Ringraziamo sinceramente Shigeo Kita per i suoi preziosi suggerimenti e discussione. Ringraziamo anche John e Sumire Eckstein per loro lettura critica del manoscritto.

Nota: I campioni utilizzati in questo studio sono stati microrganismi, rapidamente congelati con propano in azoto liquido, congelare sostituiti in acetone contenente 2% tetrossido di osmio e incorporati in resina epossidica resina1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. preparazione del supporto pellicola (Figura 1-3)
Nota: Color argento Formvar supporto pellicola viene preparata utilizzando il metodo di fusione su vetro19.
<ol><li>Aggiungere 100 mL di 1,5% Formvar in dicloruro di etilene a un apparato di Formvar-making (Figura 1). Tuffo a metà di una lastra di vetro (76 x 26 x 1,3 mm) nella soluzione di Formvar nella colonna superiore dell'apparecchio premendo la soluzione con l'aria attraverso la 'a' utilizzando una palla di gomma19.<ol>
<li>Scaricare la soluzione dalla colonna aprendo il rubinetto a tre vie e rilasciando aria attraverso 'b' per ridurre la pressione. Estrarre il vetrino dall'apparecchio e asciugare all'aria per formare una pellicola sulla superficie del vetrino. Utilizzare una lampada ad incandescenza per accelerare l'essiccazione del film Formvar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo raschiando i quattro bordi del film sul vetrino con una lama di rasoio (Figura 2a) e la respirazione sulla diapositiva per facilitare la separazione del film dalla diapositiva20, galleggiare fuori la pellicola sull'acqua immergendo il vetrino nella acqua lentamente ad un angolo orizzontale basso (circa 10°, Figura 2b).</li>
	<li>Raccogliere il film Formvar dall'acqua utilizzando un rack in alluminio (30 x 25 x 3 mm) con fori (4 mm di diametro) (Figura 3a). Mantenere il rack con il film di Formvar in un essiccatore fino all'utilizzo (Figura 3b).</li>
</ol>2. tagliare il blocco di campione con una lama di taglio ad ultrasuoni e una lama di rasoio 21 sotto un microscopio stereoscopico (Figura 4)
<ol><li>Assicurarsi che non vi siano cellule sulla superficie del blocco osservando la punta del blocco con un microscopio ottico (Figura 4a).</li>
	<li>Montare il blocco di esemplare nel mandrino (supporto del blocco) e montare il mandrino su un taglio fase21 (Figura 4b). Questa fase di taglio ha un meccanismo di illuminazione dal retro dell'esemplare.</li>
	<li>Tagliare il blocco a una dimensione di 0,7 x 1,0 mm (figure 4 c, 5d). Poiché la resina epossidica è molto difficile, tagliare i blocchi in primo luogo usando una lama di taglio ad ultrasuoni. La lama di taglio ad ultrasuoni è una macchina appena introdotta, e i blocchi vengono facilmente eliminati. Quindi tagliare il blocco ulteriormente con una lama di rasoio. Tagliare una spalla per contrassegnare la direzione di taglio (Vedi Figura 5 d, Figura 8).</li>
</ol>3. tagliare il blocco di esemplare con lama di diamante usando il microtomo (Figura 5)
<ol><li>Impostare il blocco di esemplare chuck nel portacampioni dell'ultramicrotomo. Collocare il campione 90° in senso antiorario contro la posizione effettiva quando sezionamento seriale ultrasottile è eseguita (Vedi Figura 5d).</li>
	<li>La superficie del blocco di taglio con un coltello di taglio del diamante (Vedi Figura 5 d). Impostare il bordo del coltello di diamante parallelo alla faccia del blocco campione e tagliare la quantità minima di superficie del campione per non perdere alcun esemplare (Figura 5d). Nota: Questo passaggio viene fatto per lisciare la superficie del campione. La parte della superficie del campione della parte sottile è lasciata intatta (quindi questa parte non è brillante come uno specchio, Figura 5d), per non perdere qualsiasi parte dell'esemplare per sezionamento seriale. Questo è perché l'esemplare è esposto sulla superficie del blocco.</li>
	<li>Posizionare uno specchio (taglio di Mesa, M) sul palco coltello per monitorare il taglio del blocco campione (Figura 5C).</li>
	<li>Tagliare il bordo sinistro (che diventa il lato superiore, Figura 5d, del campione nella divisione di serie) del blocco utilizzando il coltello multiuso ruotando la fase coltello 30 ° a sinistra (Figura 5a).</li>
	<li>Tagliare il volto di blocco a circa 100 µm dal bordo sinistro dell'esemplare (che diventa il lato inferiore del provino in sezionamento seriale, Figura 5d) ruotando la fase coltello 30 ° a destra (Figura 5b). Nota: Le sezioni di serie saranno tagliate dalla parte sottile dell'esemplare di circa 90 nm x circa 1 mm di dimensioni. La gran parte serviranno per regolare la superficie del campione e il bordo della lama in modo che sono parallele. Dopo aver regolato la superficie del campione per essere parallela al bordo del coltello, la gran parte verrà rimosso con una lama di rasoio. Tagliando i lati superiori e inferiori del campione usando il microtomo, entrambi i lati del provino diventano liscia ed esattamente parallelo a vicenda (Figura 5d), che è necessario per ottenere sezioni di nastro dritto e ininterrotta.</li>
</ol>4. regolazione bordo esemplare di superficie e coltello in modo che si trovano ad affrontare parallelo a vicenda 21
<ol><li>Rimuovere il coltello multiuso e ruotare il blocco campione 90° in senso orario.</li>
	<li>Impostare un coltello di taglio ultrasottile per la fase di coltello.</li>
	<li>Regolare la superficie del campione e il bordo della lama in modo che si trovano ad affrontare parallelo a vicenda utilizzando la gran parte della superficie del campione. Nota: La maggior parte del campione viene utilizzata per la regolazione perché il volto di taglio di sezionamento seriale è così piccolo, rendendo difficile regolare il bordo di superficie e coltello esemplare utilizzando questa parte solo, soprattutto in direzione verticale. Così, utilizzando la grande parte dell'esemplare di facile regolazione.</li>
</ol>5. diffusione soluzione in neoprene sul blocco campione (Figura 6)
<ol><li>Per posizionare il mandrino di esemplare esattamente nella stessa posizione come la posizione originale, applicare il nastro sul mandrino e titolare del mandrino del microtomo e tagliata sul confine (Figura 6a).</li>
	<li>Prendere il campione chuck dal microtomo e posizionarlo sotto lo stereomicroscopio (Figura 6b). Tagliare la parte grande del campione con una lama di rasoio, lasciando la parte sottile, da cui si otterranno le sezioni di serie.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta Pasteur, cadere il campione da utilizzare per il sezionamento seriale, per rendere l'adesivo di lati di sezione soluzione di circa 1 µ l 0,5% in neoprene (Figura 6b). Coprire l'intero campione con soluzione in neoprene. Assorbire la soluzione in eccesso in neoprene immediatamente con un pezzo di carta da filtro posizionato vicino l'esemplare. Ottenere un nastro delle sezioni è essenziale per scattare foto di sezioni seriali delle cellule, e colla neoprene è molto utile per attaccare le sezioni insieme.</li>
	<li>Preparare 3-fessura griglie (dimensioni delle fessure: centrale, 0,4 mm x 2,2 mm, entrambi i lati di 0,2 mm x 2,2 mm) (Figura 6C) per raccogliere le sezioni di serie piegando la maniglia delle griglie a 60 °, trattando le griglie con soluzione in neoprene 0,5% e rendendo le griglie idrofila di di scarico di incandescenza22.</li>
</ol>6. rendere le sezioni di serie (Figura 7-9)
<ol><li>Posto il blocco campione chuck torna nel microtomo nella stessa posizione come 5.1 (Figura 6a) allineando le parti nastrate. Ciò mantiene il volto di blocco e il bordo della lama perfettamente parallelo a vicenda. Quindi portare il coltello vicino al campione.</li>
	<li>Riempire la barca di coltello con acqua.</li>
	<li>Coprire il microtomo con una copertura di plastica per impedire il flusso d'aria (Figura 7). Nota: Il flusso d'aria durante il sezionamento ultrasottile e il recupero di sezioni spesso causare problemi. Il coperchio di plastica ha tre fori: un buco è per le lenti del binocolo, e sono gli altri due fori per le braccia permettere il funzionamento mentre la copertura è su. Il bracciolo in legno è usato per posizionare le braccia mentre si fa un lavoro delicato, come il recupero di sezioni di serie con griglie. Il bracciolo in legno è posto su tabelle diverse dalla tabella microtomo (Figura 7, frecce), per non trasmettere le vibrazioni delle mani dell'operatore per il microtomo.</li>
	<li>Iniziare a tagliare il campione allo spessore di sezione 200 nm (Figura 8). Impostazione a spessore di 200 nm farà risparmiare tempo nel portare il coltello alla superficie del provino.</li>
	<li>Dopo la prima sezione è tagliata, è possibile impostare lo spessore di sezione a 70 nm (Figura 8).</li>
	<li>Quando il numero delle sezioni di serie raggiunge 20 (precisamente parlando, dopo la raggiunge nastro circa 1.8 mm; il numero di sezioni varia a seconda della larghezza delle sezioni), impostare lo spessore di sezione a 10 nm (Figura 8) pur continuando a tagliare. Nota: Poiché il microtomo non può tagliare 10 nm di spessore sezioni, nessuna nuova sezione viene visualizzato, e le sezioni tagliate precedentemente diventano separate dal bordo della lama. È importante arrivare gruppi di sezioni separate (Figura 9) per raccogliere le sezioni di serie evitare difficoltà di separare le sezioni manualmente usando un paio di ciocche di capelli. Poiché il campo visivo del microscopio elettronico a trasmissione è 2.0 mm, sezioni dovrebbero essere al massimo 1,8 mm di lunghezza.</li>
	<li>Impostare lo spessore di sezione a 60 nm (Figura 8). Questo produrrà 70 sezioni nm (Figura 8), perché la macchina aggiungerà spessore precedente 10 nm.</li>
	<li>Impostare lo spessore di sezione torna a 70 nm (Figura 8) e continuare a tagliare fino a 1,8-mm-lungo sezioni sono ottenuti.</li>
	<li>6.6-6.8 Ripetere cinque sezioni lunghe 1,8 mm sono ottenuti (Figura 9). Facciamo solitamente cinque gruppi di sezioni, poiché ci sono cinque portacampioni il microscopio elettronico a trasmissione disponibile nel nostro laboratorio, ma cinque non è il limite.</li>
</ol>7. raccogliendo le sezioni di serie (Figura 10-12)
<ol><li>Posizionare la 'sezione-holding loop'23 (diametro interno del loop: 5,0 mm) (Figura 10a) sul terzo gruppo di sezione (Figura 10b). Nota: È necessario recuperare le sezioni nell'ordine loro sezionamento per prendere le immagini nell'ordine corretto. Tuttavia, poiché ci sono cinque gruppi di sezioni sulla barca coltello, spesso ottiene confondendo quali gruppi sono che. Inserendo il ciclo il terzo gruppo, diventa chiaro che i due gruppi vicino all'operatore sono il primo e secondo e i due distanti dall'operatore sono i gruppi di quarto e quinto (Figura 10b). Ciò impedirà di miscelazione l'ordine.</li>
	<li>Luogo 'acqua di superficie-sensibilizzazione loop'23 (WSRL, diametro interno del loop: 4,0 mm) (Figura 11a) sul palco del coltello (Figura 11b). Il WSRL sarà stare saldamente sul palco coltello perché è dotato di un magnete nella parte inferiore.<ol>
<li>Posizionare l'ansa della WSRL appena sopra le sezioni seriale spostando il suo albero e maniglia. Abbassare il ciclo di WSRL sulla superficie dell'acqua in modo che il ciclo circonda le sezioni.</li>
		<li>Spingere l'anello verso il basso ruotando la vite verso il basso, così che la superficie dell'acqua genererà dalla tensione superficiale (figure 11c-d). Spostare la sezione al centro del loop, posizionarlo sull'apice dell'acqua e regolare la direzione della sezione utilizzando un filo di capelli21.</li>
		<li>Pick up gruppi sezione toccandola con una fessura nuda-griglia, che è detenuta da pinzette e mantenuta parallela alla superficie dell'acqua (Figura 11d). È importante per sezioni a toccare la griglia in primo luogo, non l'acqua, a porre sezioni proprio al centro della griglia (Figura 11d).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare le griglie con sezioni insieme una piccola goccia di acqua su Formvar supporto pellicola16 (Figura 12) e rimuovere l'acqua in eccesso con carta da filtro. Nota: Increspatura del film di supporto è spesso un problema quando sezioni vengono prelevati utilizzando una griglia con supporto pellicola perché membrana (sezioni) tocca la membrana (supporto pellicola) direttamente. Il problema di ottenere le rughe sul film di supporto risulta significativamente ridotto inserendo una griglia di sezione-cuscinetto insieme con una goccia di acqua sulla Formvar supporto pellicola16.</li>
</ol>8. colorazione di sezioni16,24 (Figura 13)
<ol><li>Dopo le sezioni sono completamente asciutta, strappare il film di Formvar da intorno le griglie e togliere le griglie, le sezioni del cuscinetto.</li>
	<li>Impostare le griglie nella scanalatura del tubo colorazione16 nell'ordine corretto (Figura 13) e macchia sezioni con uranile acetato e piombo citrato24. Nota: C'è un solco profondo 0,6 mm lungo l'asse del tubo tagliato con una lama di rasoio. Il tubo è utile per evitare rotture accidentali del film di supporto quando usando la pinzetta, poiché la manipolazione diretta di griglie non è necessario durante la colorazione e lavatrice processo16.</li>
</ol>9. osservazione delle sezioni di serie (Figura 14)
<ol><li>Impostare il 5 griglie nel supporto multi-campione nell'ordine corretto (Figura 14a), orientando l'asse lungo della fessura griglia perpendicolare all'asse di supporto del campione. Le maniglie (sagittarie) delle griglie non devono essere tagliati, perché la 'griglia-fissatori' non toccherà le maniglie.</li>
	<li>Fissare le griglie con 'griglia-fissatori' (Figura 14b) e inserire il supporto del campione al microscopio elettronico a trasmissione. Nota: È spesso utile scattare immagini di basso ingrandimento di tutte le sezioni delle cellule (Figura 15) per trovare interessante microrganismi o cellule in buone condizioni senza contaminazione e con buoni agganci, prima di scattare fotografie la cella obiettivo.</li>
	<li>Scattare foto delle cellule bersaglio in tutte le sezioni di cellule ad alto ingrandimento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+an+ultrastructural+study.">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish.">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo qui presentato non richiede costose attrezzature. Richiede solo un rack di alluminio (Figura 3), tre-fessura griglie (Figura 6C), tenuta di sezione loop (Figura 10a), acqua di superficie-sensibilizzazione loop (Figura 11a) e un tubo di colorazione (Figura 13). Ci sono molte caratteristiche del presente metodo. La gran parte del campione viene utilizzata per regola...

Tecnica di sezionamento ultrasottile seriale corretta è indispensabile per lo studio di cellule e componenti cellulari tridimensionalmente a livello microscopico dell'elettrone. Abbiamo studiato la dinamica del corpo del mandrino palo nel ciclo cellulare delle cellule di lievito e ha rivelato i cambiamenti morfologici delle loro ultrastruttura durante il ciclo cellulare ed il tempo di duplicazione1,2,3, 4,5. Nel 2006, abbiamo coniato una nuova parola 'structome' combinando 'struttura' e '-ome' e l'ha definita il 'informazioni strutturali quantitative e tridimensionale di una cella intera a livello microscopico dell'elettrone' 6,7.
Dall'analisi di structome, che richiede tecnica seriale di sezionamento ultrasottile, si è constatato che una cellula di lievito Saccharomyces cerevisiae e Exophiala dermatitidis ha circa 200.000 ribosomi7,8, un Escherichia coli cella aveva 26.000 ribosomi9, una cella di tubercolosi del micobatterio avuto 1.700 ribosomi10 e batteri a spirale Myojin avevano solo 300 ribosomi11. Queste informazioni sono utili nella stima non solo il tasso di crescita in ogni organismo, ma anche nell'identificazione di specie9.
Inoltre, analisi di structome ha portato alla scoperta di un nuovo organismo; Parakaryon myojinensis è stato trovato nel mare profondo al largo delle coste del Giappone, la cui struttura di cella erano un intermedio tra quelli dei procarioti e negli eucarioti12,13,14,15. Allo stato attuale, tecnica di sezionamento ultrasottile seriale è considerato essere così difficile che ci vorrebbe molto tempo per master. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo affidabile in cui chiunque può eseguire il sezionamento seriale ultrasottile senza difficoltà.

<table><tbody><tr><td>Formvar making apparatus</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>652</td><td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Matsunami Co. Ltd., Osaka</td><td>-</td><td>76 x 26 x 1.3 mm</td></tr><tr><td>Aluminum rack with 4-mm holes</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>658</td><td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SMZ 645</td></tr><tr><td>LED illumination for stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SM-LW 61 Ji</td></tr><tr><td>Trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td></tr><tr><td>LED illumination for trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Ultrasonic trimming blade</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>5240</td><td>EM-240, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Diamond knife for trimming</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Diamond knife for ultrathin sectioning</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Ultracut S</td></tr><tr><td>Mesa cut</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Mirror</td></tr><tr><td>0.5% Neoprene W solution</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Special 3-slit nickel grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2458</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Special 3-slit copper grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2459</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Section-holding loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>526</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Water-surface-raising loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>527</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Staining tube</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>463</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Multi-specimen holder</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>EM-11170</td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Transmission electron microscope</td></tr></tbody></table>

a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy

Osservazione di cellule e componenti delle cellule in tre dimensioni ad alto ingrandimento in microscopia elettronica di trasmissione richiede la preparazione di sezioni ultrasottili di serie dell'esemplare. Anche se la preparazione di sezioni ultrasottili seriale è considerato essere molto difficile, è piuttosto facile se viene utilizzato il metodo corretto. In questa carta, indichiamo una procedura dettagliata per ottenere in modo sicuro seriale sezioni ultrasottili di microrganismi. I punti chiave di questo metodo sono: 1) per utilizzare la gran parte dell'esemplare e regolare il bordo di superficie e coltello di esemplare affinché siano paralleli tra loro; 2) per tagliare le sezioni di serie in gruppi ed evitare difficoltà di separare sezioni usando un paio di ciocche di capelli durante il recupero di un gruppo di sezioni di serie sulle griglie a fessura; 3) utilizzare un 'sezione-holding loop' e evitare di confondere l'ordine dei gruppi di sezione; 4) per utilizzare un ciclo di acqua di superficie-sensibilizzazione e assicurarsi che le sezioni siano posizionate all'apice dell'acqua e che toccano la griglia in primo luogo, al fine di metterli nella posizione desiderata sulle griglie; 5) per utilizzare il film di supporto su un rack di alluminio e rendere più facile per recuperare le sezioni sulle griglie ed evitare grinze della pellicola supporto; e 6) utilizzare un tubo di colorazione ed evitare accidentalmente rompere il film di supporto con le pinzette. Questo nuovo metodo permette di ottenere sezioni ultrasottili seriale senza difficoltà. Il metodo permette di analizzare la struttura cellulare dei microrganismi ad alta risoluzione in 3D, che non può essere realizzato utilizzando il metodo ultramicrotomo raccolta nastro automatico e blocco-faccia seriale o fascio ionico focalizzato, microscopia elettronica a scansione.

In questo protocollo, tre-fessura griglie sono stati utilizzati per raccogliere le sezioni di serie. Le griglie sono costituite di nichel o rame. Le sezioni di serie vengono inserite nella fessura centrale. Le fessure su entrambi i lati sono necessari per visualizzare le sezioni quando raccoglierli con la griglia. Per mantenere le griglie parallele con le sezioni di serie quando li raccogliendo con le pinzette (Figura 11d), la maniglia è piegata (<strong cla...

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A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Questo studio presenta procedure affidabili e facili per ottenere sezioni ultrasottili seriale di un microorganismo senza costose attrezzature in microscopia elettronica di trasmissione.

Un metodo per ottenere il seriale sezioni ultrasottili di microrganismi in microscopia elettronica a trasmissione

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Engineering

14.1K Views.  Chiba University. Questo studio presenta procedure affidabili e facili per ottenere sezioni ultrasottili seriale di un microorganismo senza costose attrezzature in microscopia elettronica di trasmissione.

Video: A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Ricerca

Biochimica

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Migliorare 2D e 3D della pelle<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli con Macromolecole affollamento

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Bioingegneria

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Cryotomography elettrone di cellule batteriche

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biologia

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Neuroscienze

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l&#39;analisi TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

3D ultrastruttura mitocondriale del muscolo di voli indiretti di Drosophila ha rivelato tramite tomografia dell'elettrone Serial-sezione

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

Congelamento rapido con dispositivo di congelamento a sandwich per una buona conservazione ultrastrutturale di campioni biologici in microscopia elettronica

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

Caratterizzazione tridimensionale dei siti di contatto interorganelle negli epatociti mediante microscopia elettronica a sezione seriale

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

Tecniche di microscopia per l'interpretazione della colonizzazione fungina nei tessuti delle piante micoeterotrofiche e della germinazione simbiotica dei semi

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Un metodo per ottenere il seriale sezioni ultrasottili di microrganismi in microscopia elettronica a trasmissione

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