Gli autori ringraziano la signora Béatrice Dimitriades per aiuto con la coltura delle cellule. Questo lavoro è stato supportato dalla Swiss National Science Foundation sovvenzioni n. 31003A_170216 e 51NF40_141735 (PRN RNA &#38; malattia).

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La moltitudine di core e fattori ausiliari che sono coinvolti nel processamento dell'estremità 3' del pre-mRNA si riflette in un paesaggio di poliadenilazione corrispondentemente complesse. Inoltre, è sensible a reagire ai cambiamenti in altri processi come la trascrizione e splicing poliadenilazione. 3' siti di fine taglio in pre-mRNA vengono in genere identificati in base le code di poli (a) caratteristica che vengono aggiunti ai prodotti di clivaggio 5'. Maggior parte dei metodi utilizzare primer oligo (distacco) di lunghezza variabile che consentono la conversione specifica di poli (A)-contenente mRNA da cDNA in una reazione di trascrizione inversa. Un problema comune di questo approccio è innesco interno alle sequenze A ricchi conseguente siti di fenditura artifactual. Sono stati proposti due metodi che mirano ad eludere questo artefatto nella fase di preparazione del campione. Nel metodo 3P-seq 1, adattatori sono specificamente legati alle estremità delle code di poli (a) con l'aiuto di una stecca oligo seguita da digestione parziale di RNAsi T1 e trascrizione d'inversione con TTP nella reazione come l'unico deossinucleotidi. Il risultante eteroduplici poly(A)-poly(dT) quindi sono digeriti con RNAsi H e i rimanenti frammenti di RNA sono isolati, legati agli adattatori e sequenziati. Un metodo più semplice ed elegante, 2P-seq, che utilizza un primer di sequenziamento personalizzato saltando il rimanente tratto di oligo (distacco) nella reazione di sequenziamento è stato segnalato dalla stessa autori 2. In un metodo correlato, 3' legge 3, un primer insolitamente lungo di 5 noi e 45 Ts, contenente anche una biotina è temprato a RNA frammentato, seguito da lavaggi stringenti per selezionare per molecole di RNA con code di poli (a) di oltre 50 nucleotidi. Anche se 3' letture drasticamente riduce la frequenza di innesco interno, questa non elimina completamente e 3. Protocolli per l'ordinamento diretto del RNA sono stati proposti, ma le letture risultante sono brevi e hanno un alto tasso di errore e questo approccio non è stato ulteriormente sviluppato 18,19,20. PolyA-Seq e i protocolli di Quant Seq commercializzati combinano oligo (distacco) basata di adescamento con un passo di adescamento casuale per il cDNA secondo strand sintesi 20. L'uso della reazione di trascrizione inversa della interruttore modello con della trascrittasi inversa del Virus di leucemia murina Moloney (MMLV) conduce alla generazione dei cDNAs con linker in un unico passaggio e quindi nessun dimeri adattatore possono apparire nel PAS-Seq e metodi S.A.P.A.S. 21 , 22.
Il metodo A-seq2 presentato qui spicca nel suo utilizzo di un nucleotide spaccabili (dU) all'interno di un primer oligo biotinilati. Questa modifica unisce l'utilità di arricchire oligo ibridato, poliadenilazione obiettivi con la rimozione della maggior parte della sequenza di25 oligo (dT) tra i frammenti isolati prima di librerie sono preparate e la conservazione delle tre "t", che indicare la presenza precedente della coda di poli (a). Al contrario, i metodi che utilizzano la RNasi H per rimuovere poli (a) dalle molecole di RNA in modo casuale lasciano diversi come. Poiché in A-seq2, sequenziamento è fatto dall'estremità 3' dei filamenti anti-senso, siti di taglio sono preveduti per essere collocato dopo il motivo NNNNTTT all'inizio della sequenza crudo letture. I tetrameri randomizzati servono non solo per consentire base chiamata ma anche l'eliminazione degli artefatti di amplificazione di PCR. UNMIS più lunghi possono essere sistemati. La possibilità di innesco interno rimane in A-seq2 e si rivolge informaticamente, prima scartando 3' termina con una sequenza a valle genomicamente codificati, A ricchi e quindi scartando 3' fine di cluster che potrebbe essere spiegato da innesco interno presso la A-ricco di poli (a) segnale stesso. Una recente analisi dei siti di poli (a) dedotto in modo univoco da un gran numero di protocolli indica che i siti che sono unici per A-seq2 hanno la distribuzione prevista del nucleotide e la posizione all'interno dei geni, simile a altri 3' fine protocolli di sequenziamento.
Un passaggio fondamentale nella A-seq2 è la selezione di poliadenilazione RNA e la rimozione di RNA ribosomiale (rRNA) e vari piccoli RNA. Ciò avviene più facilmente da un kit di isolamento di mRNA con oligo (dT)25 biglie magnetiche. In linea di principio, RNA totale isolato con fenolo contenenti soluzioni anche dà alta qualità RNA che può essere ulteriormente sottoposto a selezione dal kit di mRNA-isolamento o dell'agarosi oligo (dT). Un passaggio che può essere variato in A-seq2 è il trattamento con idrolisi alcalina che possono essere ridotto o esteso per ottenere frammenti di RNA di diverse dimensioni. Fondamentale è anche che l'aggiunta di dATP 3' a 3' estremità dei frammenti di RNA da parte della polimerasi di poli (a) è efficiente. Nel protocollo descritto qui, questo trattamento viene applicato a tutti i frammenti di RNA, per evitare concatemerization durante la reazione di legatura. Si segnala infine che, sebbene ligasi RNA 1 è usata normalmente come una ligasi di RNA, lega anche in modo efficiente singolo DNA incagliato, come abbiamo fatto qui per legare un adattatore all'estremità 5' delle molecole di cDNA.
Così, A-seq2 è un efficiente e facile da implementare il protocollo per l'identificazione di siti di elaborazione estremità 3' del pre-mRNA. Gli sviluppi futuri potrebbero includere riducendo ulteriormente la complessità del protocollo e la quantità di materiale necessario. Set di strumenti di analisi computazionale dati ulteriormente associato abilitare l'elaborazione omogenea dell'estremità 3' letture ottenute con una vasta gamma di protocolli di sequenziamento.

La cattura e la sequenza di mRNA 3' estremità permette lo studio dell'elaborazione di mRNA e la quantificazione dell'espressione genica. A causa di loro code di poli (a), mRNA eucariotico può essere efficacemente purificato da lisati cellulari totali con perlina-immobilizzata oligo-deossitimidina (molecole di oligo(dT)), che può anche innescare la sintesi di cDNA. Tuttavia, questo approccio presenta due svantaggi. In primo luogo, tratti della A interne a trascrizioni possono anche innescare la sintesi di cDNA, conseguente spurie poli (a) siti. Poli (a) in secondo luogo, omogeneo tratti pongono sfide specifiche per il sequenziamento, oltre a non essere ben informato per l'identificazione di trascrizione. Vari approcci sono stati proposti per aggirare queste limitazioni, come trascrizione d'inversione attraverso poli (a) Code seguite da digestione RNasi H (3P-seq 1), utilizzo di un primer di sequenziamento personalizzato che termina in 20 Ts (2P-seq 2), preselezione di Frammenti di RNA con code di poli (a) di oltre 50 nucleotidi con un primer di45 CU5T seguita da digestione RNasi H (3' letture 3) e l'utilizzo di un primer oligo-dT contenente l'adattatore 3' in un tornante (A-seq 4).
L'A-seq2 metodo sviluppato di recente 5 mira a bypassare il sequenziamento attraverso poli (a) e allo stesso tempo per ridurre al minimo la percentuale di dimeri generati da auto-legatura degli adattatori, particolare che si verificano quando la concentrazione molare di adattatori supera la concentrazione di inserto. Questo problema può essere eliminato quando entrambe le schede sono legate allo stesso tipo di polinucleotide estremità come in A-seq2, dove le schede 3' sono legate all'estremità 5' di frammenti di RNA e le schede di 5' a 5' estremità dei cDNA dopo trascrizione inversa. Il metodo è più conveniente della nostra precedentemente proposta A-seq - in cui sequenziamento è stato in 5'-a-3' direzione quindi che richiedono precisamente controllata RNA frammentazione-, pur mantenendo un'elevata precisione di identificazione del sito di poli (a). Circa l'80% delle letture sequenziate in campioni tipici associati in modo univoco al genoma e condurre all'identificazione di oltre 20.000 cluster di sito di poli (a), più del 70% delle quali sovrapposte con annotata 3' UTR.
In breve, il protocollo A-seq2 inizia con frammentazione di mRNA e la legatura del inverso-complemento 3' adattatori alle estremità 5' dei frammenti di RNA. Poli (A)-contenente RNA è quindi inverso trascritto con un primer oligo lungo 25 nucleotidi (nt) che contiene un nucleotide di ancoraggio all'estremità 3', un dU in posizione 4 e una biotina all'estremità 5', consentendo l'associazione del cDNA di branelli magnetici streptavidina. La maggior parte del primer, tra cui la biotina, viene rimosso da cDNA tramite fenditura al dU tramite il mix di enzima di utente, contenente Uracil DNA glicosilasi (UDG) e il DNA glicosilasi-liasi endonucleasi VIII. Questa reazione lascia intatti finisce per la legatura di un adattatore per 5' e tre Ts sinistra dopo fenditura rimangono per contrassegnare la posizione della coda di poli (a). Perché schede di 5' e 3' sono collegate tramite la legatura al destinatario 5' estremità, non vengono generati dimeri di adattatore. Quattro nucleotidi casuale-mers introdotto all'inizio di letture permette la risoluzione di cluster su strumenti di sequenziamento di state-of-the-art e può anche servire come identificatore univoco molecolare (UMI) per il rilevamento e la rimozione di artefatti di amplificazione di PCR. La dimensione della Umi può essere ulteriormente aumentata come fatto in altri studi 6. Il protocollo genera letture che sono invertire complementare al mRNA 3' estremità, tutti che iniziano con un tetramero randomizzato seguito da 3 Ts. elaborazione di letture che hanno le 3 Ts diagnostica a loro 5' fine inizia con la correzione di artefatti di amplificazione di PCR di sfruttando l'UNMIS, rimozione delle sequenze 3' adattatore e invertire la complementazione. Si legge che potrebbero trarre origine da oligo adescamento a siti A ricchi interni sono anche identificati informaticamente e scartati. I siti spuri generalmente privi di uno dei 18 ben caratterizzati e segnali di poli (a) conservati che dovrebbero essere situato ~ 21 nucleotidi a Monte del clivaggio apparente sito 7.
Il protocollo richiede circa 8 h tempo di hands-on, senza contare la coltura delle cellule e le legature durante la notte. L'associato leggere analisi software consente un'identificazione del sito di poli (a) altamente accurate. Dal sito di poli (a) i cluster creato in basati a 4 campioni ulteriormente evidenziati in questa sovrapposizione di 84% manoscritto (due replicati biologici di controllo siRNA e cellule si-HNRNPC-trattate) con un gene con annotazioni e di questi, sovrapposizione di 75% con una 3' UTR e l'86% sia con un 3' UTR o un esone terminale. Il coefficiente di correlazione di Pearson di espressione di 3' estremità nei campioni replicati è 0.92, e valori di superiore allo 0,9 sono in genere ottenuti con il metodo. Così, A-seq2 è un metodo conveniente che dà risultati molto riproducibili.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, ultra pure</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Cordycepin triphosphate (3&amp;rsquo; dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>DNA low bind vials, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>GR-Green dye</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>use 1:10,000 dillution</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 or NextSeq 500 next generation sequencers</td><td>Illumina</td><td>inquire with supplier</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA polymerase mix</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, yeast</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>Polynucleotide kinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNA ligase 1, high concentration</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M</td><td>includes PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute RNA Cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV reverse transcriptase</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USER enzyme mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 magnetic rack</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Heated mixer with heated lid</td></tr><tr><td>MicroSpin columns</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline hydrolysis buffer, 1.5 x</td><td></td><td></td><td>Mix 1 part 0.1 M Na2CO3 and 9 parts 0.1 M NaHCO3. Add EDTA to 1 mM. Adjust pH to 9.2. Store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>5x poly(A) polymerase buffer</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 3 mM MnCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml acetylated BSA, 50% glycerol</td></tr><tr><td>Biotin binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris&amp;shy;Cl pH 7.5, 2 M NaCl, 0.1% NP&amp;shy;40</td></tr><tr><td>TEN buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris&amp;shy;Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.02% NP&amp;shy;40</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Sequence&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Oligonucleotides according to Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, for GA-IIx and Hiseq2000/2500 sequencers&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Microsynth&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&amp;rsquo; amino&amp;shy; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&amp;shy; 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&amp;rsquo; amino&amp;shy; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#039; (V = G, A or C)</td></tr><tr><td>PCR primer forward, RP1</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAG&lt;br/&gt;TCCGA 3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primer reverse, RPI1, barcode in bold</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; CAAGCAGAAGACGGCATACGAG&lt;br/&gt;
AT&lt;strong&gt;CGTGAT&lt;/strong&gt;GTGACTGGAGTTCCT&lt;br/&gt;
TGGCACCCGAGAATTCCA 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Oligonucleotides according to Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, for HiSeq2000/2500 and NextSeq500 sequencers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (DNA/RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039;-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG&lt;br/&gt;
CTCTTCCrGrAUrC-3&#039;</td></tr><tr><td>HT-rev5A</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT&lt;br/&gt;
CTTCCGATCTNNNN 3&#039;</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers forward (D501-506)</td><td>Microsynth or Illumina</td><td></td><td>5&#039;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT&lt;br/&gt;CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA&lt;br/&gt;CGACGCTCTTCCGATCT -3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers reverse (D701-D712)</td><td>Microsynth or Illumina</td><td></td><td>5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3&#039;</td></tr><tr><td>Documentation for Illumina multiplexing:</td><td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

3' end sequencing library preparation with a-seq2

Gli studi nell'ultimo decennio hanno rivelato una varietà complessa e dinamica di pre-mRNA clivaggio e poliadenilazione reazioni. mRNA con lungo regioni 3' non tradotta (UTR) vengono generati in cellule differenziate, mentre le cellule proliferanti esprimono preferenzialmente trascrizioni con breve 3' UTR. Descriviamo il protocollo A-seq, ora alla sua seconda versione, che è stato sviluppato per mappare siti di poliadenilazione genoma e studiare la regolazione del pre-mRNA processamento dell'estremità 3'. Anche questo protocollo attuale sfrutta la polyadenylate nel (poly(A)) code che vengono aggiunti durante la biogenesi dei mRNAs più mammiferi per arricchire per mRNA completamente elaborato. Un adattatore di DNA con deoxyuracil alla sua quarta posizione permette la lavorazione precisa di mRNA 3' fine frammenti per la sequenza. Non compresa la coltura delle cellule e le legature durante la notte, il protocollo richiede circa 8 h tempo di hands-on. Insieme ad essa, viene fornito un pacchetto facile da usare software per l'analisi dei dati di sequenziamento derivata. A-seq2 e il software di analisi associati forniscono una soluzione efficiente e affidabile per il mapping del pre-mRNA 3' finisce in una vasta gamma di condizioni, da 106 o meno cellule.

Poli (A)-contenente RNA è stato isolato dalle cellule coltivate, frammentate di idrolisi alcalina e cDNA sono state fatte di retrotrascrizione con primer oligo (distacco). Il cDNA risultante è stato immobilizzato su perle di streptavidina, dU è stato fenduto nella reazione di asportazione specifico di uracile, adattatori erano legati al 5' e 3' estremità del frammento spaccato e gli inserti sono state sequenziate. Figura 1 raffigura un contorno grafico dell'esperimento.
Per cellule HEK293 e HeLa, 106 celle erano sufficienti per identificare i siti di poli (a) per la stragrande maggioranza dei geni di proteina-codificazione alla fine della procedura. Tuttavia, per altri tipi di cellule o tessuti che può essere necessario testare la saturazione del numero di poli (a) identificati siti come il numero di celle utilizzato nell'esperimento aumenta. Risultati rappresentativi della PCR pilota passo e del frammento del DNA analisi del campione prima di sequenziamento sono mostrati nella Figura 2.
La figura 3 Mostra i passaggi di pre-elaborazione di analisi computazionale, a partire dal file fastq ottenuti dal sequencer e terminando con le letture di qualità controllata, bordato di adattatore che sono pronte ad essere mappato il genoma. La figura 4 Mostra la procedura di analisi che iniziano con la mappatura delle letture al genoma corrispondente e fine con catalogo di siti che sono identificati in un campione particolare di elaborazione estremità 3' mRNA. Quando si analizzano campioni multipli, vengono eseguite ulteriori operazioni per abbinare all'estremità 3' elaborazione di siti che sono stati trovati nei campioni individuali e segnalare loro abbondanza attraverso campioni. Questi passaggi sono illustrati nella Figura 5.
Così, una volta che i campioni sono stati sequenziati, l'analisi della sequenziazione risultante leggere i file (in formato fastq) attraverso la pipeline di elaborazione disponibili è semplice. Dopo aver aggiunto le informazioni sugli esempi nel file di configurazione, l'esecuzione della pipeline si tradurrà in due tipi principali di file di output: 1) letto-file con tutte le 3' finiscono elaborazione siti individuati nei singoli campioni (ad es. " Sample1.3pSites.noIP.Bed.gz") e 2) un letto-file con tutti i poli (a)-cluster sito (clusters.merged.bed) attraverso tutti i campioni dello studio. La produzione comprende anche le coordinate del genoma per tutte le letture da ogni singolo campione (ad esempio "sample1. STAR_out/aligned.sortedByCoord.out.Bam") che più tardi possono essere visualizzati in un browser del genoma come IGV16. Ispezione visiva dei profili letti fornisce generalmente un primo assaggio della distribuzione dei siti di poli (a) nel genoma e i cambiamenti che si verificano al momento delle perturbazioni specifiche che sono state effettuate nello studio. Ad esempio, nella Figura 6 è illustrata la risposta di un gene specifico per il knock-down della proteina HNRNPC.
Sintesi di queste distribuzioni di genoma sono inoltre forniti (tabella 1). In particolare, i file di output nella directory "conteggi/annotation_overlap" contengono frazioni di siti che si sovrappongono con specifiche caratteristiche con annotazioni (dal gtf file fornito come input; annotati sono: 3' UTR, essone terminale, esone, introne, intergenica). Infine, per ogni campione, risultati delle fasi di lavorazione individuali vengono salvati (ad esempio "sample1.summary.tsv"). Questo include i numeri di: crude letture in ogni campione, si legge che hanno la struttura prevista dell'estremità 5', si legge che rimangono dopo essere collassato completo duplicati PCR, alta qualità legge secondo i criteri definiti al punto 9.2, legge che la mappa in modo univoco al genoma (dopo essere collassato a quelli derivanti da errori di sequenziamento, vedi punto 9.5), multi-mappatura legge (dopo essere collassato a quelli derivanti da errori di sequenziamento, vedi punto 9.5), raw (non cluster) 3' fine elaborazione siti in ogni campione, crudo 3' fine elaborazione siti senza candidati potenziali di innesco interno, unico 3' fine elaborazione siti da tutti i campioni senza innesco interno candidati e set finale di poli (a) sito cluster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
Figura 1: fasi principali del protocollo A-seq2. Singoli passi sono indicati sul lato sinistro della figura. Inserisci frammenti di RNA sono rappresentati come linee verdi che diventano rossi per cDNA dopo trascrizione inversa; gli adattatori sono colorati in azzurro o in arancione. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
Figura 2: pilota PCR e prodotto finale profilo. (un) aliquote dalla reazione di PCR sono stati raccolte a cicli diversi e separati su gel di agarosio 2%. I numeri a sinistra indicano dimensione in nucleotidi delle rispettive bande nella scala del DNA. In questo esperimento 12 cicli (*) sono stati scelti per la reazione di PCR su larga scala. (b) esempio di un campione dopo il formato selezione correre su un analizzatore di dimensione del frammento rivelando una dimensione media di circa 280 nucleotidi. I numeri a sinistra [FU] indicano l'intensità relativa del segnale. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
Figura 3: struttura del pre-trattamento di sequenziamento letture. Per identificare le letture di alta qualità che verranno mappate al genoma corrispondente vengono elaborati i file fastq con letture che vengono generati dal software strumento-collegata di sequenziamento. La figura mostra la specifica di ingresso/uscita delle singole fasi della pipeline, con collegamenti per i singoli passaggi del protocollo descritto nella sezione "Elaborazione dei dati". <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
Figura 4: schema di sequenza leggere elaborazione, del passaggio di mapping per il genoma per la generazione di singoli 3' fine elaborazione siti. Nella figura viene illustrata la specifica di ingresso/uscita delle singole fasi della pipeline, con collegamenti per la individual passaggi del protocollo descritto nella sezione "Elaborazione dei dati". Il file di output principale che viene consegnato all'utente è segnato in neretto. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
Figura 5: struttura dei passaggi che sono presi per generare cluster di co-regolati da 3' estremità sequenziamento siti. La figura mostra la specifica di ingresso/uscita delle singole fasi della pipeline, con collegamenti per i singoli passaggi del protocollo descritto nella sezione "Elaborazione dei dati". Il file di output principale è segnato in neretto. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
Figura 6: risultati di esempio del profilo del 3' finiscono elaborazione letture lungo il terminale esone del gene NUP214, mostrato nel browser del genoma IGV 16 . A-seq2 letture sono state preparate da due campioni di cellule HEK 293, trattate con un controllo-siRNA o con un HNRNPC siRNA. Le letture che documentato siti di poli (a) che sono stati annotati dalla pipeline di analisi erano salvate nel formato BAM che è stato utilizzato come input per il browser del genoma IGV. Le estremità 3' dei picchi letti mappa mRNA 3' estremità che vengono annotate nello Ensembl. I profili indicano un uso aumentato dell'isoforma lunga 3' UTR su HNRNPC knock-down. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>si-controllo replicare 1</td>
			<td>si-controllo replicare 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ID: 29765</td>
			<td>ID: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>numero di letture crude</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>numero di letture valide dopo la rifilatura e filtraggio</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>numero di mapping in modo univoco letture</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>numero di letture mapping ai luoghi multipli</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>numero di singoli 3' fine elaborazione siti</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: esempio di output della pipeline analisi. Sintesi della legge che sono stati ottenuti alle singole fasi.

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3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Questo protocollo descrive un metodo per la mappatura pre-mRNA 3' fine elaborazione siti.

3' fine sequenziamento preparazione libreria con A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

3-end-sequencing-library-preparation-with-a-seq2

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K Views.  University of Basel. Questo protocollo descrive un metodo per la mappatura pre-mRNA 3' fine elaborazione siti.

Video: 3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Ricerca

Genetica

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Analisi della dinamica del tRNA con AQRNA-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

Autore in primo piano: Ruolo di AQRNA-seq nella mappatura di piccoli RNA e nel disfacimento dei meccanismi di traduzione delle proteine

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

<meta charset="utf8"></head><body>Rilevamento di eventi di scissione CRISPR-Cas9 fuori bersaglio con CIRCLE-Seq

CIRCLE-Seq for Interrogation of Off-Target Gene Editing

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of unintended cleavage sites of CRISPR-Cas9 through targeted sequencing of CRISPR-Cas9 cleaved DNA. The protocol involves circularizing genomic DNA (gDNA), which is subsequently treated with the Cas9 protein and a guide RNA (gRNA) of interest. Following treatment, the cleaved DNA is purified and prepared as a library for Illumina sequencing. The sequencing process generates paired-end reads, offering comprehensive data on each cleavage site. CIRCLE-seq provides several advantages over other in vitro methods, including minimal sequencing depth requirements, low background, and high enrichment for Cas9-cleaved gDNA. These advantages enhance sensitivity in identifying both intended and unintended cleavage events. This study provides a comprehensive, step-by-step procedure for examining the off-target activity of CRISPR-Cas9 using CIRCLE-seq. As an example, this protocol is validated by mapping genome-wide unintended cleavage sites of CRISPR-Cas9 during the modification of the AAVS1 locus. The entire CIRCLE-seq process can be completed in two weeks, allowing sufficient time for cell growth, DNA purification, library preparation, and Illumina sequencing. The input of sequencing data into the CIRCLE-seq pipeline facilitates streamlined interpretation and analysis of cleavage sites.

<meta charset="utf8"></head><body>CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

A significant barrier to technologies like CRISPR is the off-target events that can disrupt vital genes. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing' (CIRCLE-seq) is a technique designed to identify unintended cleavage sites. This method maps the genome-wide activity of CRISPR-Cas9 with high sensitivity and without bias.

CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Biochimica

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Gel-seq: Un metodo per la preparazione di libreria simultanea di sequenziamento del DNA e RNA utilizzando matrici di idrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

3' fine sequenziamento preparazione libreria con A-seq2

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS

Gel-seq: Un metodo per la preparazione di libreria simultanea di sequenziamento del DNA e RNA utilizzando matrici di idrogel