L'immunoprecipitazione dell'RNA in tandem seguita dal sequenziamento, o RIPiT-Seq, è un metodo per identificare quali regioni di RNA sono legate da una particolare coppia di proteine leganti l'RNA. Il vantaggio più unico di RIPiT è la sua capacità di indirizzare due diverse proteine in due purificazione. Questo fornisce un modo potente per arricchire per un complesso proteico di RNA distinto dal punto di vista compositio da altri complessi.
Inoltre, RIPiT-Seq è indipendente dal crosslinking UV e può essere applicato a molte proteine che agiscono sull'RNA senza legarlo direttamente. Mentre questo metodo non si estende direttamente verso la terapia o la diagnosi, le proteine leganti l'RNA e l'elaborazione dell'RNA sono state associate a diverse malattie come le neuropatie e il cancro. RIPiT-Seq fornisce uno strumento per lo studio delle funzioni delle proteine leganti l'RNA legate alla malattia.
RIPiT-Seq richiede un sistema in cui può essere espressa una proteina con tag epitopo. È stato testato solo nelle cellule HEK293 ed è più suscettibile alla coltura cellulare. Tuttavia, ora con la nostra capacità di etichettare le proteine utilizzando CRISPR, RIPiT-Seq può essere applicabile a diversi sistemi moderni.
Il successo del RIPiT dipende da due immunoprecipitazioni efficienti, quindi sarà fondamentale ottimizzare le condizioni di immunoprecipitazione per l'anticorpo utilizzato. Inoltre, lavorare con l'RNA richiede precauzioni adeguate, quindi i reagenti senza RNasi devono essere utilizzati durante e dopo l'estrazione dell'RNA. A dimostrare la procedura sarà Lauren Woodward, una studentessa laureata nel mio laboratorio.
Inizia lavando delicatamente le cellule monostrato con 15 millilitri di PBS refrigerato per piastra da 15 centimetri. Quindi raschiare le cellule in 30 millilitri di PBS e raccoglierle in un tubo conico da 50 millilitri. Pellettare le cellule centrifugando a 400 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius e scartare il supernatante.
Aggiungere quattro millilitri di tampone di lisi ipotonica ghiacciata e utilizzare una pipetta P1000 per sospendere di nuovo le cellule. Trasferire il lisato in un tubo da cinque millilitri e incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Mettere il lysate in un bagno di ghiaccio e sonicare secondo le indicazioni manoscritte.
Quindi aggiungere 108 microlitri di cinque cloruro di sodio molare per regolare la concentrazione di sale a 150 millimolare. Quindi, centrifugare il lisato a 12.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere 20 microlitri del supernatante per l'analisi western blot. Prelavare le perle di agarosio FLAG secondo le indicazioni manoscritte e applicare il supernatante rimanente a 750 microlitri di perline in un tubo da cinque millilitri.
Incubare le perle di agarosio FLAG con l'estratto cellulare per una o tre ore a quattro gradi Celsius con una miscelazione delicata. Dopo l'incubazione, pellet le perline per centrifugazione a 400 g per un minuto a quattro gradi Celsius, e raccogliere 20 microlitri del supernatante per l'analisi western blot. Scartare il supernatante rimanente e lavare le perline rimescolandole in quattro millilitri di tampone di lavaggio iso.
Pellettare di nuovo le perline e rimuovere il supernatante. Diluire la RNasi I in 750 microlitri di tampone di lavaggio iso secondo le indicazioni manoscritte e aggiungerla alle perle di agarosio FLAG. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius con miscelazione delicata, quindi pelletare le perline per centrifugazione.
Raccogli 20 microlitri di supernatante per l'analisi western delle macchie e scarta il resto. Quindi, lavare le perline con tampone di lavaggio iso come descritto in precedenza. Successivamente, eseguire l'eluizione di affinità aggiungendo 375 microlitri di tampone di eluizione alle perline e scuotendo delicatamente la miscela a quattro gradi Celsius per una o due ore.
Dopo l'incubazione, pelletare le perline e raccogliere un'aliquota di 15 microliter dell'eluizione per l'analisi della macchia occidentale. Mentre l'eluizione dell'affinità è in corso, eseguire la coniugazione magnetica degli anticorpi delle perline. Inizia lavando 50 microlitri di perline magnetiche in un millilitro di tampone di lavaggio iso.
Riprestare le perline in 100 microlitri di tampone di coniugazione e aggiungere la quantità appropriata di anticorpi. Quindi, incubare le perline per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le perline magnetiche due volte con tampone di coniugazione e rimorsi le perline in 375 microlitri del tampone di diluizione RIPiT.
Conservare le perline sul ghiaccio fino all'immunoprecipitazione. Applicare l'eluizione di affinità FLAG sulle perline magnetiche accoppiate agli anticorpi e incubare con miscelazione delicata per una o due ore a quattro gradi Celsius. Cattura le perline magnetiche con un magnete e raccogli 15 microlitri di supernatante per l'analisi western blot.
Quindi, lavare le perline sette volte con tampone di lavaggio iso. Procedere con l'eluizione denaturante rimospendendo le perline magnetiche in 100 microlitri di tampone di campioni chiari e incubando la sospensione sul ghiaccio per 10 minuti. Durante l'incubazione, scorrere periodicamente le perline per riprerne.
Cattura le perline magnetiche su un magnete e raccogli 15 microlitri di eluizione per l'analisi western blot. Trasferire l'eluizione rimanente in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Per estrarre l'RNA, aggiungere 320 microlitri di acqua priva di RNasi e 400 microlitri di alcol isoamile fenolo-cloroformio all'eluizione RIPiT.
Vortice la miscela e poi centrifugarla a 12.000 g per cinque minuti. Raccogliere 350 microlitri della fase acquosa in un tubo separato. Aggiungere acetato di sodio, cloruro di magnesio, glicogeno ed etanolo al campione raccolto e incubare la miscela durante la notte a -20 gradi Celsius.
Il giorno successivo, pellet l'RNA per centrifugazione a 12.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius e lavarlo in 70%etanolo. Dopo il lavaggio dell'etanolo, trattare l'RNA con T4 polinucleotide chinasi, o PNK, senza alcun ATP, ed eseguire la purificazione fenolo-cloroformio secondo le indicazioni manoscritte. Rimescolare l'RNA pulito in 4,5 microlitri di acqua priva di RNasi.
Per quantificare la resa dell'RNA, etichettare l'RNA con PNK e 32P etichettati ATP secondo le indicazioni manoscritte. Utilizzare una scala del DNA a bassa gamma e un oligo sintetico da 20 a 40 nucleotidi per gli standard di dimensioni e quantità. Risolvere l'RNA etichettato su un gel urea-poliacrilammide al 26%.
Asciugare il gel secondo le indicazioni del manoscritto ed esporre il gel a un fosfoscreen fino a quando non viene rilevato un segnale adeguato. Questa tecnica è stata utilizzata per indagare le interazioni del complesso di giunzione dell'esone o EJC. L'analisi western delle proteine purificate da ogni fase principale della procedura RIPiT mostra che l'EJC purificato contiene sia EIF4A3 che MAGOH.
Il controllo negativo, HNRNPA1, non viene rilevato nell'eluizione. La forza del segnale di ingombro dell'RNA è correlata alla quantità di interazione della proteina RNA. Un'impronta più forte si osserva quando il RIPiT è stato eseguito su cellule trattate con puromicina, il che aumenta l'occupazione EJC sull'RNA.
Per garantire che il RIPiT sia stato efficace, è importante testare l'efficienza dell'IP tramite western blot. È anche importante valutare la quantità e la qualità dell'RNA prima di procedere con il sequenziamento profondo. Nel 2018, il laboratorio Singh ha utilizzato con successo questa tecnica per purificare due variazioni distinte dal punto di vista compositivo del complesso di giunzione dell'esone e identificare i modelli di legame dell'RNA.
Se i ricercatori scelgono di rilevare impronte di RNA con autorazione, dovrebbero essere seguite tutte le procedure e i protocolli di sicurezza delle radiazioni appropriati.
