Os autores agradecer dona Béatrice Dimitriades ajuda com a cultura de células. Este trabalho foi financiado pela Fundação de ciência nacional Suíça concede #31003A_170216 e 51NF40_141735 (RNA NCCR &#38; doença).

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	<li>Jan, C. H., Friedman, R. C., Ruby, J. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation,+regulation+and+evolution+of+Caenorhabditis+elegans+3'UTRs.">Formation, regulation and evolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs.</a> Nature. 469 (7328), 97-101 (2011).</li><li>Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+UTR-isoform+choice+has+limited+influence+on+the+stability+and+translational+efficiency+of+most+mRNAs+in+mouse+fibroblasts.">3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts.</a> Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).</li><li>Hoque, M., Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+alternative+cleavage+and+polyadenylation+by+3'+region+extraction+and+deep+sequencing.">Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing.</a> Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).</li><li>Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+pre-mRNA+3’+end+processing+reveals+a+decisive+role+of+human+cleavage+factor+I+in+the+regulation+of+3'+UTR+length.">Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length.</a> Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).</li><li>Gruber, A. R., Martin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+3'+UTR+shortening+has+a+limited+effect+on+protein+abundance+in+proliferating+T+cells.">Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells.</a> Nat. Commun. 5, 5465 (2014).</li><li>Kivioja, T., V&#228;h&#228;rautio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+absolute+numbers+of+molecules+using+unique+molecular+identifiers.">Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers.</a> Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).</li><li>Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+of+3'+end+sequencing+data+sets+reveals+novel+polyadenylation+signals+and+the+repressive+role+of+heterogeneous+ribonucleoprotein+C+on+cleavage+and+polyadenylation.">A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation.</a> Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).</li><li>Lingner, J., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-end+labeling+of+RNA+with+recombinant+yeast+poly(A)+polymerase.">3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).</li><li>Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+genome+center's+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system.">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li><li>Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine.">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li><li>. Anaconda Software Distribution Available from: <a target="_blank" href="https://continuum.io">https://continuum.io</a> (2016)</li><li>Dobin, A., Davis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Robinson, J. T., Thorvaldsd&#243;ttir, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ozsolak, F., Platt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+RNA+sequencing.">Direct RNA sequencing.</a> Nature. 461 (7265), 814-818 (2009).</li><li>Yao, C., Biesinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+analyses+of+CstF64-RNA+interactions+in+global+regulation+of+mRNA+alternative+polyadenylation.">Transcriptome-wide analyses of CstF64-RNA interactions in global regulation of mRNA alternative polyadenylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (46), 18773-18778 (2012).</li><li>Lin, Y., Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-depth+map+of+polyadenylation+sites+in+cancer.">An in-depth map of polyadenylation sites in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).</li><li>Shepard, P. J., Choi, E. -. A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+and+dynamic+landscape+of+RNA+polyadenylation+revealed+by+PAS-Seq.">Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq.</a> RNA. 17 (4), 761-772 (2011).</li><li>Fu, Y., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+genome-wide+profiling+of+tandem+3'+UTRs+among+human+breast+cancer+and+normal+cells+by+high-throughput+sequencing.">Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.</a> Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A multidão de núcleo e fatores auxiliares que estão envolvidos no processamento de pre-mRNA 3' final é refletida em uma paisagem de poliadenilação correspondentemente complexo. Além disso, poliadenilação também é sensível a mudanças em outros processos como transcrição e emenda. 3' sites de clivagem final em pre-mRNAs são normalmente identificados com base nas caudas poli característicos que são adicionadas aos produtos de clivagem 5'. A maioria dos métodos usar primers oligo (descolamento) de comprimentos variáveis que permitem a conversão específica de poli (A)-contendo mRNAs de cDNAs em uma reação de transcrição reversa. Um problema comum desta abordagem é interna escorva para sequências A rica resultando em sítios de clivagem diferente. Dois métodos que visam contornar este artefato na fase de preparação da amostra têm sido propostos. No método 3P-seq 1, adaptadores são especificamente ligados às extremidades de caudas poli (a) com a ajuda de uma tala oligo seguido por digestão parcial de RNase T1 e transcrição reversa com TTP na reação como a única deoxynucleotide. As resultante poly(A)-poly(dT) heteroduplexes são então digeridos com RNase H e os restantes fragmentos de RNA são isolados, ligados a adaptadores e sequenciados. Um método mais simples e elegante, 2P-seq, que usa uma cartilha de sequenciamento personalizado saltando o trecho restante de oligo (descolamento) na reação de sequenciamento foi relatado pelo mesmo autores 2. Em um método relacionado, 3' lê 3, um primer extraordinariamente longo de 5 nós e 45 Ts, também contendo uma biotina são recozidos para RNA fragmentado, seguido de lavagens rigorosas para selecionar para moléculas de RNA com caudas poli (a) de mais de 50 nucleótidos. Embora 3' leituras reduz drasticamente a frequência de escorva interna, ela não completamente elimina- 3. Protocolos para a sequenciação do ARN direto também têm sido propostos, mas o lê resultante é curto e têm uma alta taxa de erro e essa abordagem não tem sido ainda mais desenvolvidos 18,19,20. A PolyA-Seq e os protocolos de Quant Seq comercializados combinam escorva (descolamento) oligo baseado com um passo de escorva aleatórios para a segunda vertente do cDNA síntese 20. O uso da reação de transcrição reversa do interruptor de modelo com a transcriptase reversa Moloney Murine leucemia vírus (MMLV) leva à geração de cDNAs com linkers em uma única etapa e desse modo não dímeros de adaptador podem aparecer no PAS-Seq e métodos SAPAS 21 , 22.
O método A-seq2 apresentado aqui se destaca em sua utilização de um nucleotídeo cleavable (dU) dentro de uma cartilha de oligo (descolamento) biotinilado. Esta modificação combina o utilitário de enriquecimento de oligo (descolamento) hibridizada, polyadenylated alvos com a remoção da maioria dos25 sequência oligo (dT) dos fragmentos isolados antes de bibliotecas são preparadas e a preservação de três Ts, que indica a presença anterior da cauda poli (a). Em contraste, métodos que utilizam o RNase H para retirar poli (a) as moléculas de RNA aleatoriamente deixam vários como. Desde em A-seq2, sequenciamento é feito da extremidade 3' dos fios antisenso, sítios de clivagem são preditos para ser localizado após o motivo NNNNTTT no início da sequência primas leituras. Os estudo randomizados tetrâmeros servem não só para permitir base chamando mas também na eliminação de artefatos de amplificação do PCR. Mais UMIs também podem ser acomodados. A possibilidade de escorva interna permanece em A-seq2 e é dirigida computacionalmente, primeiro descartando 3' termina com uma sequência de jusante codificado em genomically, A rica e, em seguida, descartando 3' clusters de final que poderiam ser explicadas pela ferragem interna na Sinal de poli A-ricos em si. Uma análise recente de sites de poli inferida com exclusividade por um grande número de protocolos indica que os sites que são exclusivos para A-seq2 têm o nucleotídeo esperada distribuição e localização dentro de genes, semelhantes a outros 3' acabar com protocolos de sequenciamento.
Um passo fundamental na-seq2 é a seleção de polyadenylated RNA e remoção de RNAs ribossomal e vários pequenos RNAs. Isso é feito facilmente por um kit de mRNA-isolamento com grânulos magnético de oligo (dT)25 . Em princípio, o RNA total isolado com fenol contendo soluções também dá alta qualidade do RNA que pode ser ainda mais sujeitos a seleção pelo kit de isolamento do mRNA ou agarose oligo (dT). Uma etapa que pode ser variada em A-seq2 é o tratamento com hidrólise alcalina, que pode ser reduzido ou estendido para obter fragmentos de RNA de tamanhos diferentes. Crítica também é que a adição de dATP 3' para 3' extremidades dos fragmentos de RNA pelo polymerase de poli é eficiente. O protocolo descrito aqui, este tratamento é aplicado para todos os fragmentos de RNA, para evitar concatemerization durante a reação de ligadura. Finalmente, notamos que, embora ligase RNA 1 é normalmente usado como um ligase do RNA, também ligates eficientemente único ADN encalhado, como fizemos aqui para ligar um adaptador à extremidade 5' das moléculas de cDNA.
Assim, A-seq2 é um eficiente e fácil de implementar o protocolo para a identificação de pre-mRNA' a extremidade 3 sites de processamento. Os desenvolvimentos futuros podem incluir reduzindo ainda mais a complexidade do protocolo e a quantidade de material necessário. O conjunto associado de ferramentas de análise de dados computacionais mais habilitar o processamento homogêneo de 3' fim leituras obtidas com uma grande variedade de protocolos de sequenciamento.

A captura e sequenciamento de mRNA 3' extremidades permite o estudo do processamento do mRNA e a quantificação da expressão gênica. Devido a suas caudas poli, mRNAs eucarióticos podem ser eficientemente purificados de lisado celular total com grânulo-imobilizado oligo-cromatografia (moléculas oligo(dT)), que também pode aprontar a síntese do cDNA. No entanto, esta abordagem tem dois inconvenientes. Primeiro, trechos de A's que são interno para transcrições também podem prime síntese do cDNA, resultando em sites de poli espúrias. Poli (a) homogênea, segundo trechos representam desafios específicos para sequenciamento, além de não ser informativo para identificação de transcrição. Várias abordagens têm sido propostas para contornar essas limitações, tais como a transcrição reversa através de poli caudas seguidas por digestão RNase H (3P-seq. 1), uso de um primer de sequenciamento personalizado terminando em 20 Ts (2P-seq. 2), pré-selecção de Fragmentos de RNA com caudas poli (a) de mais de 50 nucleótidos com um primer de45 CU5T seguido por digestão RNase H (3' leituras 3) e o uso de um primer de oligo-dT que contém o adaptador 3' em um grampo de cabelo (A-seq. 4).
O recentemente desenvolvido A-seq2 método 5 destina-se a ignorar o sequenciamento através de poli (a) e ao mesmo tempo minimizar a proporção de dímeros são gerados pelo auto ligadura dos adaptadores, ocorrendo especialmente quando a concentração molar de adaptadores supera a concentração de inserção. Este problema pode ser eliminado quando ambos os adaptadores são ligados para o mesmo tipo de polinucleotídicas termina como em A-seq2, onde os 3' adaptadores são ligados à extremidade 5' do RNA fragmentos e os adaptadores de 5' para 5' extremidades dos cDNAs após a transcrição reversa. O método é mais conveniente do que a nossa anteriormente proposto A-seq - no qual sequenciamento foi no 5'-para-3' direção que exige precisamente controlado RNA fragmentação-, mantendo uma alta precisão de identificação de site do poli (a). Cerca de 80% das leituras sequenciais em amostras típicas mapear com exclusividade para o genoma e levar a identificação de mais de 20.000 clusters poli local, mais de 70% das quais se sobrepõem com anotada 3' UTRs.
Em breve, o protocolo A-seq2 começa com fragmentação de mRNA e ligadura dos adaptadores reverso-complemento 3' para as extremidades 5' de fragmentos de RNA. Poli (A)-contendo RNAs são então reversos transcritas com um primer de longa (descolamento) oligo 25 nucleotídeos (nt) que contém um nucleotídeo âncora na extremidade 3', um dU na posição 4 e uma biotina na extremidade 5', que permite a ligação do cDNA de grânulos magnético estreptavidina. A maioria da primeira demão, incluindo a biotina, é removido o cDNA por clivagem em dU por mistura de enzima do usuário, contendo Uracil DNA glycosylase (UDG) e o DNA glycosylase-liase Endonuclease VIII. Esta reação deixa extremidades intactas para a ligadura de um adaptador de 5' e 3 Ts esquerda após clivagem permanecem marcar o local da cauda poli (a). Porque tanto 5' e 3' adaptadores são anexados pela ligadura para destinatário 5' extremidades, dímeros nenhum adaptador são gerados. Quatro nucleótidos aleatório-mers introduzidos no início de leituras permite a resolução de cluster em instrumentos de sequenciamento de estado-da-arte e também pode servir como identificador exclusivo molecular (UMI) para a detecção e remoção de artefatos de amplificação do PCR. O tamanho do UMI pode ser aumentado como feito em outros estudos 6. O protocolo gera leituras que são inverter complementar ao mRNA 3' extremidades, tudo iniciando com um tetrâmero randomizado, seguido por 3 Ts. processamento de leituras que têm os 3 Ts diagnósticos no final inicia sua 5' com a correção de artefatos de amplificação do PCR por explorando os UMIs, remoção de sequências de 3' adaptador e reverter a complementação. Leituras que podem ter se originado de escorva de oligo (descolamento) em sites internos A rica também são identificadas computacionalmente e descartadas. Os sites espúrios geralmente faltam um dos 18 bem caracterizadas e conservada poli sinais que devem ser localizado ~ 21 nucleotídeos upstream da clivagem aparente local 7.
O protocolo exige cerca de 8 h tempo hands-on, sem contar com a cultura de células e a ligadura durante a noite. O associado Leia análise software permite uma identificação de site poli altamente precisos. Do site da poli aglomerados criados com baseados em 4 amostras mais destacadas nesta sobreposição de 84% do manuscrito (duas repetições biológicos de controle siRNA e si-HNRNPC-tratada células) com um gene anotado e destes, 75% de sobreposição com um 3' UTR e 86% com qualquer um 3' UTR ou um terminal exon. O coeficiente de correlação de Pearson de expressão de 3' extremidades nas amostras de replicar é 0,92, e valores de acima de 0,9 normalmente são obtidos com o método. Assim, A-seq2 é um método conveniente que dá resultados muito reprodutíveis.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, ultra pure</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Cordycepin triphosphate (3&amp;rsquo; dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>DNA low bind vials, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>GR-Green dye</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>use 1:10,000 dillution</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 or NextSeq 500 next generation sequencers</td><td>Illumina</td><td>inquire with supplier</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA polymerase mix</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, yeast</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>Polynucleotide kinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNA ligase 1, high concentration</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M</td><td>includes PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute RNA Cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV reverse transcriptase</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USER enzyme mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 magnetic rack</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Heated mixer with heated lid</td></tr><tr><td>MicroSpin columns</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline hydrolysis buffer, 1.5 x</td><td></td><td></td><td>Mix 1 part 0.1 M Na2CO3 and 9 parts 0.1 M NaHCO3. Add EDTA to 1 mM. Adjust pH to 9.2. Store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>5x poly(A) polymerase buffer</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 3 mM MnCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml acetylated BSA, 50% glycerol</td></tr><tr><td>Biotin binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris&amp;shy;Cl pH 7.5, 2 M NaCl, 0.1% NP&amp;shy;40</td></tr><tr><td>TEN buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris&amp;shy;Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.02% NP&amp;shy;40</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Sequence&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Oligonucleotides according to Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, for GA-IIx and Hiseq2000/2500 sequencers&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Microsynth&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&amp;rsquo; amino&amp;shy; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&amp;shy; 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&amp;rsquo; amino&amp;shy; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#039; (V = G, A or C)</td></tr><tr><td>PCR primer forward, RP1</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAG&lt;br/&gt;TCCGA 3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primer reverse, RPI1, barcode in bold</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; CAAGCAGAAGACGGCATACGAG&lt;br/&gt;
AT&lt;strong&gt;CGTGAT&lt;/strong&gt;GTGACTGGAGTTCCT&lt;br/&gt;
TGGCACCCGAGAATTCCA 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Oligonucleotides according to Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, for HiSeq2000/2500 and NextSeq500 sequencers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (DNA/RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039;-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG&lt;br/&gt;
CTCTTCCrGrAUrC-3&#039;</td></tr><tr><td>HT-rev5A</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT&lt;br/&gt;
CTTCCGATCTNNNN 3&#039;</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers forward (D501-506)</td><td>Microsynth or Illumina</td><td></td><td>5&#039;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT&lt;br/&gt;CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA&lt;br/&gt;CGACGCTCTTCCGATCT -3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers reverse (D701-D712)</td><td>Microsynth or Illumina</td><td></td><td>5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3&#039;</td></tr><tr><td>Documentation for Illumina multiplexing:</td><td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

3' end sequencing library preparation with a-seq2

Estudos na última década têm revelado uma variedade complexa e dinâmica de clivagem pre-mRNA e reações de poliadenilação. mRNAs com tempo de 3' não regiões (UTRs) são gerados em células diferenciadas, Considerando que pilhas proliferating preferencialmente expressam transcrições com curta 3' UTRs. Descrevemos o protocolo A-seq, agora em sua segunda versão, que foi desenvolvido para mapear os sítios de poliadenilação todo o genoma e estudar o Regulamento de pre-mRNA 3' processamento final. Também este protocolo atual aproveita o polyadenylate (poly(A)) caudas que são adicionadas durante a biogênese dos mRNAs mamíferos mais enriquecer para mRNAs totalmente transformados. Um adaptador de DNA com deoxyuracil em sua quarta posição permite o processamento preciso de mRNA 3' final fragmentos para sequenciamento. Não incluindo a cultura de células e a ligadura durante a noite, o protocolo exige cerca de 8 h tempo hands-on. Junto com ele, é fornecido um pacote de software easy-to-use para a análise dos dados de sequenciamento derivada. A-seq2 e o software de análise associado fornecem uma solução eficiente e confiável para o mapeamento de pre-mRNA 3' termina em uma ampla gama de condições, a partir de 106 ou menos células.

Poli (A)-contendo RNA foi isolado de células cultivadas, fragmentadas por hidrólise alcalina e cDNAs foram feitos por reverter a transcrição com primers de oligo (descolamento). O cDNA resultante foi imobilizado em grânulos de estreptavidina, dU foi clivada na reação de excisão específico do uracil, adaptadores estavam ligados a 5' e 3' extremidades do fragmento clivado e as inserções foram sequenciadas. Figura 1 mostra um esquema gráfico do experimento.
Para células HeLa e HEK293, 106 células foram suficientes para identificar sites de poli (a) para a grande maioria dos genes codificantes de proteínas, no final do procedimento. No entanto, para outros tipos de células ou tecidos, pode ser necessário testar a saturação do número de sites identificados poli, como o número de células utilizadas no experimento aumenta. Passo resultados representativos do PCR do piloto e do fragmento de DNA análise da amostra antes de sequenciamento são mostrados na Figura 2.
A Figura 3 mostra as etapas de pré-processamento da análise computacional, a partir do arquivo de fastq obtidos a partir do sequencer e terminando com a qualidade verificada, adaptador-aparado diz que estão pronta a serem mapeados para o genoma. A Figura 4 mostra as etapas de análise que começam com o mapeamento das leituras para o genoma correspondente e o final com o catálogo de mRNA' a extremidade 3 sites que são identificados em uma amostra específica de processamento. Quando múltiplas amostras são analisadas, etapas adicionais são realizadas para coincidir com a extremidade 3' processamento sites que foram encontrados em amostras individuais e relatar sua abundância através de amostras. Estas etapas são mostradas na Figura 5.
Assim, uma vez que as amostras têm sido sequenciadas, a análise da sequência resultante ler arquivos (no formato fastq) por meio do pipeline de processamento disponível é simples. Depois de adicionar as informações sobre as amostras para o arquivo de configuração, a execução do gasoduto irá resultar em dois tipos principais de arquivos de saída: 1) cama-arquivos com todos os 3' acabam o processamento locais identificados em amostras individuais (por exemplo " Sample1.3pSites.noIP.Bed.gz") e 2) um cama-arquivo com clusters de local todos os poli (clusters.merged.bed), através de todas as amostras do estudo. A saída também inclui as coordenadas do genoma para todas as leituras de cada amostra individual (por exemplo, "sample1. STAR_out/aligned.sortedByCoord.out.bam") que mais tarde podem ser visualizados em um navegador de genoma como IGV16. Inspeção visual de FIS a leitura geralmente fornece um primeiro vislumbre da distribuição dos sítios de poli no genoma e as mudanças que ocorrem sobre as perturbações específicas que foram realizadas no estudo. Por exemplo, na Figura 6 é mostrada a resposta de um gene específico para o knock-down da proteína HNRNPC.
Resumos destas distribuições de todo o genoma são também fornecidos (tabela 1). Especificamente, os arquivos de saída no diretório "contagens/annotation_overlap" contêm frações de sites que se sobrepõem com características específicas anotadas (do arquivo gtf fornecido como entrada; anotados são: 3' UTR, terminal exon, exon, intrão, intergênica). Finalmente, para cada amostra, resultados das etapas de processamento individuais também são salvos (por exemplo, "sample1.summary.tsv"). Isso inclui os números de: crus leituras em cada amostra, leituras que têm a estrutura esperada da extremidade 5', leituras que permanecem após o colapso completa duplicatas PCR, alta qualidade lê de acordo com os critérios definidos no passo 9.2, lê o mapa com exclusividade para o genoma (depois de desmaiar aqueles que resultaram dos erros de sequenciamento, consulte a etapa 9.5), mapeamento multi lê (depois de desmaiar aqueles que resultaram dos erros de sequenciamento, consulte a etapa 9.5), sites em cada amostra, cru ' a extremidade 3 sites de processamento de processamento bruto (não-clusterizados) 3' final sem os potenciais candidatos internos de escorva, original 3' terminar processamento sites de todas as amostras sem candidatos de escorva interno e conjunto final de clusters de poli (a) local.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
Figura 1: etapas principais do protocolo A-seq2. Etapas individuais são indicadas no lado esquerdo da figura. Inserir fragmentos de RNA são retratados como linhas verdes que acendem uma luz vermelhas para cDNA após a transcrição reversa; adaptadores são coloridos em azul claro ou laranja. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
Figura 2: piloto do PCR e perfil do produto final. (um) alíquotas da reação de PCR foram coletadas em ciclos diferentes e separaram em gel de agarose 2%. Os números à esquerda indicam tamanho em nucleotídeos das respectivas bandas na escada de DNA. Neste experimento 12 ciclos (*) foram escolhidos para a reação de PCR de grande escala. (b) exemplo de uma amostra após a seleção de tamanho que executar em um analisador de tamanho de fragmento revelando um tamanho médio de cerca de 280 nucleotídeos. Os números à esquerda [FU] indicam a intensidade de sinal relativo. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
Figura 3: esboço do pré-processamento de sequenciamento leituras. Os arquivos fastq com leituras que são gerados pelo software instrumento associado sequenciamento são processados para identificar leituras de alta qualidade que serão mapeadas para o genoma correspondente. A figura mostra a especificação de entrada/saída de etapas individuais no pipeline, com links para os passos individuais do protocolo descrito na seção "Processamento de dados". <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
Figura 4: esboço da sequência ler processamento, desde a etapa de mapeamento de genoma para a geração de final individual 3' processamento sites. A figura mostra a especificação de entrada/saída de etapas individuais no pipeline, com links para o isão etapas do protocolo descrito na seção "Processamento de dados". O arquivo de saída principal que é entregue ao usuário é marcado em negrito. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
Figura 5: contorno das etapas que forem tomadas para gerar clusters de co-são regulados 3' final sequenciamento sites. A figura mostra a especificação de entrada/saída de etapas individuais no pipeline, com links para os passos individuais do protocolo descrito na seção "Processamento de dados". O arquivo de saída principal é marcado em negrito. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
Figura 6: resultados de exemplo do perfil de 3' acabam o processamento leituras ao longo do terminal exon do gene NUP214, mostrado no navegador de genoma de IGV 16 . A-seq2 leituras foram preparadas a partir de duas amostras de células HEK 293, tratadas com um controle-siRNA ou com um HNRNPC siRNA. O lê isso documentado poli sites que foram anotados pelo pipeline análise foram salvos no formato BAM que foi usado como entrada para o navegador do genoma IGV. 3' extremidades de picos de leitura mapeiam de mRNA 3' extremidades que são anotadas em Ensembl. Os perfis indicam um aumento da utilização do longa 3' UTR isoform mediante HNRNPC knock-down. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>si-controle replicar 1</td>
			<td>si-controle replicar 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>identificação: 29765</td>
			<td>identificação: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de leituras crus</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de leituras válidas após aparar e filtragem</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de leituras de mapeamento com exclusividade</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de leituras, mapeamento de múltiplos loci</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de individual 3' terminar processamento sites</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: exemplo de saída do pipeline de análise. Resumos de leituras que foram obtidos em etapas individuais.

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3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Este protocolo descreve um método para mapeamento pre-mRNA' a extremidade 3 sites de processamento.

3' final de preparação da biblioteca com A-seq2 de sequenciamento

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

3-end-sequencing-library-preparation-with-a-seq2

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K visualizações.  University of Basel. Este protocolo descreve um método para mapeamento pre-mRNA' a extremidade 3 sites de processamento.

Vídeo: 3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Genética

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Analisando a dinâmica do tRNA usando AQRNA-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

Autor em destaque: Papel do AQRNA-seq no mapeamento de pequenos RNAs e desvendamento de mecanismos de tradução de proteínas

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

AQRNA-seq para quantificar RNAs pequenos

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

<meta charset="utf8"></head><body>Detectando eventos de clivagem CRISPR-Cas9 fora do alvo com CIRCLE-Seq

CIRCLE-Seq for Interrogation of Off-Target Gene Editing

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of unintended cleavage sites of CRISPR-Cas9 through targeted sequencing of CRISPR-Cas9 cleaved DNA. The protocol involves circularizing genomic DNA (gDNA), which is subsequently treated with the Cas9 protein and a guide RNA (gRNA) of interest. Following treatment, the cleaved DNA is purified and prepared as a library for Illumina sequencing. The sequencing process generates paired-end reads, offering comprehensive data on each cleavage site. CIRCLE-seq provides several advantages over other in vitro methods, including minimal sequencing depth requirements, low background, and high enrichment for Cas9-cleaved gDNA. These advantages enhance sensitivity in identifying both intended and unintended cleavage events. This study provides a comprehensive, step-by-step procedure for examining the off-target activity of CRISPR-Cas9 using CIRCLE-seq. As an example, this protocol is validated by mapping genome-wide unintended cleavage sites of CRISPR-Cas9 during the modification of the AAVS1 locus. The entire CIRCLE-seq process can be completed in two weeks, allowing sufficient time for cell growth, DNA purification, library preparation, and Illumina sequencing. The input of sequencing data into the CIRCLE-seq pipeline facilitates streamlined interpretation and analysis of cleavage sites.

<meta charset="utf8"></head><body>CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

A significant barrier to technologies like CRISPR is the off-target events that can disrupt vital genes. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing' (CIRCLE-seq) is a technique designed to identify unintended cleavage sites. This method maps the genome-wide activity of CRISPR-Cas9 with high sensitivity and without bias.

CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Bioquímica

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

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