We are supported by the University of Wisconsin-Madison Medical School start-up (A.V.G.).

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (NIH Pub. No. 80-23). Tutti i metodi e protocolli utilizzati in questi studi sono stati approvati da The University of Wisconsin cura degli animali e Usa Comitato protocollo seguendo le Linee guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio pubblicati da NIH (pubblicazione n ° 85-23, revisionato 1996). Tutti gli animali utilizzati in questo studio hanno ricevuto la cura umana nel rispetto della Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. 1. Rimozione Cuore e Langendorff perfusione <ol><li> Prima di isolamento cuore, soluzione Tyrode riscaldare a 37 ° C utilizzando un bagno di acqua e una camicia d&#39;acqua. </li><li> Anestetizzare il mouse con il 5% isoflurano / 95% O 2. </li><li> Garantire un livello adeguato di anestesia controllando la perdita del dolore riflesso. </li><li> Eseguire la toracotomia. Aprite la cassa, utilizzando curve 5.5 &quot;forbici Mayo e 5.5&quot; Kelly emostatico perceps Per fare un 1 cm tagliato sulla parte anteriore del torace. <ol><li> estrarre rapidamente il cuore dal petto (entro 30 secondi). Utilizzare 4 &quot;pinze curve Iris per afferrare il tessuto polmonare e tagliare il polmone, il timo e il cuore insieme con il pericardio con 4.3&quot; forbici Iris. Non afferrare direttamente il cuore. </li><li> Lavare in ossigenata (95% O 2/5% di CO 2), a temperatura costante (36.8 ± 0.4 ° C) ha modificato la soluzione di Tyrode. Utilizzare la seguente composizione della soluzione (in mM): NaCl 128,2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1.05 MgCl 2, 1.3 CaCl 2, 20.0 NaHCO 3, e 11,1 glucosio (pH 7,35 ± 0,05). </li></ol></li><li> Mentre immersa nella stessa soluzione, identificare il polmone, timo e tessuto adiposo. li sezionare con cura dal cuore. Utilizzare curvo 3 &quot;forbici Vannas-Tubinga e 4.3&quot; # 5 pinze. </li><li> Quindi individuare l&#39;aorta e cannulate è su una cannula 21 G su misura. Utilizzare due curve 4.3 &quot;forza # 5Bps. </li><li> Dopo incannulazione, contemporaneamente defluire in (attraverso la cannula ad una portata di ~ 5 ml / min; questo dovrebbe essere regolata in base alla pressione aortica, vedi sotto) e superfuse (nel bagno ad una portata di ~ 50 ml / min) cuore con soluzione Tyrode riscaldato e filtrata durante l&#39;intero esperimento. Far passare la soluzione di perfusione attraverso un filtro di nylon 11 micron di linea per evitare l&#39;intasamento della circolazione coronarica. </li><li> Utilizzando un trasduttore di pressione (o un manometro) collegato attraverso un rubinetto a 3 vie Luer serratura alla linea di perfusione, monitorare la pressione aortica e mantenerlo tra 60 e 80 mmHg. Regolare la velocità di perfusione se necessario per mantenere la pressione aortica all&#39;interno di questa gamma. </li></ol> 2. mappatura ottica del SAN dalla Langendorff-perfuso cuore intero <ol><li> Strumentazione <ol><li> Posizionare cuore orizzontalmente e il pin del ventricolo al fondo siliconato della camera usando 0,1 mm perni diametro prevent flusso indotta movimento durante l&#39;esperimento. 12 </li><li> Inserire un piccolo ( &quot;ID x .005&quot; .012) tubo di silicone nel ventricolo sinistro (LV) attraverso la vena polmonare, gli atri sinistro (LA) e la valvola mitrale (MV). Fissare il tubo con una sutura di seta (4-0) al tessuto connettivo suono. </li><li> Posizionare il cuore con il lato posteriore rivolto verso l&#39;alto (figura 1A, pannello di sinistra). </li><li> Pin il bordo dell&#39;appendice RA (RAA) al fondo di silicio della camera con diametro 0,1 mm perni minutien. Regolare il livello al fine di rendere la superficie posteriore del RA piatta e permettono di essere situato piano focale della fotocamera. Ciò consentirà misure ottiche della superficie massima dell&#39;atrio. </li><li> Noose superiore (SVC) ed inferiore (IVC) vena cava da una sutura di seta (4-0), allungare e pin l&#39;altra estremità della sutura al fondo di una camera siliconato (Figura 3A). Assicurarsi che i punti di sutura non bloccano lacampo di vista ottico. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo di stimolazione misura sul bordo del RAA. Per elettrodi, uso di silicio rivestito fili diametro argento di 0,25 mm, con 0,5 mm di distanza inter-elettrodo e privo di silicone per una lunghezza di 1 mm al fine di stimolazione. Poi posto due ECG 12 millimetri ago (29-gauge) elettrodi monopolari vicino alla base del ventricolo destro e sinistro. Posizionare l&#39;elettrodo ECG terra vicino all&#39;apice dei ventricoli. </li></ol></li><li> colorazione <ol><li> Poiché entrambi i coloranti fluorescenti e disaccoppiatore blebbistatin elettromeccanico sono sensibile alla luce, eseguire tutte le procedure descritte qui di seguito in una stanza buia. Prima preparare dye voltage-sensitive RH-237 o di-4-ANNEPS come una soluzione madre, 1,25 mg / ml in dimetilsolfossido (2,5 mM), un&#39;aliquota esso (30 ml ciascuna) e conservare le aliquote a -20 ° C. </li><li> Diluire 5-10 ml di soluzione colorante magazzino in 1 ml di riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode e poi iniettare nella linea di perfusione coronaricaper un periodo di 5-7 minuti usando una porta di iniezione in linea Luer. </li><li> Preparare blebbistatin come una soluzione madre (2 mg / ml in dimetilsolfossido, 6,8 mM) in anticipo e conservarlo a 4 ° C. </li><li> Dopo 20 min di stabilizzazione aggiungere 0,5 ml di riscaldato (37 ° C) blebbistatin nel perfusato e diluire 0,1 ml di blebbistatin in 1 ml di riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode. Poi iniettare nella linea di perfusione coronarica in un periodo di 5-7 minuti usando una porta di iniezione in linea Luer. </li></ol></li></ol> 3. mappatura ottica del SAN dalla isolata atriale Preparazione <ol><li> Strumentazione <ol><li> Per la preparazione atriale isolata, isolare e cannulate cuore come descritto nei passaggi 1,1-1,5 per la preparazione intero cuore. </li><li> Sezionare i ventricoli lontano dal lato anteriore. Vedere la figura 1A, pannello di destra, tagliare 1 ° posto per i dettagli. </li><li> Aprire il RA, tagliando attraverso la va tricuspidelve (TV) lungo l&#39;asse TV SVC. Vedere la figura 1A, pannello di destra, tagliare # 2 per i dettagli. </li><li> Tagliare l&#39;arto mediale del crista terminalis per aprire il RAA. Vedere la figura 1A, pannello di destra, tagliare 3 #. </li><li> Aprire la parete libera atriale anteriore eseguendo un taglio dalla linea mediana del precedente taglio # 3 al bordo del basso a destra del RAA, appiattire e pin parete libera atriale al fondo di una camera di silicio rivestito. Vedere la direzione indicata dalla freccia bianca in figura 1A, tagliare 4 #. Conserva un bordo di tessuto ventricolare di spinatura la preparazione per evitare danni al atri. </li><li> Allo stesso modo, aperto LA tagliando attraverso la MV lungo l&#39;angolo MV-superiore del appendice LA (LAA). </li><li> Per aprire la LAA, tagliare a partire dalla metà del LAA aperto, attraverso la parete libera atriale anteriore fino in prossimità di un bordo mezzo della LAA. </li><li> Aprire il atriale alo parete libera anterioreng stessa direzione, quindi appiattire e il pin per il fondo di una camera Sylgard rivestite. </li><li> Parzialmente rimuovere il tessuto del setto interatriale. Questo riduce la dispersione del segnale ottico da tessuto che non è a fuoco. Pertanto, sia il LA e RA, nonche la SAN e giunzione atrio-ventricolare (AVJ) sono accessibili in questa preparazione (Figura 1B). </li><li> Sollevare la preparazione finale di circa 0,5 mm dal fondo della camera siliconato per permettere superfusione da entrambe le superfici epicardici ed endocardici. </li><li> Superfuse preparato con riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode ad una velocità costante di ~ 12 ml / min per un flusso mirato situato vicino alla SVC e ~ 30 ml / min per un superfusione vasca. </li><li> Posizionare il Ag / AgCl 2 elettrodi di stimolazione su misura (0,25 mm di diametro) sul bordo del RAA sezionato. Poi posto due ECG 12 millimetri ago (29G) elettrodi (monopolare) vicino al RAA e LAA, rispettivamente. Posizionare il terreno ECG elettiha guidato vicino al AVJ. </li></ol></li><li> colorazione <ol><li> Eseguire una diretta applicazione del colorante di tensione-sensibili (RH-237 o di-4-ANNEPS). Per questo, diluire 1-2 microlitri della soluzione di colorante in magazzino 1 mm di riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode e rilasciare lentamente il colorante diluito sulla superficie del preparato utilizzando una pipetta 1 mm. </li><li> In alternativa, eseguire la colorazione atriale con il colorante tensione sensibile attraverso una perfusione coronarica del cuore Langendorff-perfuso simile a quello sopra descritto per la preparazione intero cuore (gradini 2.2.1-2.2.2). <ol><li> Dopo la colorazione perfusione coronarica, isolare la preparazione atriale come descritto. Eseguire ulteriore colorazione della superficie in caso di necessità di raggiungere un livello di fluorescenza soddisfacente. isolamento atriale rapida non candeggiare il colorante e non influenza la qualità della colorazione. </li></ol></li><li> Immobilizzare la preparazione con l&#39;elettro-meccanico di sganciamento, blebbistatin. Diluire 3-5 ml blebbistatin soluzione madre nella (37 ° C) Soluzione Tyrode riscaldato e rilasciare lentamente il blebbistatin diluito sulla superficie della preparazione e della soluzione circostante. Poiché blebbistatin ha dimostrato di essere sensibile alla luce, 13,14 evitare lunga esposizione alla luce durante la preparazione e la colorazione. </li><li> Eseguire applicazioni aggiuntive blebbistatin quanto necessario per sopprimere la contrazione. Normalmente fino a 3 applicazioni aggiuntive (3-5 microlitri per ogni applicazione) possono essere utilizzati per sopprimere l&#39;artefatto di movimento sufficiente per ricostruire con precisione SAN e l&#39;attivazione atriale. </li><li> Aggiungere aggiungono 0,5 ml di blebbistatin riscaldato in perfusato. Durante questa procedura, mettere in pausa il superfusione per 30 secondi per permettere il colorante / blebbistatin per macchiare il tessuto atriale. </li></ol></li></ol> 4. mappatura ottica Set Up NOTA:. Una descrizione dettagliata del sistema di mappatura ottica è fornito altrove 12 <ol><li> Utilizzare una fotocamera con un TEMrisoluzione porale di 2.000 fotogrammi / sec o superiore, e una serie di lenti condensatrici raggiungere risoluzione spaziale di 100 pm / pixel o superiore. Questo è necessario per ricostruire attivazione SAN e propagazione intranodale. </li><li> Per ridurre il moto manufatto dalla soluzione vibrante, fissare un piccolo vetro di copertura sulla superficie della soluzione sulla preparazione atriale cuore / isolato. </li><li> Utilizzare luce di eccitazione (520 ± 45 nm) fornita da una corrente costante, lampada alogena a basso rumore. Dirigere il fascio di luce filtrata sulla preparazione utilizzando una guida di luce biforcato flessibile. </li><li> Filtrare la fluorescenza emessa da un filtro passa lungo (&gt; 715 nm). Raccogliere, digitalizzare e salvare il segnale fluorescente acquisito su un computer utilizzando il software fornito dal produttore della fotocamera. </li></ol> 5. Data Processing Nota: I dati mappatura ottica vengono raccolti e conservati come una serie di matrici di intensità fluorescente in diversi momenti. Ogni represe pixelNTS una misura di intensità della fluorescenza raccolti da una posizione specifica sulla preparazione dei tessuti in un punto temporale specifico. Fluorescenza di fondo viene rimosso automaticamente per pixel per consentire una migliore visualizzazione delle variazioni di fluorescenza indotte da variazioni di tensione della membrana e dall&#39;alto in basso per corrispondere con potenziali d&#39;azione (AP) misurati da sistemi di microelettrodi. I dettagli delle varie fasi di elaborazione dei dati di imaging ottico, tra cui la segmentazione delle immagini, filtraggio spaziale, il filtraggio temporale, e la rimozione deriva della linea di base, sono previsti nella revisione mirata. 15 <ol><li> Manualmente o utilizzando l&#39;algoritmo speciale (per esempio, un rilevamento soglia o fronte) 15 per determinare i confini dei tessuti, creare una maschera binaria di 1 (pixel incluse) e 0 (pixel esclusi) e applicare la maschera per ogni fotogramma della sequenza. Questo processo crea un&#39;immagine binaria che evidenzia le aree di interesse per ulteriori elaborazioni. </li><li> Per migliorare il rapporto segnale-rumore del optdati iCal, filtrano i segnali all&#39;interno delle aree selezionate di interesse. Per questo, utilizzare spaziale (media di pixel fluorescenti adiacenti quali definite da un bidone convoluzione desiderato o kernel, ad esempio 3 x 3 o, per i dati rumorosi, 5 x 5) e / o filtro temporale (per esempio, Butterworth, tipo Chebyshev 1, tipo 2 Chebyshev, ellittico, ecc) (Figura 2). Tenete a mente la possibilità di artefatti filtrati indotta quando si interpretano i dati. Per maggiori dettagli, vedi recensione. 15 </li><li> Rimuovere deriva della linea di base in registrazioni ottiche quando necessario (utilizzando filtro passa-alto o raccordo polinomio al segnale originale) e quindi normalizzare ogni segnale pixel da 0 (fluorescenza minima) a 1 (fluorescenza massima). </li><li> Selezionare una finestra temporale che comprende i tempi di attivazione di tutti i pixel per una singola propagazione AP. Assegnare ad ogni pixel il suo tempo di attivazione come il momento di massima derivata salita (dF / dt max, dove F è fluorescenintensità ce). Utilizzando tutti i tempi di attivazione del pixel, ricostruire la mappa di attivazione isochronal. Ogni isochron mostrerà quindi i pixel attivati ​​contemporaneamente. </li><li> Per ricostruire la mappa di distribuzione durata AP (APD), per ciascun pixel calcolare la durata tra il tempo di attivazione e il tempo ad un livello specifico di ripolarizzazione (ad esempio, al 80% di ripolarizzazione, APD 80). Utilizzando tutti i valori dei pixel APD, ricostruire la distribuzione mappa isocrona APD. Ogni Isochron mostrerà quindi i pixel con lo stesso APD. </li><li> Per calcolare la velocità di conduzione per AP propagazione, montare una superficie di preparazione ai dati in tempo di attivazione calcolati in 5.4. Per questo, utilizzare la superficie polinomiale di montaggio o locale levigatura della superficie del kernel e quindi calcolare vettori di velocità di conduzione locali dalla pendenza della superficie accoppiata. </li><li> Per creare la mappa ripolarizzazione, assegnare ciascun pixel suo tempo ripolarizzazione, definito come la derivata seconda massimo (d 2 F / dt2) del segnale ottico alla fine del OAP, o il tempo del 90% ripolarizzazione. </li></ol>

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No conflicts of interest are declared.

Qui, abbiamo presentato due tipi di preparazioni del mouse SAN: 1) intatto SAN nel cuore tutta la Langendorff-perfusione, e 2) SAN nella isolato, aperto preparazione atriale. Questi due tipi di elaborazione hanno diversi scopi sperimentali. Nella preparazione tutto il cuore Langendorff-perfuso, la struttura atriale intatta viene preservata che rende possibile studiare aritmie atriali complesse come la fibrillazione atriale e interazioni tra SAN e atrio durante le tachiaritmie rientranti. 6 Al contrario, nella preparazione atriale isolata , l&#39;atrio viene aperto e appiattito in una pseudo due struttura tridimensionale in cui sono disturbati tridimensionale fasci anatomiche. Questo può influenzare l&#39;anatomia delle vie rientranti che rende la preparazione atriale isolata non è l&#39;ideale per lo studio aritmogenesi atriale. Tuttavia, utilizzando questo tipo di preparazione, la posizione del pacemaker leader (s) siti, conduzione intranodale e AP propagazione pattern può essere accuratamente visualizzato e studiato in dettaglio. Inoltre, atri intatti sembrano essere limitati da una vista posteriore, mentre nella preparazione isolato, l&#39;intera superficie atriale è disponibile per la mappatura ottica. Inoltre, isolato preparazione atriale consente mappatura strutturale-funzionale dell&#39;atrio risolvendo il complesso microstruttura della rete trabecolare, come mostrato nella figura 4. Per questo, elevata spaziale (100 micron / pixel o superiore) e temporale (2.000 fps o superiore) risoluzioni dovrebbe essere usato perché è fondamentale per entrambe le particularize pattern di attivazione atriale e SAN, che potrebbe essere ulteriormente sovrappongono con le corrispondenti strutture. Mentre 1.000 fps risoluzione temporale può essere un minimo di ricostruire l&#39;attivazione atriale (che dura per 10 - 20 msec), 2,000 fps dovrebbe essere considerata come una risoluzione temporale minima per la conduzione intranodale (che dura per ~ 5 ms e quindi potrebbe essere perso in basso risoluzioni) e SAN attomisurazioni ivation come si vede dalla figura 4. Ciò può consentire la localizzazione di aritmogeni &quot;punti caldi&quot; (come ad esempio foci ectopica o rientro ancorato) durante fibrillazione atriale / flutter che potrebbe emergere dalla sovrapposizione delle regioni di notevole rimodellamento funzionale con quelle di fibrosi elevata e / o ridotta cella-a-cella di accoppiamento. 21,22 Inoltre, l&#39;approccio descritto potrebbe essere utilizzato per studiare i meccanismi elettrofisiologici di anomalie SAN, compresi i blocchi SAN uscita, pause, aritmie tachicardia-bradicardia, sindrome del seno malato, ecc. Introducendo un secondo (o anche una terza) sonda fluorescente, sarà possibile effettuare la mappatura ottica multi-parametrica dell&#39;attività elettrica in associazione con il trattamento di calcio e metaboliche e altre modifiche. Diverse combinazioni di coloranti possono essere usati per simultanea tensione calcio, raziometrico tensione / calcio o mitocondriale potenziale imaging. Per l&#39;alta mappatura ottica risoluzione temporale, a causa del periodo di raccolta fluoroforo breve, i segnali di un debole rapporto segnale-rumore possono essere apprezzati. Pertanto, un regime di media viene applicata ai segnali ritmo cardiaco sinusale o segnali di stimolazione serie come necessario. Il dF / dt max viene rilevato per ciascun segnale in un lungo periodo di registrazione. Questi punti di tempo di attivazione sono poi allineati. Un periodo di assestamento di registrazione centrato in questi momenti viene tagliato e media da tutto o selezionata Aps, a seconda delle necessità. Con l&#39;utilizzo accurato della strumentazione e la procedura di colorazione adeguata, parametri elettrofisiologici atriali tra cui la velocità di conduzione (confrontare le figure 3C e 4D per le mappe di attivazione S1), spontanea ritmo SAN e la longevità della preparazione SAN (Figura 5) non sono interessati, che rimangono stabili per 3 o più ore. È importante sottolineare che il Monit continuaoring di ECG deve essere eseguita utilizzando l&#39;intera procedura di colorazione per garantire la normale funzione elettrica del cuore. L&#39;applicazione di blebbistatin può indurre un transitorio rallentamento della frequenza cardiaca, ma a parte questo, non induce alcun spostamenti leader siti di pacemaker o modifiche AP morfologia come è stato anche descritto in precedenza. 13 Superficie colorazione della preparazione atriale isolata è un passaggio fondamentale. Per questo, rapida applicazione del colorante diluito sulla superficie del tessuto deve essere evitato; invece il colorante dovrebbe cadere sulla preparazione liberamente grazie alla maggiore densità di DMSO, che utilizzato sia per tintura e diluizioni blebbistatin. L&#39;importo totale di carico adeguato e della velocità devono essere regolati in modo da non provocare drammatici cambiamenti della frequenza cardiaca. La procedura di colorazione può essere applicato più volte fino a quando il segnale raggiunge un livello ragionevole. Va osservato che l&#39;applicazione diretta di colorante potrebbe danneggiare il tessuto SAN e pregiudicarne le pacemaking. Pertanto, il colorante deve essere diluita e la quantità applicata deve essere attentamente controllato. Appropriata colorazione della superficie non deve danneggiare la preparazione o SAN 23 che viene valutata la frequenza cardiaca comparabili e velocità di conduzione. protocolli di colorazione alternativi devono essere anche considerati. Questi possono includere sia 10-15 min superfusione del preparato SAN / atriale con il colorante tensione-sensibili (RH-237 o di-4-ANEPPS) a 35 ± 1 ° C 10,19 o 30 min di incubazione del preparato a temperatura ambiente (20-22 ° C) in una soluzione di Tyrode contenente l&#39;indicatore di tensione-sensibili. 11 Per mappatura ottica del SAN dal cuore tutta Langendorff-perfuso, passi importanti strumentazione includono l&#39;inserimento del tubetto nella LV e la chiusura di SVC e IVC. L&#39;ex impedisce un aumento della pressione da congestione soluzione durante gli esperimenti a lungo termine, così come la successiva isviluppo schemia dopo la soppressione delle contrazioni ventricolari da blebbistatin e l&#39;acidificazione della soluzione di perfusione. Quest&#39;ultima permette RA di mantenere un certo livello di pressione intra-atriale riempiendo l&#39;atrio con soluzione di perfusione e appiattendo la regione intercaval al fine di scoprire l&#39;intera area SAN per mappatura ottica. Infine, colorazione coronarica, in aggiunta alla superficie colorante di caricamento, potrebbe migliorare sensibilmente l&#39;intensità delle SAN OAPs che può durare più a lungo rispetto alla colorazione pura superficie utilizzata negli studi precedenti. 8,9 Uso di blebbistatin ha molteplici vantaggi rispetto ad altri uncouplers elettromeccanici compresi bassa tossicità, effetti collaterali meno pronunciati, e resistenza washout quando viene utilizzato con cautela. Blebbistatin precipita quando viene disciolto a temperatura inferiore a 37 ° C. 14 cristalli blebbistatin può interrompere il flusso vascolare normale e indurre locale pertantoischemia e provocare eventi aritmici. 24 Inoltre, negli studi che utilizzano GFP o altri coloranti verde / giallo, precipitazioni blebbistatin potrebbero essere scambiati per cellule marcate che dovrebbero essere presi in considerazione. Prevenire blebbistatin precipitazione è semplice, vale a dire, si deve sciogliere blebbistatin in un pre-riscaldato (37 ° C e media superiore) e agitata vigorosamente. Per analizzare APD, un&#39;alta concentrazione di blebbistatin (fino a 10 pM) potrebbe essere usato. 13,14,25. Allo stesso modo, se vengono utilizzati ogni farmaco che aumenta la contrazione, si raccomanda ulteriore applicazione di blebbistatin. In una tecnica alternativa per lo studio del mouse SAN attività elettrica, a bassa risoluzione array multi-elettrodo (64 elettrodi separati in un quadrato di 8 x 8, configurazione con una distanza fra gli elettrodi di 0,55 mm) 26 e le registrazioni di vetro di microelettrodi consecutivi, a breve distanza tra impalements <sup&gt; 17 sono utilizzati. Anche se questi possono rappresentare relativamente approcci a basso costo, entrambi hanno serie limitazioni. Array Multi-elettrodi hanno un approssimativamente 10 volte minore risoluzione spaziale (sono limitate dalle dimensioni degli elettrodi metallici e la distanza tra gli elettrodi e hanno una risoluzione di 550 micron / pixel vs. fino a 50 um / pixel per ottici mappatura) e non può essere utilizzato per analizzare AP morfologia o per l&#39;imaging multi-parametrica (quali tensione simultanea e mappatura ottica calcio). Anche se le registrazioni vetro microelettrodi forniscono ulteriori informazioni sul AP morfologia, inclusi i valori assoluti per AP ampiezza e potenziale di riposo, è anche limitata da una bassa risoluzione spaziale. Pertanto, può essere utilizzato solo per la posizione stabile del pacemaker leader e non è applicabile per catturare battito per battito alterazioni nella posizione leader pacemaker. Allo stesso tempo, come dimostrato in precedenza 3,20 e evidenziate nel presente studio, l&#39;OAP co SANnsists di un segnale bifase whichincludes SAN e componenti miocardio AP atriali (Figura 4B). Si rende così difficile estrarre un segnale SAN puro e stimare con precisione AP morfologia nella SAN. A questo scopo, microelettrodi di vetro 17 o l&#39;approccio pinza amperometrica sui miociti SAN isolato devono essere considerati.

Novel scientific breakthroughs that lead to leaps in the understanding of human physiology are often preceded by technological advances. Fluorescent optical mapping, for example, enables investigation of multiple physiological parameters in both cells and tissues.1,2 It significantly improved our understanding of how the anatomical structure is associated with electrophysiological functions and dysfunctions. In the heart, the natural pacemaker and conduction systems such as the sinoatrial node (SAN) and the atrioventricular junction consist of nodal myocytes that are insulated by the surrounding atrial myocytes.3-5 Such organization creates complex three-dimensional structures with specialized electrical properties. Both structural and functional remodeling of these pacemaker structures has been recognized to form significant electrophysiological heterogeneities.6,7 Understanding the mechanism underlying how such heterogeneities result in SAN dysfunctions and atrial arrhythmogenesis will dramatically benefit the clinical treatment of these diseases. It requires a technique to visualize the propagation of electrical signals at the tissue level, such as optical mapping. 
Recently, accumulating evidence has proven the advance of optical mapping in studies of atrial electrophysiology and pathology.2 However, novel and rigorous studies are dependent on the accurate interpretation of experimental data, whose validity and stability rely on careful experiment protocols. Genetically modified mice are extensively used for research as animal models of human diseases including sick sinus syndrome, pacemaker abnormalities and atrial arrhythmias.6,8-11 Thus, a combination of fluorescent optical mapping with transgenic mouse models provides a powerful tool to study cardiac electrical abnormalities associated with various pathologies. In this paper, we present a protocol for high-resolution optical mapping of the mouse SAN and atrium. Specifically, we discuss and compare different dye loading approaches, time effects on dye bleaching and heart rate stability during the experiment.

<table><tbody><tr><td>water jacket</td><td>Radnoti</td><td>1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures</td><td></td></tr><tr><td>water bath / circulator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td>pressure amplifier</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Nylon Net Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>NY1102500</td><td></td></tr><tr><td>Pressure transducer</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Superfusion pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tubingen scissors&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501201, 500085</td><td></td></tr><tr><td>Mayo scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>Kelly hemostatic forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241</td><td></td></tr><tr><td>Iris forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)&amp;nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>in-line Luer injection port</td><td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L CMOS camera&amp;nbsp;</td><td>SciMedia</td><td>MiCAM-05&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>halogen lamp</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution optical mapping of the mouse sino-atrial node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Mappatura ottica del intatto SAN dal Cuore Langendorff-perfuso Un tipico esempio di una mappa di contorno di attivazione RA ricostruiti ritmo sinusale spontanea è mostrato in figura 3 per un cuore del mouse Langendorff-perfuso. Il punto di attivazione precoce si trova all&#39;interno della regione intercaval vicino alla SVC dove il SAN è anatomicamente definito. 3,16 mappe di contorno attivazione acquisite a 1.0 e 0.5 msec frequenza di campionamento a due RA sono mostrati in figura 3B. Per valutare SAN funzionamento, abbiamo misurato il tempo di recupero SAN (SANRT). 9 Dopo RAA stimolazione per almeno 1 min a 10-12 Hz, la stimolazione elettrica è stata interrotta e SANRT è stata calcolata come l&#39;intervallo di tempo tra l&#39;ultima AP catturato e la prima spontanea AP (Figura 3C). Il SANRT è stata corretta a la frequenza cardiaca (es SANRT &lt;sub&gt; c) calcolando la differenza tra il SANRT e la lunghezza del ciclo base. Inoltre, è stata identificata la posizione del primo pacemaker post-stimolazione. Per questo esempio, il SANRTc era di circa 49 msec. Isolato attivazione Atria e SAN L&#39;attivazione del preparato atriale isolata durante il ritmo sinusale spontaneo è mostrato in Figura 4A. E &#39;nato nel anatomicamente definito SAN vicino alla SVC con un ampio fronte d&#39;onda che si diffuse anisotropo in tutto il RA, con due di conduzione direzioni preferenziali in prossimità dei bordi superiore e inferiore SAN e blocco completo alla direzione del setto (segnata nelle mappe di attivazione in figura 4a) . La mappa di attivazione acquistata a 1 frequenza di campionamento msec mostra una vasta superficie di attivazione precoce. Un aumento della frequenza di campionamento a 0,5 msec e 0.3 msec permette di identificare la zona precisa della posizione leader pacemaker. We ha osservato un tipico, beat-to-beat posizione monofocale stabile del pacemaker che porta, che corrisponde alla zona pacemaker primaria in precedenza caratterizzato elettrofisiologicamente da microelettrodi di vetro 17 e mappatura ottica 8-11,18,19 nonché da immunomarcatura per connexin45 e HCN4 . 6,16 Come dimostrato in precedenza, il potenziale di azione ottica SAN consiste in un segnale a due fasi che comprende due componenti distinti: il componente SAN sale lentamente e la salita rapido aumento del miocardio atriale (componente atriale) (Figura 4B) 20 A causa della dispersione della luce. processi, senior rappresenta un&#39;attività elettrica media derivante da molteplici strati di cellule all&#39;interno del tessuto. La profondità e la larghezza di scattering è governata da una costante spazio, che è determinata dalla luce proprietà di diffusione e di assorbimento e può raggiungere fino a 1,5-2 mm. A causa della condu SANritardo ction, il SAN AP precede sempre l&#39;attività atriale durante l&#39;attivazione fisiologica (Figura 4B). Per calcolare la transizione dalla SAN all&#39;atrio (cioè SAN tempo di conduzione, SANCT), abbiamo utilizzato sia il punto di tempo in cui il segnale bicomponente SAN raggiunge il 50% della componente di ampiezza SAN, o il primo picco dei due picco OAP derivata prima (dF / dt). Il SANCT dalla zona di prima attivazione SAN al RA era ~ 5 msec, simile a quella misurata con microelettrodi di vetro. SAN Tempo di recupero Analogamente, il SANRT stata misurata nella preparazione atriale isolata (Figura 4D). Per questo, i preparati atriali sono stati stimolati a 12 Hz attraverso un elettrodo di stimolazione trova all&#39;angolo del RAA per almeno 1 min. 9 In questo esempio, il SANRTc era di circa 34 msec, che è paragonabile a quello misurato in Langendorff-perfuso cuore (Figura 3C). Inoltre, è stata identificata la posizione del primo pacemaker post-stimolazione. Heart Rhythm e fluorescente Segnale stabilità nel tempo Se le procedure di carico di chirurgia e coloranti sono seguiti in modo appropriato, non ci dovrebbe essere alcun cambiamento significativo nelle caratteristiche fisiologiche del dell&#39;atrio. Nella Figura 5, presentiamo il ritmo cardiaco misurato prima e dopo la procedura di isolamento atriale e durante la perfusione 3 ore. Non sono state osservate variazioni significative della frequenza cardiaca sia durante l&#39;isolamento atrio o dopo la tintura di carico. Sebbene colorazione arteriosa può richiedere una grande quantità di colorante, la stabilità del segnale fluorescente nel tessuto località SAN sembra essere migliore utilizzando questo metodo di caricamento. Nella Figura 6, presentiamo segnale di intensità decadimento nel tempo sia per colorazione coronarica e di superficie. in t<html> egli tessuto SAN, IC 50 (che indica il periodo in cui l&#39;intensità del segnale è deceduto al 50%) è di circa 107 minuti dopo la colorazione coronarica, quasi il doppio del tempo come quella di colorazione della superficie. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig1.jpg" /> Figura 1:. Isolamento del mouse atriale Preparazione (A) interventi chirurgici eseguiti per isolare la preparazione atriale mouse. Viene mostrata la vista posteriore del cuore. Tutti i tagli sono indicati da linee rosse tratteggiate ed etichettati da numeri in ordine effettuato. Vedere i dettagli in testo. (B) La descrizione schematica della preparazione atriale isolata topo che mostra le principali caratteristiche anatomiche, compresa la struttura trabecolare delle appendici atriali sinistro e destro e la posizione del nodo seno-atriale (SAN, etichettati da un ovale grigio). Tutte le abbreviazioni sono spiegati nella figura.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig2.jpg" /> Figura 2:. Segnali grezzi e trasformati Registrato al 0,3, 0,5 e 1 msec / telaio grezzo segnali vengono raccolti da un singolo pixel. Dopo 3 x 3 binning, i segnali sono filtrati utilizzando il passa-basso-algoritmo di Butterworth. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54773/54773fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig3.jpg" /> Figura 3: Whole-cuore mappatura ottica del SAN (A) a sinistra, foto di una preparazione tipica utilizzata per la mappatura del SAN dal cuore intatto.. Il quadrato blu indica il campo otticovista (6 mm x 6 mm). A destra, campo di vista ottico catturato attraverso la macchina fotografica e sovrapposti con punti di riferimento anatomici. SVC e IVC: vena cava superiore e inferiore; RAA: appendice atriale destra; RV e LV: ventricolo destro e sinistro; PV: vene polmonari. Mappe (B) a colori di attivazione di contorno acquisiti con 1.0 msec (a sinistra) e 0,5 msec (a destra) frequenza di campionamento. Sulla destra di ogni mappa, la scala temporale colore corrispondente indicante il tempo di attivazione atriale (dal punto di attivazione prima mostrata in blu, l&#39;ultimo punto di attivazione mostrata in rosso) è mostrato. Il sito di attivazione atriale prima viene etichettato da un asterisco. (C) SAN tempo di recupero (SANRT) misurato nella preparazione tutto-cuore. Esempi rappresentativi delle mappe di contorno attivazione atriali ricostruiti per l&#39;ultimo impulso di stimolazione (S1) e per la prima battuta atriale post-stimolazione (A1) sono indicati per i battiti selezionati sulla traccia rappresentativa OAP sopra.Siti di attivazione atriale prima sono contrassegnati da un asterisco. BCL:. Lunghezza del ciclo di base <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54773/54773fig3large.jpg" target="_blank">Fare click qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig4.jpg" /> Figura 4: ad alta risoluzione mappatura ottica del mouse sino-atriale Node (SAN) dalla superficie endocardica del isolata Atria (A) fotografia di un tipico del mouse SAN preparato (6 mm x 6 mm) e le sue mappe di contorno di attivazione corrispondenti. ottenuto a 1,0 msec, 0,5 msec, e 0,3 frequenze di campionamento msec. SAN e una zona di blocco vicino di casa sono indicati dalle frecce. scale temporali a colori indicano il tempo di attivazione atriale. L&#39;asterisco indica la posizione del pacemaker leader. RAA: appendice atriale destra, SVC e INC: superiore e vena cava inferiore, RV: ventricolo destro, AVJ: atrio-ventricul<html> giunzione ar, CT: crista terminalis, IAS: setto inter-atriale. (B) Meccanismo delle doppie componenti della registrazione OAP dal mouse località SAN. Vedere i dettagli in testo. . (C) OAPs registrati dal centro dell&#39;area SAN (blu), il primo sito di eccitazione atriale (verde) e l&#39;ultimo sito di attivazione RA (rosso) Insets: transizione da nodale forma d&#39;onda atriale con un tempo di conduzione totale pari a 5 msec. Confronto con il tempo di ritardo per l&#39;attivazione RA totale pari a 11 msec. (D) SAN tempo di recupero (SANRT) misurata nella preparazione atriale isolata. sono mostrati esempi rappresentativi delle mappe di contorno attivazione atriali ricostruiti per l&#39;ultimo impulso di stimolazione (S1) e per la prima battuta post-stimolazione atriale (A1). Un sito di attivazione atriale prima è etichettato con un asterisco. BCL - durata del ciclo di base.k &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig5.jpg" /> Figura 5: ritmo cardiaco misurato prima e dopo la procedura di isolamento atriale (A) e durante la perfusione 3 ore (B). (A) della frequenza cardiaca spontanea battito viene mostrato prima e dopo l&#39;isolamento atriale per due tipi di colorazione atriale: superficie di colorazione dopo l&#39;isolamento (senza colorazione preliminare coronarica) e la colorazione coronarica prima di isolamento atriale. (B) Spontaneous cuore pulsante della stabilità del ritmo nel corso della perfusione 3 ore è indicata per i preparati non macchiato atriali e per colorante fluorescente e blebbistatin preparati atriale colorate. I dati sono mostrati come media ± SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54773/54773fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a><img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54773/54773fig6.jpg" /> Figura 6:. Intensità segnale decade nel tempo le intensità dei segnali provenienti da entrambi i metodi di caricamento (loading coronarica indicata in rosso e piano di carico indicato in blu) sono stati misurati e tracciati nel tempo. Le intensità di segnale sono stati mediati da una zona 7 da 7 pixel a quattro luoghi tipici nell&#39;atrio destro: Trabecula (Trab), del nodo del seno (SAN), atrio destro appendice (RAA) e del seno coronarico (CS). IC 50 valori sono stati quindi calcolati e etichettati in tutte le curve di decadimento. Il decadimento intensità del segnale da entrambi i metodi di caricamento è stata simile in TRAB e RAA. L&#39;IC 50 di carico arteriosa in CS è stato di circa 20 minuti più a lungo. Nel SAN, questo valore per arteriosa carico era quasi due volte più grande rispetto al carico di superficie, il che indica che i metodi arteriosa di carico portato a una migliore stabilità del colorante nelle tiss SANue nel tempo. I dati sono mostrati come media ± SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54773/54773fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Qui, presentiamo un protocollo per la mappatura ottica di attività elettrica dal mouse atrio destro e soprattutto il nodo seno-atriale, con una risoluzione spaziale e temporale elevata.

Mappatura ottica ad alta risoluzione del mouse nodo seno-atriale

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K Views.  University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health.  Qui, presentiamo un protocollo per la mappatura ottica di attività elettrica dal mouse atrio destro e soprattutto il nodo seno-atriale, con una risoluzione spaziale e temporale elevata. 

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

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Bioingegneria

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

High-Resolution Endocardial and Epicardial Optical Mapping in a Sheep Model of Stretch-Induced Atrial Fibrillation

Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance seen in clinical practice and its prevalence is expected to increase in the coming years.3 Increased intra-atrial pressure and dilatation have been long recognized to lead to AF,1,4 which highlights the relevance of using animal models and stretch to study AF dynamics. Understanding the mechanisms underlying AF requires visualization of the cardiac electrical waves with high spatial and temporal resolution. While high-temporal resolution can be achieved by conventional electrical mapping traditionally used in human electrophysiological studies, the small number of intra-atrial electrodes that can be used simultaneously limits the spatial resolution and precludes any detailed tracking of the electrical waves during the arrhythmia. The introduction of optical mapping in the early 90's enabled wide-field characterization of fibrillatory activity together with sub-millimeter spatial resolution in animal models5,6 and led to the identification of rapidly spinning electrical wave patterns (rotors) as the sources of the fibrillatory activity that may occur in the ventricles or the atria.7-9 Using combined time- and frequency-domain analyses of optical mapping it is possible to demonstrate discrete sites of high frequency periodic activity during AF, along with frequency gradients between left and right atrium. The region with fastest rotors activates at the highest frequency and drives the overall arrhythmia.10,11 The waves emanating from such rotor interact with either functional or anatomic obstacles in their path, resulting in the phenomenon of fibrillatory conduction.12 Mapping the endocardial surface of the posterior left atrium (PLA) allows the tracking of AF wave dynamics in the region with the highest rotor frequency. Importantly, the PLA is the region where intracavitary catheter-based ablative procedures are most successful terminating AF in patients,13 which underscores the relevance of studying AF dynamics from the interior of the left atrium. Here we describe a sheep model of acute stretch-induced AF, which resembles some of the characteristics of human paroxysmal AF. Epicardial mapping on the left atrium is complemented with endocardial mapping of the PLA using a dual-channel rigid borescope c-mounted to a CCD camera, which represents the most direct approach to visualize the patterns of activation in the most relevant region for AF maintenance.

This report provides a detailed description of the methodology and results of simultaneous endocardial and epicardial optical mapping of electrical excitation in the intact left atrium of a Langendorff-perfused sheep heart during stretch-induced atrial fibrillation.

Ad alta risoluzione Mappatura endocardica e epicardici ottico in un modello di pecora Stretch indotta fibrillazione atriale

 Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance ...

Medicina

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biologia

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Microscopia a foglio luminoso e pulizia dei tessuti per un imaging cardiaco completo

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Autore in primo piano: imaging personalizzato su foglio luminoso per lo studio delle strutture miocardiche nei cuori dei roditori

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

Imaging a foglio luminoso per rivelare la struttura cardiaca nei cuori dei roditori

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero, imaging confocale e ricostruzione 3D del nodo senoatriale e atrioventricolare nel topo

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or bradycardia. Reliable identification of cardiac pacemaking defects requires the measurement of intrinsic heart rates by largely preventing the influence of the autonomic nervous system, which can mask rate deficits. Traditional methods to analyze intrinsic cardiac pacemaker function include drug-induced autonomic blockade to measure in vivo heart rates, isolated heart recordings to measure intrinsic heart rates, and sinoatrial strip or single-cell patch-clamp recordings of sinoatrial pacemaker cells to measure spontaneous action potential firing rates. However, these more traditional techniques can be technically challenging and difficult to perform. Here, we present a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate by performing microelectrode array (MEA) recordings of whole-mount sinoatrial node preparations from mice. MEAs are composed of multiple microelectrodes arranged in a grid-like pattern for recording in vitro extracellular field potentials. The method described herein has the combined advantage of being relatively faster, simpler, and more precise than previous approaches for recording intrinsic heart rates, while also allowing easy pharmacological interrogation.

This protocol aims to describe a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate using microelectrode array recording of the whole sinoatrial node tissue to identify pacemaking defects in mice. Pharmacological agents can also be introduced in this method to study their effects on intrinsic pacemaking.

Registrazione di microelettrodi della velocità di attivazione dei nodi senoatriali per identificare i difetti intrinseci del pacemaking cardiaco nei topi

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...

Mappatura ottica ad alta risoluzione del mouse nodo seno-atriale

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

Mappatura ottico dei potenziali d'azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

Ad alta risoluzione Mappatura endocardica e epicardici ottico in un modello di pecora Stretch indotta fibrillazione atriale

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

Imaging a foglio luminoso per rivelare la struttura cardiaca nei cuori dei roditori

Imaging a foglio luminoso per rivelare la struttura cardiaca nei cuori dei roditori

Imaging a foglio luminoso per rivelare la struttura cardiaca nei cuori dei roditori

Colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero, imaging confocale e ricostruzione 3D del nodo senoatriale e atrioventricolare nel topo

Registrazione di microelettrodi della velocità di attivazione dei nodi senoatriali per identificare i difetti intrinseci del pacemaking cardiaco nei topi