gradi Celsius per 48 ore o fino a quando non affonda. Successivamente usa una lama affilata per tagliare il cervello protetto dal crio a seconda dell'area di interesse. Quindi posizionare il cervello in uno stampo criogenico e aggiungere optimal cutting temperature compound per incorporarlo assicurandosi di evitare bolle e orientare correttamente il cervello in modo da avere un piano coronale di taglio.
Posizionare lo stampo crio nel congelatore meno 80 gradi Celsius fino a quando non è congelato solido. Montare il tessuto congelato sul microtomo crio e attendere almeno 15 minuti prima della sezione per equilibrarlo alla temperatura del microtomo. Inizia a tagliare il cervello in fette coronali spesse 25 micrometri.
Utilizzare un gancio di vetro allo Strumento di personalizzazione di Office della prima fetta con attenzione senza toccare il tessuto cerebrale. L'OCT si atterrà al gancio di vetro. Usa il gancio di vetro per trasferire la fetta cerebrale nel primo pozzo.
Raccogliere tre fette adiacenti per pozzo in una piastra di 24 po 'riempita con 0,1 PB molare. Conservare le fette a quattro gradi celsius fino alla colorazione per un massimo di due settimane. Per preparare le fette per la colorazione immuno utilizzare una pipetta di plastica per rimuovere la soluzione PB da un pozzo senza disegnare le fette cerebrali. Quindi utilizzare una pipetta da 1000 micro litri per aggiungere 250 microlitri di PB fresco per lavarli di OCT in eccesso.
Ripetere questo lavaggio per ogni pozzo al momento per evitare di asciugare le fette. Quindi, utilizzare una pipetta di plastica per rimuovere la soluzione PB dal primo pozzo. Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per aggiungere 250 microlitri di tampone di blocco per pozzo che funzionano bene di nuovo.
Incubare la piastra a temperatura ambiente su uno shaker per tre ore. Durante l'incubazione aggiungere 250 microlitri di tampone anticorpale per pozzo a un tubo di reazione. Quindi utilizzare una pipetta da 2 microliter per aggiungere la quantità appropriata di anticorpo che la tubazione direttamente nella soluzione e pipettare delicatamente su e giù più volte per mescolare.
Quindi vortice questo anticorpo diluito per incerta corretta miscelazione. Lavorando bene rimuovendo bene il tampone di blocco con una pipetta di plastica e aggiungere 250 microlitri di soluzione anticorpale primaria per pozzo. Incubare il piatto su uno shaker a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno seguente rimuovere la soluzione anticorpale con una pipetta di plastica. Lavare le fette con 300 microlitri di tampone di lavaggio uno per bene tre volte dieci minuti ciascuno lavare su uno shaker a temperatura ambiente. Durante il lavaggio, lavorando al buio, diluire il fluoro per un paio di secondi anticorpi in un tubo di reazione nello stesso modo precedentemente fatto con l'anticorpo primario.
Dopo il lavaggio completato rimuovere il tampone di lavaggio con una pipetta di plastica e aggiungere 250 microlitri di soluzione anticorpale secondaria per pozzo. Incubare al buio a temperatura ambiente per 90 minuti. Dopo l'incubazione completata rimuovere la soluzione anticorpale con una pipetta di plastica.
Lavare le sezioni tre volte con tampone di lavaggio due allo stesso modo del tampone di lavaggio uno. Durante questo lavaggio diluire la macchia DAPI in 0,1 PB molare per ottenere una concentrazione da uno a 2000. Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio dalla piastra aggiungere 250 microlitri di soluzione DAPI e incubare a temperatura ambiente sullo shaker per 5 minuti.
Dopo aver rimosso la soluzione DAPI con una pipetta di plastica utilizzare un pipetto da 1000 microlitri per aggiungere 500 microlitri di 0,1 PB molare per pozzo. Posizionare uno scivolo al microscopio sotto uno stereoscopio. Utilizzare un pennello fine per aggiungere tre gocce separate di 0,1 PB molare sullo scivolo.
Utilizzando il pennello posizionare una fetta per goccia sulla diapositiva, quindi appiattire e orientare le fette. Dopo che tutte le fette sono state posizionate correttamente utilizzare un tessuto di carta per rimuovere il PB in eccesso e asciugare con cura senza asciugare completamente le fette. Quindi aggiungere 80 microlitri di mezzo di incorporamento sulla diapositiva e coprirlo con cura con un foglietto di copertura per incorporare le fette cerebrali.
Coprire le diapositive per evitare l'esposizione alla luce e lasciarle asciugare nella cappa dei fumi per una o due ore e quindi conservarle in una scatola scorrevole al microscopio a quattro gradi Celsius fino a quando non sono pronte per la microscopia confocale. Dopo aver acquisito tessuti virtuali di tutta la fetta cerebrale per diversi canali come descritto nel manoscritto caricare tutti i singoli canali o un'immagine in FIJI facendo clic su file e quindi aprire. Quindi utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per delineare un emisfero nel canale DAPI.
Fare clic sulla modifica, quindi selezionare, quindi creare una maschera per creare una maschera dell'area selezionata. Quindi fare clic sull'analisi e quindi misurare le particelle per determinare l'intensità media della fluorescenza per i singoli canali. Assicurarsi di selezionare singoli canali per determinare i valori medi di intensità della fluorescenza per ogni canale.
Successivamente, copiare l'intensità di fluorescenza media per i singoli canali in un foglio di calcolo. Per determinare l'intensità media della fluorescenza per i singoli canali in un'area di interesse delineare l'area con lo strumento di selezione a mano libera. Dopo la colorazione con DAPI che macchia le sezioni cerebrali dei nuclei hanno un modello di punctato e le regioni ad alta densità cellulare sono più luminose delle regioni a bassa densità cellulare.
La colorazione con l'anticorpo Mover ha rivelato una distribuzione eterogenea con aree sensibili luminose e aree dimmer in tutto il cervello dove come Synaptophysin ha rivelato una distribuzione più omogenea. Una sovrapposizione di immagini ha mostrato la distribuzione differenziale della fluorescenza rossa che indica che la proteina Mover ha confrontato la fluorescenza verde che indica synaptophysin. Dopo l'analisi di quantificazione sono stati determinati valori medi di intensità di fluorescenza per diversi canali attraverso gli emisferi e attraverso le aree di interesse sia per Mover che per Synaptophysin.
I rapporti tra i valori di fluorescenza del mover e i valori di fluorescenza synaptophysin mostrano la distribuzione eterogenea di Mover con aree di alti e bassi livelli di Mover rispetto alle vescicole sinaptiche. L'abbondanza relativa di Mover il rapporto in un'area di interesse rispetto a quella dell'emisfero e tradotta in una percentuale ha mostrato quanto Mover è presente in un'area di interesse rispetto alla media. L'abbondanza relativa di Mover è stata determinata per diversi strati nei sottocampi dell'ippocampo.
Le tre regioni di interesse sono quantificate confrontando il rapporto tra i rispettivi strati e il rapporto dell'emisfero corrispondente. Questa procedura può essere facilmente adattata e combinata con diverse tecniche di imaging come la microscopia a super risoluzione per determinare ulteriormente la distribuzione subcellulare della proteina di interesse. Questa tecnica può anche essere applicata a diversi sistemi modello come animali geneticamente modificati o trattati con farmaci.
Ciò può consentire un approccio comparativo in diverse condizioni sperimentali o anche specie.
