Questo protocollo ti mostrerà come macchiare le microglia, eseguire analisi quantitative di densità e morfologia, nonché quantificare l'infiltrazione di macrofagi nel cervello. Questa tecnica consente al ricercatore di misurare i cambiamenti nella distribuzione e nella morfologia delle microglia in modo quantitativo e di differenziare le microglia dai macrofagi infiltrati Questo protocollo di analisi può essere facilmente applicato ad altri modelli animali per misurare i cambiamenti nella distribuzione microgliale e nella morfologia in cui sono disponibili anticorpi anti-IBA1 e anti-TMEM119. Si consiglia vivamente di condurre il conteggio delle cellule e le tracce accecate alla condizione sperimentale e di essere coerenti nel modo in cui viene eseguita questa procedura.
Per iniziare questa procedura, aprire un programma di elaborazione delle immagini come Fiji o ImageJ in cui è installato il plug-in di distanza adiacente più vicino. Aprire l'immagine 20X se la scala è contenuta nei metadati del file e non impostata automaticamente dai metadati. Sulla barra dei menu selezionare Analizza, Imposta scala e quindi immettere le informazioni corrette.
Per impostare manualmente la scala in base a una scala impressa sull'immagine, selezionare lo strumento Linea retta. Posizionare il cursore sul bordo della scala e mentre si preme MAIUSC, disegnare una linea il più vicino possibile alla scala dell'immagine. Selezionate Analizza (Analyze), Imposta scala (Set Scale).
Verrà visualizzata una finestra che metterà la distanza e l'unità di lunghezza note corrette per determinare l'unità di lunghezza del pixel e farà clic su OK. Selezionare Quindi Immagine, Colore, Crea composito per creare un'immagine composita di tutti i canali. Sulla barra dei menu selezionare Analizza, Imposta misure. Controlla area, centroide e perimetro.
Nel menu a discesa Reindirizza a selezionare il file Apri e quindi fare clic su OK. Passare a Immagine, Colore, Strumento Canale per aprire lo strumento Canale. Utilizzate lo strumento Selezione a mano libera per disegnare un perimetro approssimativo attorno alla regione di interesse. Fare doppio clic sullo strumento Ovale sulla barra degli strumenti per abilitare lo strumento Pennello di selezione.
Verificare che la casella Abilita pennello selezione sia selezionata e fare clic su OK. Utilizzando il pennello di selezione, regolare il perimetro per adattarlo al meglio all'area di interesse, quindi premere T sulla tastiera in tutta l'area per freccia Y manager. Selezionare Analizza, Misura o Premi il tasto M e verrà visualizzata la finestra Risultati. Copiare e incollare i risultati in una scheda tecnica e salvare le informazioni relative all'area.
Dopo aver copiato l'area dell'area di interesse, potete basare le informazioni dalla finestra Risultati facendo clic su di essa e premendo il tasto Backspace. Selezionare la finestra Gestione ROI, selezionare traccia ROI e modificare il nome in modo che corrisponda al nome dell'immagine premendo Rinomina. Fare clic su OK, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sul nuovo nome di Traccia ROI e salvare.
Fare doppio clic sull'utensile Pennello nella barra degli strumenti. Selezionare il colore nero e la dimensione Pennello 10. Assicuratevi che l'opzione Disegno sulla sovrapposizione sia deselezionata.
Nel canale TMEM119 posizionare con cura un punto nero al centro del soma per ogni microglia positiva TMEM119. Posizionare un punto bianco al centro delle celle che non sono positive per TMEM119. Ripetere la stessa procedura per tutte le celle contenute nell'area di interesse.
Quindi, selezionare Immagine, Colore, Canale diviso, verrà visualizzata una finestra per ogni canale. Identificare il canale con le annotazioni punto e chiudere le altre due finestre. Per reindirizzare la nuova immagine del canale diviso, passare a Analizza, Imposta misure.
Nel menu a discesa Reindirizza a selezionare l'immagine di dividi canale e fare clic su OK. Quindi selezionare Immagine, Tipo, otto bit. Passare a Regolazione immagine e selezionare Soglia. Regolare i dispositivi di scorrimento fino a sinistra in entrambe le barre.
Questo lascerà solo i punti neri che ora appariranno bianchi. Selezionare l'area di interesse nella finestra Gestione ROI. Nella barra dei menu selezionare Analizza, Analizza particella.
Nella casella di testo Dimensioni immettere da uno a 20. La casella per le unità Pixel deve rimanere deselezionata mentre la casella per Risultati di visualizzazione, Riepiloga e Aggiungi a Manager deve essere selezionata. Fare clic su OK per visualizzare la finestra Riepilogo che fornirà il numero di punti.
Copiare e incollare queste informazioni nella scheda tecnica. Selezionare quindi nnd plug-in per visualizzare la finestra NND. Ogni numero rappresenta la distanza che ogni microglia ha verso le microglia vicine più vicine.
Copiare e incollare tutte queste informazioni nella scheda tecnica. Tornare alla finestra Soglia e regolare il dispositivo di scorrimento superiore fino a destra, che lascerà visibili tutti i punti bianchi, ora appaiono bianchi. Selezionate Analizza (Analyze), Analizza particella (Analyze Particle) per visualizzare la finestra a comparsa Analizza particelle (Analyze Particles).
Fare clic su OK per visualizzare la finestra Riepilogo che fornisce il numero di punti. Copiare e incollare queste informazioni nella scheda tecnica. Vai a ROI Manager e seleziona tutti i punti.
Quindi fai clic con il pulsante destro del mouse e salva con il nome dell'immagine. Ciò consentirà il salvataggio di tutti i punti in un file ZIP. Per prima cosa, apri i file di immagine 4DX.
Apparirà una finestra pop-up che chiede se le immagini devono essere aperte in una pila. Fare clic su OK. Selezionare Quindi Immagine, Stack, ZProject per aprire la finestra Proiezione Z. Includere tutte le sezioni dalla prima all'ultima sezione.
Assicurate che l'intensità massima sia selezionata in Tipo proiezione (Projection Type) e fate clic su OK. Fare clic sulla nuova finestra contenente ZProject. Selezionare Immagine, Colori, Dividi canali e condurre le tracce sulle immagini del canale IBA1. Nella barra dei menu selezionare Analizza, Imposta misure.
Controlla l'area, il centroide e il perimetro. Nel menu a discesa Reindirizza a selezionare il file aperto e fare clic su OK. Per impostare manualmente la scala in base a una scala impressa sull'immagine, selezionare lo strumento Linea retta. Posizionare il cursore sul bordo della scala e mentre si preme MAIUSC, disegnare una linea il più vicino possibile alla scala dell'immagine.
Selezionate Analizza (Analyze), Imposta scala (Set Scale). Apparirà una finestra. Immettere la distanza e l'unità di lunghezza note corrette per determinare i pixel per unità di lunghezza e fare clic su OK. Per misurare le dimensioni del soma nel canale IBA1, disegnate un perimetro approssimativo del soma con lo strumento Selezione a mano libera.
Fare doppio clic sullo strumento Ovale sulla barra degli strumenti per abilitare lo strumento Pennello selezione. Verificare che la casella Abilita pennello selezione sia selezionata e fare clic su OK. Utilizzando il pennello selezione, regolate la traccia per adattarla al meglio al soma. Lo zoom avanti consentirà la precisione durante questo passaggio.
Quindi, premere il tasto T per aggiungere la traccia soma a ROI Manager. Selezionare Analizza, Misura o premere M per visualizzare i risultati. Copiare e incollare questi risultati in una scheda tecnica.
Passare alla finestra Gestione ROI, selezionare l'area di interesse e modificare il nome in modo che corrisponda al nome dell'immagine premendo Rinomina. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area di interesse rinominata e scegliere Salva. Assicurarsi che il nome specifichi che la traccia è per soma e salvare il file.
Per misurare l'area di arborizzazione nel canale IBA1, selezionare innanzitutto lo strumento Selezione poligono. Fare clic sull'estremità del processo microgliale con lo strumento per avviare la forma poligonale. Gira intorno alla microglia cliccando sulle punte di ogni estremità del processo per formare un poligono che meglio rappresenta l'area coperta dalle arborizzazioni microgliali.
Al termine del poligono, fare clic sul punto di partenza per chiuderlo. Quindi, premere il tasto T per aggiungere la traccia a ROI Manager. Selezionare Analizza, Misura o premere M per aggiungere i dati alla finestra Risultati.
Copiare e incollare questi dati nella scheda tecnica. Per salvare le informazioni relative all'area di arborizzazione, passare alla finestra Gestione ROI, selezionare l'area di interesse e modificare il nome in modo che corrisponda al nome dell'immagine premendo Rinomina. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area di interesse rinominata e scegliere Salva.
Assicurarsi che il nome specifichi che la traccia è per l'arborizzazione e salvare il file. Questo studio ha descritto il flusso di lavoro passo-passo per la co-colorazione immunofluorescente di IBA1 e TMEM119 e per l'analisi della densità microgliale, della distribuzione e della morfologia, nonché dell'infiltrazione di cellule mieloidi periferiche nel tessuto cerebrale del topo. La microscopia a fluorescenza viene utilizzata per l'immagine della co-etichettatura delle microglia usando IBA1 e TMEM119 nella sezione coronale dell'ippocampo dorsale con ingrandimento 20X.
Una colorazione di successo rivela i corpi cellulari microgliali e i loro processi fini. La colorazione consente la determinazione della densità e della distribuzione microgliale e l'identificazione di ammassi microgliali e macrofagi infiltrarsi. La microscopia confocale viene utilizzata per l'immagine della procedura di tracciamento dell'arborizzazione microgliale graduale con ingrandimento 40X.
Questi risultati rappresentativi mostrano microglia positiva IBA1 e TMEM119, nonché un esempio di tracciamento del corpo cellulare. È importante essere coerenti nel conteggio delle cellule e prestare attenzione a entrambi i segnali di IBA1 e TMEM119. Questa tecnica consente al ricercatore di identificare le regioni del cervello che sono interessate da un particolare stimolo che può quindi essere studiato più approfonditamente con tecniche complementari.
