Los autores agradecen la Sra. Béatrice Dimitriades para ayuda con el cultivo celular. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional Suiza de ciencia becas #31003A_170216 y 51NF40_141735 (NCCR ARN &#38; enfermedad).

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Los autores no tienen nada que revelar.

La multitud de base y factores auxiliares que intervienen en el proceso de pre-mRNA 3' final se refleja en un paisaje de poliadenilación proporcionalmente complejo. Además, también es sensible a los cambios en otros procesos como la transcripción y splicing de poliadenilación. 3' extremo escote sitios pre-mRNAs se identifican típicamente basado en las colas de poly(A) características que se agregan a los productos de escote 5'. Mayoría de los métodos utiliza iniciadores oligo(dT) de longitudes variables que permiten la conversión específica de poli (A)-que contienen mRNAs a cADN en una reacción de transcripción reversa. Un problema común de este enfoque es cebado interno a las secuencias de A ricos en sitios de clivaje artifactual. Se han propuesto dos métodos que intentan eludir este artefacto en la etapa de preparación de la muestra. En el método de 3P-seq 1, adaptadores se unen específicamente a los extremos de las colas de poly(A) de con ayuda de un oligo de férula seguida parcial digestión Rnasa T1 y transcripción reversa con TTP en la reacción como los Deoxinucleótidos solamente. El heterodúplex resultantes de poly(A)-poly(dT) luego es digeridos con Rnasa H y los restantes fragmentos de RNA aislados, ligados a los adaptadores y secuenciados. Un método más simple y elegante, 2P-seq, que utiliza una cartilla de secuenciación personalizada omitiendo el tramo restante de oligo(dT) en la reacción de secuenciación se informó por los mismo autores 2. En un método relacionado, 3' Lee 3, una cartilla inusualmente larga de 5 nosotros y 45 Ts, que también contiene una biotina es recocidos ARN fragmentado, seguido de lavados rigurosos para seleccionar moléculas de ARN con poly(A) colas de más de 50 nucleótidos. Aunque 3' Lee reduce drásticamente la frecuencia de cebado interno, no completamente elimina lo 3. Protocolos para la secuencia directa del RNA también se han propuesto, pero las lecturas resultantes son cortas y tienen una alta tasa de error y este enfoque no ha sido más desarrollado 18,19,20. La Seq de PolyA y de los protocolos de Quant Seq comercializados combinan oligo(dT) base de cebado con un paso de cebado al azar para el cDNA segunda hebra síntesis 20. El uso de la reacción de transcripción reversa interruptor de plantilla con la transcriptasa reversa de los Virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) conduce a la generación de cDNAs con conectores en un solo paso y así no dímeros adaptador pueden aparecer en los métodos SAPAS y PAS-Seq 21 , 22.
El método A-Sec2 presentamos destaca en su utilización de un nucleótido escindibles (dU) dentro de una cartilla de oligo(dT) biotinilado. Esta modificación combina la utilidad de enriquecer oligo(dT) cruzado por hibridación, contra objetivos con el retiro de la mayoría de la secuencia25 de oligo (dT) de los fragmentos aislados antes de que las bibliotecas están preparadas y la preservación de tres t, que indican la presencia previa de la cola de poly(A). En contraste, los métodos que utilizan la Rnasa H para quitar poly(A) de las moléculas de ARN al azar dejan varios como. Ya que en A-Sec2, la secuencia se realiza desde el extremo 3' de la anti-sentido, sitios de clivaje se predicen que se encuentra después el motivo NNNNTTT al principio de la secuencia cruda Lee. Los tetrámeros aleatorios no sólo sirven para permitir llamar sino también en la eliminación de artefactos de amplificación de PCR de base. UMIs más largas también pueden ser acomodados. La posibilidad de oscurecimiento interno permanece en A-Sec2 y trata de cómputo, en primer lugar descartando 3' termina con una secuencia descendente genómicamente codificados, A ricos y luego descartando 3' final clusters, lo que podrían explicarse por oscurecimiento interno en el Señal de poly(A) ricos A sí mismo. Un análisis reciente de sitios de poly(A) inferida únicamente por un gran número de protocolos indica que los sitios que son únicos a Sec2 A tengan el nucleótido esperado distribución y ubicación dentro de genes, similares a otros 3' extremo protocolos de secuenciación.
Un paso crítico en A-Sec2 es la selección de cofia RNA y el retiro de RNAs ribosomal y varios ARNs pequeños. Esto se hace más fácilmente por un kit de mRNA aislamiento con Perlas magnéticas de oligo (dT)25 . En principio, ARN total aislado con fenol que contienen soluciones también da alta calidad RNA que puede ser más sometido a la selección por el kit de aislamiento de mRNA o agarosa oligo (dT). Un paso que puede variar en A-Sec2 es el tratamiento con hidrólisis alcalina que pueden acortar o extender para obtener fragmentos de ARN de diferentes tamaños. Crítico es también que la adición de dATP 3' a 3' extremos de los fragmentos de RNA por la polimerasa de la poly(A) es eficaz. En el protocolo descrito aquí, este tratamiento se aplica a todos los fragmentos del RNA, para evitar concatemerization durante la reacción de ligadura. Por último, observamos que aunque ligasa RNA 1 se utiliza normalmente como una ligasa de RNA, también ligates eficientemente solo trenzado DNA, como lo hemos hecho aquí para ligar un adaptador en el extremo 5' de las moléculas de cDNA.
Así, A-Sec2 es un eficiente y fácil de implementar el protocolo para la identificación de sitios de procesamiento extremo 3' pre-mRNA. Desarrollos futuros podrían incluir reducir aún más la complejidad del protocolo y la cantidad de material necesario. El conjunto asociado de más herramientas de análisis de datos computacionales permiten el tratamiento homogéneo del extremo 3' secuencia de lecturas obtenidas con una amplia gama de protocolos.

La captura y la secuencia de mRNA 3' extremos permite el estudio del procesamiento de mRNA y la cuantificación de la expresión génica. Debido a sus colas poly(A), mRNAs eucarióticos puede ser eficazmente purificado de lysates de la célula total con cuentas inmovilizadas oligo-deoxythymidine (moléculas de oligo(dT)), que también puede cebar la síntesis de cDNA. Sin embargo, este enfoque tiene dos inconvenientes. Tramos de la A que es internos de las transcripciones pueden también primer síntesis de cDNA, dando por resultado falsas poly(A) sitios. Tramos de poly(A) segundo, homogéneo plantean desafíos específicos para la secuencia, además de no ser informativo para la identificación de la transcripción. Se han propuesto diversos enfoques para sortear estas limitaciones, tales como transcripción reversa a través de poly(A) colas seguidas de digestión Rnasa H ( 1de 3P-seq), el uso de una cartilla de secuenciación personalizada terminando en 20 Ts ( 2de 2P-seq), preselección de Fragmentos de ARN con poly(A) colas de más de 50 nucleótidos con una cartilla de45 CU5T seguido por digestión Rnasa H (3' Lee 3) y el uso de una cartilla de oligo-dT que contiene el adaptador de 3' en una horquilla (seq de A 4).
El recientemente desarrollado A Sec2 método 5 pretende eludir la secuencia a través de poly(A) y al mismo tiempo reducir al mínimo la proporción de dímeros que se generan por la uno mismo-ligadura de adaptadores, que ocurren particularmente cuando la concentración molar de adaptadores compensa la concentración de insertar. Este problema puede eliminarse cuando se unen ambos adaptadores al mismo tipo de Polinucleótido extremos como en A-Sec2, donde los adaptadores de 3' se unen al extremo 5' de fragmentos de ARN y los adaptadores de 5' a 5' extremos de los cDNAs después de reversa de la transcripción. El método es más conveniente que nuestro anteriormente propuesto A-seq - en que la secuencia estaba en el 5'-a-3' dirección por lo que requiere precisamente controlada RNA fragmentación-, manteniendo una alta exactitud de la identificación del sitio de poly(A). Alrededor del 80% de las lecturas secuenciadas en muestras típicas mapa únicamente al genoma y llevar a la identificación de más de 20.000 grupos de sitio poly(A), más del 70% de que se superponen con anotación 3' UTRs.
En Resumen, el protocolo A Sec2 comienza con fragmentación de mRNA y la ligadura de reversa-complemento 3' adaptadores a los extremos 5' de fragmentos de ARN. Poly (A)-que contienen ARN es entonces inversa transcrito con una cartilla de oligo(dT) largo de 25 nucleótidos (nt) que contiene un nucleótido de anclaje en el extremo 3', dU en la posicion 4 y biotina en el extremo 5', permitiendo que enlace del cDNA a granos magnéticos estreptavidina. La mayor parte de la cartilla, incluyendo biotina, se extrae el cDNA por clivaje en dU por la mezcla de enzima de usuario, que contiene uracilo ADN glicosilasa (UDG) y el ADN glicosilasa-liasa Endonuclease VIII. Esta reacción deja intactos extremos de la ligadura de un adaptador de 5' y la izquierda Ts tres después del escote quedan marcar la ubicación de la cola de poly(A). Porque los adaptadores de 5' y 3' se unen por la ligadura a los receptores de 5' extremos, no dímeros de adaptador se generan. Cuatro nucleótidos al azar-mers introducidos en principio Lee permite resolución de cluster en los instrumentos de la secuencia de vanguardia y también puede servir como identificador molecular único (UMI) para la detección y eliminación de artefactos de amplificación de PCR. El tamaño de la UMI puede aumentar más lejos como hace en otros estudios 6. El protocolo genera lecturas que son inversa complementaria al mRNA 3' extremos, todo comienza con un tetrámero aleatorio seguido por 3 Ts. procesamiento de lecturas que tiene el 3 Ts diagnóstico en su 5' final comienza con la corrección de artefactos de amplificación de PCR por explotando las UMIs, eliminación de secuencias 3' de adaptador y revertir la complementación. Dice que pudo haber originado de oligo(dT) cebado en sitios ricos en A internos también se identifican computacionalmente y desechados. Los sitios falsos suelen carecen de uno de los 18 bien caracterizado y poly(A) conservado señales que deben ser ubicado ~ 21 nucleótidos corriente arriba del escote aparente sitio 7.
El protocolo requiere unos 8 h tiempo práctica, sin contar el cultivo celular y las trompas durante la noche. El asociado lee análisis software permite una identificación de sitio de alta precisión poly(A). Desde el sitio de poly(A) clusters crearon basados en 4 muestras más destacadas en esta superposición de 84% del manuscrito (dos réplicas biológicas de siRNA control y células tratadas con si-HNRNPC) con un gen anotado y de éstos, superposición de 75% con un 3' UTR y 86% ya sea con un 3' UTR o un exón terminal. El coeficiente de correlación de Pearson de expresión de los extremos 3' de las muestras replicadas es 0,92, y por lo general se obtienen valores de sobre 0.9 con el método. Así, A-Sec2 es un método práctico que da resultados muy reproducibles.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, ultra pure</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Cordycepin triphosphate (3&amp;rsquo; dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>DNA low bind vials, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>GR-Green dye</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>use 1:10,000 dillution</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 or NextSeq 500 next generation sequencers</td><td>Illumina</td><td>inquire with supplier</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA polymerase mix</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, yeast</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>Polynucleotide kinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNA ligase 1, high concentration</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M</td><td>includes PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute RNA Cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV reverse transcriptase</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USER enzyme mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 magnetic rack</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Heated mixer with heated lid</td></tr><tr><td>MicroSpin columns</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline hydrolysis buffer, 1.5 x</td><td></td><td></td><td>Mix 1 part 0.1 M Na2CO3 and 9 parts 0.1 M NaHCO3. Add EDTA to 1 mM. Adjust pH to 9.2. Store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>5x poly(A) polymerase buffer</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 3 mM MnCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml acetylated BSA, 50% glycerol</td></tr><tr><td>Biotin binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris&amp;shy;Cl pH 7.5, 2 M NaCl, 0.1% NP&amp;shy;40</td></tr><tr><td>TEN buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris&amp;shy;Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.02% NP&amp;shy;40</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Sequence&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Oligonucleotides according to Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, for GA-IIx and Hiseq2000/2500 sequencers&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Microsynth&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&amp;rsquo; amino&amp;shy; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&amp;shy; 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&amp;rsquo; amino&amp;shy; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#039; (V = G, A or C)</td></tr><tr><td>PCR primer forward, RP1</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAG&lt;br/&gt;TCCGA 3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primer reverse, RPI1, barcode in bold</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; CAAGCAGAAGACGGCATACGAG&lt;br/&gt;
AT&lt;strong&gt;CGTGAT&lt;/strong&gt;GTGACTGGAGTTCCT&lt;br/&gt;
TGGCACCCGAGAATTCCA 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Oligonucleotides according to Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, for HiSeq2000/2500 and NextSeq500 sequencers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (DNA/RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039;-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG&lt;br/&gt;
CTCTTCCrGrAUrC-3&#039;</td></tr><tr><td>HT-rev5A</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT&lt;br/&gt;
CTTCCGATCTNNNN 3&#039;</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&#039; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers forward (D501-506)</td><td>Microsynth or Illumina</td><td></td><td>5&#039;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT&lt;br/&gt;CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA&lt;br/&gt;CGACGCTCTTCCGATCT -3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers reverse (D701-D712)</td><td>Microsynth or Illumina</td><td></td><td>5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3&#039;</td></tr><tr><td>Documentation for Illumina multiplexing:</td><td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

3' end sequencing library preparation with a-seq2

Estudios en la última década han revelado una variedad compleja y dinámica de reacciones de poliadenilación y escote de pre-mRNA. mRNAs con largas regiones 3' no traducidas (UTRs) se generan en las células diferenciadas que proliferar las células expresan preferentemente transcripciones con corta 3' UTRs. Describimos el protocolo A-seq, ahora en su segunda versión, que fue desarrollado para asignar sitios de poliadenilación genoma y estudiar la regulación del proceso de pre-mRNA 3' final. También aprovecha este protocolo actual de Poliadenilato (colas de poly(A)) que se agregan durante la biogénesis de los mRNAs mamíferos más para enriquecer de mRNAs completamente procesados. Un adaptador de ADN con deoxyuracil en su cuarta posición permite que el proceso exacto de mRNA 3' final fragmentos de la secuencia. No incluye el cultivo de células y las trompas durante la noche, el protocolo requiere unos 8 h tiempo práctica. Junto con él, se proporciona un paquete de software fácil de usar para el análisis de los datos derivados de la secuencia. A-Sec2 y el software de análisis asociadas proporcionan una solución eficiente y confiable para la asignación del pre-mRNA 3' termina en una amplia gama de condiciones del 106 o menos células.

Poly (A)-que contiene el RNA fue aislado de las células cultivadas, fragmentadas por hidrólisis alcalina y cDNAs se hicieron por revertir la transcripción con las cartillas de oligo(dT). El ADNc resultante fue inmovilizada en granos de estreptavidina, dU fue hendida en la reacción de supresión específica de uracilo, adaptadores fueron ligados a 5' y 3' extremos del fragmento troceado y los rellenos fueron ordenados. La figura 1 muestra un esquema gráfico del experimento.
Para las células HeLa y HEK293, 106 células fueron suficientes para identificar los lugares de poly(A) para la gran mayoría de genes de la proteína-codificación al final del procedimiento. Sin embargo, para otros tipos de células o tejidos puede ser necesario probar la saturación en el número de sitios identificados poly(A) como el número de células utilizadas en el experimento aumenta. Resultados representativos de la PCR piloto paso y del fragmento de ADN, análisis de la muestra antes de la secuencia se muestran en la figura 2.
La figura 3 muestra los pasos de preprocesamiento del análisis computacional, a partir del fichero fastq obtenidos desde el secuenciador y terminando con la marcada calidad, tapizados en adaptador Lee que están dispuesta a asignar al genoma. La figura 4 muestra los pasos de análisis que comienza con la asignación de las lecturas al genoma correspondiente y al final con el catálogo de lugares que se identifican en una muestra particular de procesamiento extremo 3' mRNA. Cuando se analizan las muestras múltiples, pasos adicionales se llevan a cabo a coincida con el extremo 3' sitios que fueron encontrados en las muestras individuales de procesamiento e informe su abundancia a través de las muestras. Estos pasos se muestran en la figura 5.
Así, una vez que las muestras han sido secuenciadas, el análisis de la secuencia que resulta leer los archivos (en formato fastq) a través de la canalización de procesamiento disponible es sencillo. Después de agregar la información sobre las muestras para el archivo de configuración, la ejecución del gasoducto dará como resultado dos tipos principales de archivos de salida: 1) cama-archivos con todos 3' extremo procesamiento de sitios identificados en muestras individuales (p. ej. " sample1.3pSites.noIP.Bed.gz") y 2) un archivo de cama con los racimos de sitio poly(A) (clusters.merged.bed) a través de todas las muestras del estudio. La salida también incluye las coordenadas de genoma de todas las lecturas de cada muestra individual (e.g. "sample1. STAR_out/aligned.sortedByCoord.out.Bam") que luego podrás visualizar en un navegador de genoma como IGV16. Inspección visual de los perfiles leerlas generalmente proporciona un primer vistazo de la distribución de los sitios de poly(A) en el genoma y los cambios que ocurren en las perturbaciones específicas que se llevaron a cabo en el estudio. Por ejemplo, en la figura 6 se muestra la respuesta de un gen específico a la precipitación de la proteína HNRNPC.
Resúmenes de estas distribuciones del genoma también se ofrecen (cuadro 1). Específicamente, los archivos de salida en el directorio "cuentas/annotation_overlap" contienen fracciones de sitios que se solapan con las características anotadas (desde el archivo gtf proporcionado como entrada, anotado son: 3' UTR, exón terminal, exón, intrón, intergénico). Finalmente, para cada muestra, resultados de pasos de proceso individuales también se guardan (por ejemplo, "sample1.summary.tsv"). Esto incluye los números de: Lee cruda en cada muestra, dice que tienen la estructura esperada del extremo 5', dice que quedan tras sufrir un colapso completos duplicados de la polimerización en cadena, alta calidad Lee según los criterios definidos en el paso 9.2, lee el mapa únicamente para el genoma (tras sufrir un colapso que dio como resultado de errores de secuencia, ver paso 9.5), asignación de múltiples Lee (tras sufrir un colapso que dio como resultado de errores de secuencia, ver paso 9.5), crudo (no agrupado) 3' extremo sitios en cada muestra, cruda 3' extremo sitios de procesamiento de procesamiento sin candidatos de oscurecimiento interno, único 3' extremo sitios de procesamiento de las muestras sin candidatos cebado interno y el conjunto final de grupos de sitio de poly(A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
Figura 1: pasos principales del Protocolo A Sec2. Pasos individuales se indican en el lado izquierdo de la figura. Insertar fragmentos de ARN se representan como líneas verdes que rojos de cDNA después transcripción inversa; adaptadores son de color azul claro o naranja. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
Figura 2: piloto de PCR y el perfil del producto final. (un) alícuotas de la reacción de PCR se recolectaron en diferentes ciclos y separaron en geles de agarosa al 2%. Números a la izquierda indican el tamaño en nucleótidos de las respectivas bandas en la escalera de ADN. En este experimento se eligieron 12 ciclos (*) para la reacción de polimerización en cadena a gran escala. (b) ejemplo de una muestra después de la preselección en un analizador de tamaño de fragmento revela un tamaño medio de unos 280 nucleótidos. Números a la izquierda [FU] indican la intensidad relativa de la señal. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
Figura 3: esquema de tratamiento previo de la secuenciación Lee. Se procesan los archivos fastq con lecturas que son generados por el software de secuenciación asociadas instrumento para identificar lecturas de alta calidad que se asignan al genoma correspondiente. La figura muestra la especificación de entrada y salida de cada paso en la tubería, con enlaces a cada paso del protocolo descrito en la sección "Procesamiento de datos". <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
Figura 4: esquema de la secuencia Lee proceso, del paso de asignación el genoma a la generación del extremo 3' individuales sitios de procesamiento. La figura muestra la especificación de entrada y salida de cada paso en la tubería, con enlaces a la iindividual pasos del protocolo que se describe en la sección "Procesamiento de datos". El archivo de salida principal que se entrega al usuario está marcado en negrita. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
Figura 5: esquema de los pasos que se toman para generar racimos de extremo Co regulada 3' secuencia sitios. La figura muestra la especificación de entrada y salida de cada paso en la tubería, con enlaces a cada paso del protocolo descrito en la sección "Procesamiento de datos". El archivo de salida principal está marcado en negrita. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
Figura 6: resultados del ejemplo del perfil de 3' extremo procesamiento Lee a lo largo del terminal exón del gene de NUP214, se muestra en el navegador de genoma IGV 16 . Se prepararon A Sec2 Lee de dos muestras de células de HEK 293, tratadas con un siRNA control o con un siRNA HNRNPC. La lee que poly(A) sitios que fueron anotados por la tubería del análisis se guarda en formato BAM que se utilizó como entrada para el browser del genoma IGV. Los extremos 3' de los picos de lectura mapa al mRNA 3' extremos que se anotan en el Ensembl. Los perfiles indican un uso creciente de la isoforma larga 3' UTR con HNRNPC precipitación. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Si Control repetición 1</td>
			<td>repetición si Control 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ID: 29765</td>
			<td>ID: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de lecturas raws</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de lecturas válidas después de recortar y filtrado</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de asignación únicamente Lee</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de lecturas a múltiples loci</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de los 3' extremo sitios de procesamiento</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: ejemplo de salida de la tubería análisis. Resúmenes de lecturas que se obtuvieron en pasos individuales.

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3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Este protocolo describe un método para asignación pre-mRNA 3' final sitios de procesamiento.

Extremo 3' secuencia biblioteca elaboración con Sec2 A

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

3-end-sequencing-library-preparation-with-a-seq2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K vistas.  University of Basel. Este protocolo describe un método para asignación pre-mRNA 3' final sitios de procesamiento.

Video: 3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Investigación

Genética

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Análisis de la dinámica del ARNt mediante AQRNA-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

Autor destacado: El papel de AQRNA-seq en el mapeo de ARN pequeños y el desentrañamiento de los mecanismos de traducción de proteínas

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

<meta charset="utf8"></head><body>Detección de eventos de escisión de CRISPR-Cas9 fuera del objetivo con CIRCLE-Seq

CIRCLE-Seq for Interrogation of Off-Target Gene Editing

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of unintended cleavage sites of CRISPR-Cas9 through targeted sequencing of CRISPR-Cas9 cleaved DNA. The protocol involves circularizing genomic DNA (gDNA), which is subsequently treated with the Cas9 protein and a guide RNA (gRNA) of interest. Following treatment, the cleaved DNA is purified and prepared as a library for Illumina sequencing. The sequencing process generates paired-end reads, offering comprehensive data on each cleavage site. CIRCLE-seq provides several advantages over other in vitro methods, including minimal sequencing depth requirements, low background, and high enrichment for Cas9-cleaved gDNA. These advantages enhance sensitivity in identifying both intended and unintended cleavage events. This study provides a comprehensive, step-by-step procedure for examining the off-target activity of CRISPR-Cas9 using CIRCLE-seq. As an example, this protocol is validated by mapping genome-wide unintended cleavage sites of CRISPR-Cas9 during the modification of the AAVS1 locus. The entire CIRCLE-seq process can be completed in two weeks, allowing sufficient time for cell growth, DNA purification, library preparation, and Illumina sequencing. The input of sequencing data into the CIRCLE-seq pipeline facilitates streamlined interpretation and analysis of cleavage sites.

<meta charset="utf8"></head><body>CIRCLE-SEQ para la interrogación de la edición de genes fuera del objetivo

A significant barrier to technologies like CRISPR is the off-target events that can disrupt vital genes. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing' (CIRCLE-seq) is a technique designed to identify unintended cleavage sites. This method maps the genome-wide activity of CRISPR-Cas9 with high sensitivity and without bias.

CIRCLE-SEQ para la interrogación de la edición de genes fuera del objetivo

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Bioquímica

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Gel-seq: Un método para la preparación de biblioteca simultánea de secuenciación de DNA y RNA utilizando Matrices de hidrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

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Resumen

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CIRCLE-SEQ para la interrogación de la edición de genes fuera del objetivo

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