Ici nous décrivons un protocole employant l’immunofluorescence, la microscopie confoccale, et l’analyse basée sur ordinateur pour déterminer la distribution de la protéine synaptique par rapport à une protéine de référence. Notre méthode contourne la variabilité inhérente des taches d’immunofluorescence en utilisant un ratio plutôt que des niveaux absolus de fluorescence. En outre, avec cette méthode, vous pouvez analyser l’hétérogénéité de la distribution des protéines à différents niveaux.
Des tranches entières du cerveau aux régions du cerveau, en en plus des sous-régions comme les différentes couches de l’hippocampe. Cette technique peut être adaptée pour déterminer la distribution des protéines dans différents tissus autres que le cerveau et les systèmes modèles autres que les souris. Commencez par laver le cerveau de souris précédemment isolé et fixe tel que décrit dans le manuscrit.
Puis transférer le cerveau à un tube de réaction de 15 millilitres avec 30% saccharose 0,1 molar PB. Pour cryo protéger le cerveau l’incuber à 4 degrés Celsius pendant 48 heures ou jusqu’à ce qu’il coule. Après cela, utilisez une lame tranchante pour couper le cerveau cryo protégé en fonction de la zone d’intérêt. Ensuite, placez le cerveau dans un moule cryo et ajouter optimal composé de température de coupe pour l’intégrer en s’assurant d’éviter les bulles et orienter le cerveau correctement afin d’avoir un plan coronal de coupe.
Placez le moule cryo dans le congélateur de moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit gelé solide. Monter le tissu congelé sur la microtome cryo et attendre au moins 15 minutes avant la section pour l’équilibrer à la température de microtome. Commencez à couper le cerveau en 25 micromètres de tranches coronal épaisses.
Utilisez soigneusement un crochet en verre à l’OCT de la première tranche sans toucher le tissu cérébral. L’OCT collera au crochet en verre. Utilisez le crochet en verre pour transférer la tranche du cerveau dans le premier puits.
Recueillir trois tranches adjacentes par puits dans une assiette de 24 puits remplie de 0,1 molaire PB. Conserver les tranches à quatre degrés Celsius jusqu’à coloration jusqu’à deux semaines. Pour préparer les tranches pour la coloration immuno utiliser un pipet en plastique pour enlever la solution PB d’un puits sans dessiner dans les tranches du cerveau. Ensuite, utilisez un pipet de 1000 micro litres pour ajouter 250 microlitres de PB frais pour les laver de l’excès d’OCT.
Répétez ce lavage pour chaque puits à la fois pour éviter de sécher les tranches. Ensuite, utilisez un tuyau en plastique pour enlever la solution PB du premier puits. Utilisez un pipet de 1000 microlitres pour ajouter 250 microlitres de tampon de blocage par puits qui fonctionne bien à nouveau.
Incuber la plaque à température ambiante sur un shaker pendant trois heures. Pendant l’incubation ajouter 250 microlitres de tampon anticorps par puits à un tube de réaction. Ensuite, utilisez un pipet de 2 microlitres pour ajouter la quantité appropriée d’anticorps pipetting directement dans la solution et doucement pipet de haut en bas à plusieurs reprises pour mélanger.
Puis vortex cet anticorps dilué pour ne pas assurer un bon mélange. Bien fonctionner en enlevant bien le tampon de blocage avec un tuyau en plastique et ajouter 250 microlitres de solution d’anticorps primaire par puits. Incuber la plaque sur un shaker à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, retirez la solution d’anticorps à l’avec un pipet en plastique. Laver les tranches avec 300 microlitres de tampon de lavage un par puits trois fois dix minutes chacun laver sur un shaker à température ambiante. Pendant le lavage, en travaillant dans l’obscurité, diluer le fluor pendant quelques secondes anticorps dans un tube de réaction de la même manière que précédemment fait avec l’anticorps primaire.
Après avoir terminé le lavage enlever le tampon de lavage avec un pipet en plastique et ajouter 250 microlitres de solution d’anticorps secondaire par puits. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 90 minutes. Après l’incubation terminée enlever la solution anticorps avec un pipet en plastique.
Lavez les sections trois fois avec le tampon de lavage deux de la même manière qu’avec le tampon de lavage un. Au cours de ce lavage diluer la tache DAPI dans 0,1 molaire PB pour atteindre une concentration d’un à 2000. Après avoir retiré le tampon de lavage de la plaque ajouter 250 microlitres de solution DAPI et incuber à température ambiante sur le shaker pendant 5 minutes.
Après avoir enlevé la solution DAPI avec un pipet en plastique utiliser un pipet de 1000 microlitres pour ajouter 500 microlitres de 0,1 molaire PB par puits. Placez une lame de microscope sous un stéréoscope. Utilisez une brosse fine pour ajouter trois gouttes distinctes de 0,1 molaire PB sur la lame.
À l’aide de la brosse, déposer une tranche par goutte sur la lame, puis aplatir et orienter les tranches. Après que toutes les tranches sont placées correctement utiliser un tissu de papier pour enlever l’excès de PB et sécher soigneusement sans sécher les tranches complètement. Ajouter ensuite 80 microlitres de milieu d’intégration sur la glissière et la couvrir soigneusement d’un glissement de couverture pour intégrer les tranches de cerveau.
Couvrez les glissières pour éviter l’exposition à la lumière et laissez-les sécher dans le capot des vapeurs pendant une à deux heures, puis rangez-les dans une boîte de diapositives au microscope à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la microscopie confoccale. Après avoir acquis des tissus virtuels de la tranche entière du cerveau pour différents canaux tels que décrits dans le manuscrit charger tous les canaux simples ou une image dans FIDJI en cliquant sur fichier, puis ouvrir. Utilisez ensuite l’outil de sélection des mains libres pour délimité un hémisphère dans le canal DAPI.
Cliquez sur modifier, puis sélectionner, puis créer un masque pour créer un masque de la région sélectionnée. Cliquez ensuite sur analyser puis mesurez les particules pour déterminer l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux simples. S’assurer de sélectionner des canaux simples pour déterminer les valeurs moyennes d’intensité de fluorescence pour chaque canal.
Après cela, copiez l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux simples dans une feuille de calcul. Déterminer l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux simples dans une zone d’intérêt délimité la zone avec l’outil de sélection des mains libres. Après coloration avec DAPI qui taches sections du cerveau noyaux ont un modèle punctate et les régions à haute densité cellulaire sont plus lumineux que les régions à faible densité cellulaire.
La coloration avec l’anticorps mover a indiqué la distribution hétérogène avec les secteurs chauds lumineux et les secteurs de gradateur dans tout le cerveau où synaptophysin a indiqué la distribution plus homogène. Une superposition d’images a montré la distribution différentielle de fluorescence rouge indiquant la protéine Mover comparé la fluorescence verte indiquant synaptophysine. Après analyse de quantification, les valeurs moyennes d’intensité de fluorescence pour différents canaux à travers les hémisphères et à travers les zones d’intérêt ont été déterminées pour Mover et Synaptophysin.
Les ratios des valeurs de fluorescence du déménageur par rapport aux valeurs de fluorescence synaptophysine montrent la distribution hétérogène de Mover avec des zones de niveaux de mover élevés et faibles par rapport aux vésicules synaptiques. L’abondance relative de Mover le rapport dans une zone d’intérêt par rapport à celle de l’hémisphère et traduit en un pourcentage a montré combien Mover est présent dans une zone d’intérêt par rapport à la moyenne. L’abondance relative de Mover a été déterminée pour différentes couches dans les sous-champs de l’hippocampe.
Les trois régions d’intérêt sont quantifiées en comparant le rapport entre les couches respectives et le rapport de l’hémisphère correspondant. Cette procédure peut facilement être adaptée et combinée avec différentes techniques d’imagerie telles que la microscopie à super résolution pour déterminer en outre la distribution sous cellulaire de la protéine d’intérêt. Cette technique peut également être appliquée à différents systèmes modèles tels que les animaux génétiquement modifiés ou traités par drogue.
Cela peut permettre une approche comparative entre différentes conditions expérimentales ou même des espèces.
