Questo metodo, CARIC, può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della post-trascrizione della ricreazione genica fornendo un censimento completo delle proteine leganti l'RNA. Il principale vantaggio del CARIC è la sua capacità di catturare proteine legate a vari tipi di RNA come mRNA e RNA non codificanti. Questo metodo può essere utilizzato in vari tipi e nell'organismo per studiare l'interazione della proteina RNA sul lavoro.
In primo luogo, coltura cellule HeLa in DMEM integrato a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di CO2 al cinque per cento. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, sostituire il mezzo di coltura su ogni piatto con 15 millilitri di mezzo fresco prebellito. Aggiungere 15 microlitri da 100 millimolari EU a ciascun piatto a una concentrazione finale di un millimolare.
Per campioni sperimentali e senza controllo UV aggiungere 7,5 microlitri da 100 millimolari quattro SU ad ogni piatto. Coprire i piatti con un foglio e coltura delle cellule per 16 ore utilizzando le condizioni precedenti. Successivamente, aggiungere la metà della quantità precedente di UE e/o quattro SU alle piastre appropriate e continuare a coltivare per altre due ore.
Per iniziare il cross-linking in vivo, rimuovere il mezzo di coltura e lavare ogni piatto tre volte con PBS utilizzando cinque millilitri di PBS per lavaggio. Rimuovere il PBS residuo il più possibile. Per il campione sperimentale e non quattro campioni di controllo SU, posizionare i piatti sul ghiaccio con il coperchio rimosso.
Utilizzare un cross-linker UV per irradiare le cellule con luce UV a 365 nanometri e a due jules per centimetro al quadrato. Per i campioni senza controllo UV, posizionare i piatti sul ghiaccio e proteggerli dalla luce. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di prelisi a ogni piatto.
Utilizzare un sollevatore di celle in gomma per raschiare le celle e raccogliere la sospensione di prelisi in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere il tampone di prelisi a un tubo contenente la sospensione da due stoviglie regolando il volume totale a sei millilitri. Quindi aggiungere un volume uguale di buffer di lisi R.
Passare il lysate cellulare attraverso una siringa con un ago stretto più volte fino a quando il lysate è chiaro e omogeneo. Incubare il lisato a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata per un'ora. Dopo questo diluire il lisato in 20 volumi di tampone di diluizione e dividerlo in 15 frazioni di millilitro in 15 tubi di nontrafiltrazione millilitro, taglio molecolare di 10 kilodalton.
Utilizzando un rotatore a secchio oscillante, ruotare i tubi a 4000 volte G e quattro gradi Celsius per circa 15 minuti fino a quando ogni frazione è concentrata in un volume inferiore a un millilitro. Aggiungere 14 millilitri di tampone di diluizione a ciascuna frazione di lysate concentrata e ripetere il processo di concentrazione. Quindi unire le frazioni e concentrarle in un volume di sei millilitri utilizzando il processo di concentrazione descritto in precedenza.
Preparare innanzitutto il mix di reazioni come delineato nel protocollo di testo. Aggiungere questa miscela di reazione ai sei millilitri di lysate pre-sgombrato e mescolare bene. Aggiungere 162,5 microlitri di reagente riducente e mescolare bene.
Incubare a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 800 giri/min per due ore. Dopo questo tempra la reazione aggiungendo cinque EDTA millimolare e incubando sullo shaker orbitale a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, dividere la miscela di reazione tra due tubi da 50 millilitri, ognuno contenente quattro volumi di metanolo preriffrato e incubare a -30 gradi Celsius per 30 minuti.
Centrifuga a 4000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Scartare il supernatante e aggiungere tra uno e due millilitri di metanolo pre-refrigerato al pellet. Pipetta su e giù per rompere il pellet assicurandosi che il pellet finisca completamente sospeso senza pezzi visibili.
Ripetere due volte il processo di centrifugazione e sospensione. Successivamente, estraggono con cura il metanolo residuo il più possibile assicurandosi di non disturbare il pellet. Aggiungere 10 millilitri di tampone di ricostituzione e pipetta su e giù per sciogliere il pellet.
Centrifuga a 4000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi trasferire il supernatante su un nuovo tubo assicurandosi di raccogliere 20 microlitri del campione per il controllo qualità. Trasferire il campione ripulito e ricostituito nelle perle di agarosio streptavidina preparate.
Incubare a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata durante la notte. Fai girare le perline a 4000 volte G per cinque minuti. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo assicurandosi di raccogliere 20 microlitri del campione per il controllo qualità.
Lavare le perline con 10 millilitri di tampone di lavaggio A.Incubate con rotazione delicata a 12 giri/min e a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi girare giù le perline a 4000 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e ripetere ancora una volta il processo di lavaggio e centrifugazione.
Ripetere questo processo di lavaggio per il buffer di lavaggio B e il buffer di lavaggio C come indicato nel protocollo di testo. Dopo questo, lavare le perline con 10 millilitri di tricloruro di tris millimolare. Fai girare le perline a 4000 volte G per cinque minuti.
Rimuovere il supernatante e dividere uniformemente le perline tra due tubi a microcentrifugo da 1,5. Per iniziare a eludere gli RRN catturati, aggiungere 400 microlitri di tampone di eluizione di biotina preparato a 400 microlitri di perline lavate e sistemate. Incubare su uno shaker orbitale a 1500 giri/min a temperatura ambiente per 20 minuti.
Quindi incubare su uno shaker orbitale con un blocco di calore a 1500 giri/min e 65 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifuga le perline a 7800 volte G per un minuto e raccogli l'RNP eluso. Aggiungere 400 microlitri di tampone fresco di eluizione della biotina alle perline.
Ripetere il processo di incubazione e centrifugazione per raccogliere un secondo eluto e combinare i due eluiti in un unico tubo da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere tre volumi di buffer di diluizione agli eluiti RNP combinati per ridurre la concentrazione di SDS. Utilizzando un tubo di ultra filtrazione da 0,5 millilitri, concentrare il campione su circa 40 microlitri come delineato nel protocollo di testo.
Aggiungere 0,5 microgrammi per microlitro RNasi A e incubare a 37 gradi Celsius per due ore per rilasciare RRP dalla RNasi reticate. Raccogli due microlitri di RMP per il controllo qualità. Quando si ottimizzano i protocolli CARIC, le fasi di controllo qualità sono fondamentali.
Il controllo di qualità rappresentativo dei campioni etichettati a clic viene eseguito tramite analisi di fluorescenza in gel. Solo il campione doppiamente etichettato mostra una forte banda di striscio ad alto peso molecolare che rappresenta il segnale degli RRNP incrociati. Il segnale RNP viene abolito omettendo le quattro SU o l'UE. Può anche essere abolito dalla digestione con la RNasi A.In alcuni casi si osserva una forte banda spalmata nel campione di controllo SU n. quattro.
Questa banda rappresenta l'etichetta RNasi non collegata che si degrada durante l'innaturazione del calore nella maggior parte dei casi. Il controllo di qualità della conoscenza dei dati del sondaggio di affinità viene valutato attraverso l'analisi western blot che mostra i segnali di biotina nei campioni sia prima del pulldown che dopo il pulldown. Un'analisi della colorazione d'argento degli RMP catturati rivela che per le cellule HeLa, l'efficienza generale di cattura totale è compresa tra lo 0,05 e lo 0,1% delle proteine di input.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che le RNasi sono sensibili alle ribonucleasi. Mantenere l'ambiente sperimentale il più pulito possibile per ridurre lo sgrassamento della RNasi. Seguendo questa procedura, l'identificazione dell'almake proteico usando la spettrometria di massa può essere preformata per rivelare le proteine che delimitano il ferro.
Dopo il suo sviluppo, la tecnica CARIC spianerà la strada a una comprensione più completa del regolamento OT di trascrizione postale sul lavoro.
