Name: electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping
Uploaded: 2018-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping at JoVE.com

Questo lavoro è supportato dal programma per il miglioramento dell'ambiente di ricerca per giovani ricercatori provenienti da fondi speciali di coordinamento per promuovere la scienza e tecnologia (SCF) (per T.S.), localizzativi per la ricerca scientifica (n. 16K 09494, a T.S., n. 26293052, a T.F.) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) del Giappone. Apprezziamo Brainvision e Mr. Kenji Tsubokura per l'assistenza tecnica, e apprezziamo anche Mr. John Martin per la sua assistenza linguistica.

Questo esperimento sugli animali è stato approvato ed eseguito ai sensi del regolamento della istituzionale Animal Care e uso Comitato di Tokyo Medical and Dental University.
1. preparazione
<ol><li>Soluzioni di riserva<ol>
<li>Sciogliere i coloranti di tensione-sensibili (di-4-ANEPPS e RH237) e Ca2 + indicatore (Rhod-2 AM) con 100% di dimetilsolfossido (DMSO) per fare soluzioni di riserva con le concentrazioni di 6 mM, 10 mM e 10 mM, rispettivamente.</li>
		<li>Sciogliere il disaccoppiatore di eccitazione-contrazione (E-C), blebbistatin, con 90% DMSO per rendere una soluzione stock di 50 mM.</li>
		<li>Aliquotare le soluzioni di riserva in un 0,2 mL PCR tubo in una stanza buia e sostituire l'aria nel tubo d'archivio utilizzando gas di azoto per evitare l'ossidazione.</li>
		<li>Avvolgere i tubi d'archivio in un foglio di alluminio individualmente per protezione dalla luce e conservare a-20 ˚ c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluzioni di lavoro<ol>
<li>Preparare 1 L di tampone fosfato salino (PBS) senza Ca2 + (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8,0 mM Na2HPO4e 1,5 mM KH2PO4, pH 7,40 regolato da NaOH)</li>
		<li>Preparare 1 L di soluzione di Tyrode (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucosio e 5,0 mM HEPES, pH 7,40 regolato da NaOH).</li>
		<li>Filtrare la soluzione di Tyrode con un filtro di 0,22 µm bottiglia superiore e aerilo bene da aerazione bolla usando una pietra di aria collegato ad una bombola di gas O2 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ottico mappatura nei cuori irrorati Langendorff
<ol><li>Assemblare il sistema di mappatura ottico utilizzando due telecamere di semiconductor (CMOS) di ossido di metallo complementare (Figura 1a& b)<ol>
<li>Montare le telecamere CMOS, divisore di fascio, lenti dell'obiettivo, obiettivo revolver, fonte di luce, specchi dicroici, filtri e altre parti nel sistema ottico mappatura come mostrato in Figura 1a& b.</li>
		<li>Selezionare l'ingrandimento modificando la lente dell'obiettivo in una torretta, attrezzata con diversi ingrandimenti (1.6 X e 5x). Nota: La dimensione del sensore CMOS è 10 mm × 10 mm, con una risoluzione di 100 × 100, che significa, con obiettivo 5x, questo sistema fornisce una risoluzione spaziale di 20 µm.</li>
		<li>Impostare la luce di eccitazione utilizzando una lampada diodo luminoso (LED) con una lunghezza d'onda concentrare di 530 nm, passata attraverso un filtro passa-banda (520/35 nm) e riflette con uno specchio dicroico (560 nm).</li>
		<li>Registrare il segnale di emissione diviso da uno splitter (665 nm), filtro passa-in quale impostazione fotocamera 1 con una lunga (697/75 nm) rileva la fluorescenza usando una tintura di membrana voltaggio-dipendenti (di 4-ANEPPS o RH237) e fotocamera 2 con un filtro passa-banda (572/28 nm) rileva la segnale dell'indicatore del Ca2 + (Rhod2-AM).</li>
	</ol></li>
	<li>Montare il circuito di perfusione di Langendorff<ol>
<li>Collegare tubi in cloruro di polivinile (PVC) di una pompa peristaltica.</li>
		<li>Mettere il lato di aspirazione del tubo in PVC nella soluzione di Tyrode aerato con 100% O2 come indicato al punto 1.2.3.</li>
		<li>Collegare il lato di scarico del tubo del PVC a una trappola aria fatti a mano, quindi disporre il 5 µm filtro, rubinetto a tre vie, trasduttore di pressione, riscaldamento bobina di vetro e ago smussata da 21 gauge (la dimensione dell'ago è variabile secondo le dimensioni dell'aorta) in sequenza , utilizzando altri tubi di PVC.</li>
		<li>Riempire il circuito di perfusione con soluzione di Tyrode evitando eventuali bolle d'aria nel circuito e fermare il flusso fino a quando il cuore è collegato al circuito.</li>
	</ol></li>
	<li>Eparinizzazione e anestesia<ol>
<li>Iniettare l'eparina non frazionata (200 IU, indipendentemente dal peso corporeo) intraperitonealmente in un mouse utilizzando un calibro 25 ago e siringa da 1 mL.</li>
		<li>Anestetizzare il mouse tramite un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (65mg/kg) 10 min dopo l'iniezione di eparina.</li>
	</ol></li>
	<li>Inserimento di una canula e perfusione<ol>
<li>Posizionare il mouse nella posizione supina. Confermare gli animali è anestetizzati da mancanza di risposta alla punta pizzico. Aprire la parete addominale sotto il livello del processo xifoideo usando le forbici. Fare un'incisione trasversale nel diaframma, tagliare entrambi i lati delle nervature nella linea ascellare mediale senza alcun danno al cuore e capovolgere la parete di cassa anteriore verso l'alto. Fare avanzare la pinza curva dietro il cuore e conservare l'aorta discendente, esofago e vena cava inferiore. Quindi, asportare il cuore con le forbici rapidamente insieme ai vasi adiacenti e il tessuto, come l'aorta, polmoni, trachea, esofago, tessuti adiposi e timo.</li>
		<li>Lavare il cuore con 10 mL di PBS ghiacciata in una capsula Petri e rimuovere il tessuto adiacente.</li>
		<li>Introdurre la punta dell'ago blunted 21-manometro collegato al circuito di perfusione in aorta ascendente e fissarla con filo sotto un microscopio stereoscopico.</li>
		<li>Iniziare a irrorare il cuore per 10 min con soluzione di Tyrode aerato con 100% O2.</li>
		<li>Monitorare la pressione di perfusione continuamente con il trasduttore di pressione collegato all'amplificatore e registratore.</li>
		<li>Mantenere la pressione di perfusione tra 80-100 mmHg (solitamente corrispondente a 2-5 mL/min per la velocità di flusso) durante tutti i passaggi seguenti.</li>
		<li>Durante la perfusione iniziale (punto 2.4.4.), inserire il tubo sottile in polietilene (PE) (diametro esterno: 0,8 mm) in SVC e fissarlo con un thread. Poi, posto il cuore nella camera di vetro riscaldato (Figura 1b& c).</li>
		<li>Puntura di un ago 24-interiore (diametro esterno: 0,7 mm) nella cavità di ventricolare sinistra (LV) attraverso l'apice ventricolare per evitare eventuali danni all'atrio e rimuovere l'ago interno lasciando la cannula esterna in LV.</li>
		<li>Introdurre un catetere elettrodo 1-francese formato personalizzato fatto attraverso il tubo di PE nello SVC per eseguire la stimolazione elettrica in RA. Se necessario, far avanzare il catetere nel ventricolo di destro (RV) per la stimolazione ventricolare.</li>
		<li>Inserire un elettrodo pin all'apice ventricolare per registrare continuamente i bipolari elettrocardiogrammi (ECG) tra l'ago elettrodo e inserimento di una canula di perno nell'aorta ascendente (Figura 1C).</li>
		<li>Continuare a monitorare l'ECG e l'aspersione pressione durante l'intero studio.</li>
		<li>Spegnere la luce ed eseguire il seguente esperimento in una stanza buia.</li>
		<li>Andare al punto 2.5. per una singola registrazione di tensione della membrana o 2.6. per una doppia registrazione della tensione della membrana e Ca2 + transitori.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione per una singola registrazione della tensione della membrana<ol>
<li>Mantenere la soluzione di perfusione riscaldata a 37 ˚ c durante questo protocollo di colorazione per una singola registrazione della tensione della membrana.</li>
		<li>Diluire 8,3 µ l della soluzione madre di-4-ANEPPS (6 mM) con 10 mL di soluzione di Tyrode (la concentrazione finale è di 5 micron).</li>
		<li>Infondere il volume totale (10 mL) della soluzione diluita di-4-ANEPPS in cuore la via della perfusione per 2-5 min, seguita da un lavaggio con soluzione di Tyrode per 5 min.</li>
		<li>Diluire 5 µ l di soluzione di riserva blebbistatin (50 mM) con 1mL di soluzione di Tyrode (la concentrazione finale è 250 µM).</li>
		<li>Amministrare l'importo totale della soluzione diluita blebbistatin la via della perfusione.</li>
		<li>Saltare punto 2.6 e procedere al punto 2.7 per dilavamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione per una doppia registrazione della tensione della membrana e Ca2 + transitori<ol>
<li>Mantenere la soluzione di Tyrode a temperatura ambiente. Nota: Questa impostazione iniziale della temperatura è diversa da quello della colorazione per una singola registrazione della tensione di membrana (passo 2.5.).</li>
		<li>Amministrare la blebbistatin nello stesso modo come in passaggi 2.5.4 e 2.5.5.</li>
		<li>Mix 3 µ l di soluzione madre di Rhod2AM (10 mM) e 30 µ l di poliossietilene-poliossipropilene F-127 (20% in DMSO) copolimero a blocchi, quindi stemperate il composto con 10 mL di soluzione di Tyrode.</li>
		<li>Caricare la quantità totale di soluzione Rhod2AM (3 µM) oltre il 2-5 min la stessa via come il blebbistatin.</li>
		<li>Diluire 7 µ l di soluzione di riserva di RH237 (10 mM) con 10 mL di soluzione di Tyrode.</li>
		<li>Amministrare l'importo totale della soluzione diluita di RH237 (7 µM) oltre 2-5 min.</li>
		<li>Dopo il completamento della procedura di cui sopra, iniziare a riscaldare la soluzione di Tyrode a 37 ˚ c.</li>
	</ol></li>
	<li>Washout<ol>
<li>Mantenere la temperatura della soluzione di Tyrode a 37 ˚ c nel seguente esperimento.</li>
		<li>Irrorare il cuore con soluzione di Tyrode per almeno 5 min lavare fuori i coloranti eccessivi. Nota: Non esiste alcuna necessità di aumentare il tasso di flusso durante questo lavaggio fuori passo (vedere il passaggio 2.4.6.)</li>
		<li>Confermare la scomparsa di qualsiasi manufatto di movimento a causa di contrazioni e la colorazione omogenea nel cuore irrorato.</li>
	</ol></li>
	<li>Campionamento e analisi dei dati<ol>
<li>Mettere il vetro di copertura (25 mm × 60 mm) cuore irrorato con grande cura, per appiattire la superficie atriale senza troppo stress meccanico e prevenire artefatto movimento dalle vibrazioni della soluzione. Confermare che l'atrio attribuisce per il vetro di copertura in modo appropriato.</li>
		<li>Registrare la fluorescenza dalle telecamere CMOS con un campionamento votare fino a 0.1 ms per di 4-ANEPPS e 1 ms per la RH237 e la Rhod2AM di colorazione.</li>
		<li>Analizzare le registrazioni ottenute utilizzando il software di analisi, secondo le istruzioni del produttore per l'effettivo funzionamento del software.</li>
		<li>Creare una mappa di attivazione e il film dopo l'estrazione della regione di interesse, rimozione di drift, filtro temporale e 3x3 binning5.</li>
	</ol></li>
</ol>3. studio elettrofisiologico
<ol><li>Impostazione di elettrodi di stimolazione e stimolatore<ol>
<li>Confermare il contatto della punta dell'elettrodo stimolazione su misura nella RA al tessuto per stimolazione (fare riferimento al passaggio 2.4.9.).</li>
		<li>Fornire stimoli tutti stimolazione dal catetere stimolazione collegato allo stimolatore programmabile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinazione della soglia di stimolazione<ol>
<li>Imposta un intervallo di stimolazione tra 100 e 150 ms (larghezza di impulso di 0,4 ms), evitando qualsiasi ritmo intrinseco superando il tasso di stimolazione.</li>
		<li>Erogare la stimolazione costante stimolazione per almeno 20 battiti ottenere una stabile pacing atriale.</li>
		<li>Impostare il ritmo uscita a 5 mV, quindi ridurre gradualmente fino a errore della stimolazione consegnati a depolarizzarsi l'atrio.</li>
		<li>Confermare l'eccitazione atriale dalla presenza di onde P all'ECG e/o un segnale di eccitazione atriale di registrazione ottica.</li>
		<li>Determinare il minimo output è in grado di depolarizzarsi l'atrio come la soglia di stimolazione di stimolazione.</li>
		<li>Impostare la stimolazione per i seguenti studi a due volte la soglia di stimolazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Costante e stimolazione burst<ol>
<li>Consegnare la cadenza costante per 99 battiti, con un intervallo di stimolazione a partire da 150 ms, o l'intervallo più lungo che evita superando il ritmo intrinseco.</li>
		<li>Ridurre l'intervallo di stimolazione progressivamente con step di 5 ms, fino a 40 ms o fino a raggiungere l'intervallo che non riesce a ottenere 1:1 acquisizione dell'atrio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Singolo extrastimulus cadenza<ol>
<li>Impostare la lunghezza di ciclo di stimolazione dell'unità base (S1) su 120 ms, 100 ms e ms 80 a meno che il ritmo intrinseco supera l'unità di base o il pacing non riesce a ottenere eccitazione atriale 1:1.</li>
		<li>Impostare il numero di stimoli a 10 battiti per il treno di unità base di stimolazione.</li>
		<li>Impostare il primo extrastimulus (S2)-10 ms per tutta la durata del ciclo di base.</li>
		<li>Consegnare S2 dopo l'ultimo stimolo stimolazione dell'unità base.</li>
		<li>Accorciare l'intervallo di accoppiamento di S2 progressivamente con step di 5 ms, fino a quando la S2 non riesce a depolarizzarsi l'atrio.</li>
		<li>Determinare l'efficace periodo refrattario (ERP) come l'intervallo più lungo di S2 che non riesce a depolarizzarsi l'atrio.</li>
		<li>Valutare l'ERP con almeno 3 ciclo di base differenti lunghezze per valutare l'adattamento di tasso dell'ERP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doppie e triple extrastimuli stimolazione per indurre tachyarrhythmias atriali<ol>
<li>Reimpostare l'intervallo S2 a un punto di 20 ms fuori ERP di S2 se aritmia non è osservati.</li>
		<li>Aggiungere un secondo extrastimulus (S3), a partire con lo stesso intervallo S2.</li>
		<li>Ridurre l'intervallo di accoppiamento tra S2 e S3 progressivamente con step di 5 ms fino a S3 non riesce a depolarizzarsi l'atrio.</li>
		<li>Reimpostare l'intervallo di S2 ad un punto 10 ms fuori l'ERP, quindi ripetere il punto 3.5.3.</li>
		<li>Reimpostare gli intervalli S2 e S3 punti 20 ms fuori ogni ERP.</li>
		<li>Aggiungere un terzo extrastimulus (S4), a partire con lo stesso intervallo S3.</li>
		<li>Ridurre l'intervallo di accoppiamento tra S3 e S4 progressivamente con step di 5 ms fino a S4 non riesce a depolarizzarsi l'atrio.</li>
		<li>Reimpostare l'intervallo di S3 a un punto di 10 ms fuori l'ERP, quindi ripetere il passaggio 3.5.7.</li>
		<li>Reimpostare gli intervalli S2 e S3 a punti 10 ms fuori l'ERP, quindi ripetere il passaggio 3.5.7.</li>
		<li>Definire il 270ms dei tachyarrhythmias atriali tramite l'induzione riproducibile utilizzando stimoli allo stesso modo programmati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valutazione di 270ms dei tachyarrhythmias atriali<ol>
<li>Continuamente registrare l'ECG durante tutti i protocolli di stimolazione (passo 3.3-3.5.).</li>
		<li>Eseguire le registrazioni ottiche durante e dopo ogni stimolo, per registrare l'induzione di tachicardia atriale (AT) o risposta atriale ripetitivo (RAR).</li>
		<li>Confermare la riproducibilità applicando lo stesso protocollo di stimolazione quando AF o un RAR è indotta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gollob, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+the+Connexin+40+Gene+(GJA5)+in+atrial+fibrillation.">Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation.</a> New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).</li><li>Gudbjartsson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variants+conferring+risk+of+atrial+fibrillation+on+chromosome+4q25.">Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25.</a> Nature. 448, 353-357 (2007).</li><li>Ellinor, P. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mappatura ottico è una manovra ben consolidata per studiare l' elettrofisiologia cardiaca7ed è uno strumento molto utile per valutare non solo le aritmia ventricolari8,9, ma anche quelli atriale10,11 . Simultanea mappatura del potenziale transmembrana e transitori di Ca2 + è utile per comprendere i meccanismi alla base delle aritmie in relazione di infarto e altre malattie di cuore12,13. Quando si confrontano gli altri metodi di valutazione elettrofisiologica, come quelli che usano una singola cella o strato di cellule, uno della superiorità assoluta della mappatura ottico nel cuore irrorato è la valutazione del modello di conduzione nell'atrio intatta e ventricolo, non solo durante il ritmo sinusale, ma anche durante aritmie indotte14. Un tentativo di utilizzare cuori murini, soprattutto l'atrio, come un surrogato degli esseri umani ha incontrato difficoltà principalmente a causa del loro di piccola dimensione, tuttavia, il mouse è un modello sperimentale interessante in termini di valutazione in un animale geneticamente modello e questo problema deve essere superata. Il nostro approccio fornisce una direzione per risolverlo.
Anche se il nostro apparato ottico mappatura era sostanzialmente simile al sistema convenzionale per intero murino cuori15, il nostro metodo ha il vantaggio di valutare l'atrio murino apportando alcune modifiche ad esso. In primo luogo, abbiamo perseguito per ottenere un'elevata risoluzione spaziale e temporale di fino a 0.1 ms/telaio e 20 µm/pixel e questa mappatura ad alta risoluzione ha contribuito a una misura più precisa del modello di velocità e propagazione di conduzione nell'atrio murino. In secondo luogo, per evitare inutili danni meccanici o tratto dell'atrio, che poteva alterare le proprietà elettrofisiologiche 16,17, un interiore dell'ago viene inserito direttamente nel LV per ridurre la pressione intra-alloggiamento, invece di inserirlo attraverso la LA interpretato nel precedente studio15. Inoltre, lo stimolo di stimolazione viene recapitato attraverso un custom made 1-francese dimensioni elettrodo catetere disposto nella RA, ma non da un elettrodo ad ago, che potrebbero ferire l'atrio. I pin sono evitati nel fissare l'annesso atriale, che sono stati usati nel passato Studio15. In terzo luogo, in termini di valutazione del meccanismo sottostante delle aritmie, un protocollo di stimolazione programmate per indurre tachyarrhythmias atriali è cruciale18,19. Eseguiamo identico a quello stimolo programmato negli studi clinici elettrofisiologici, tra cui burst pacing e fino a extrastimuli tripla stimolazione, con una modifica dell'intervallo di stimolazione per il cuore del mouse. Così, oltre ai parametri di misurazione della linea di base, il protocollo potrebbe valutare la 270ms della AT. Quando necessario, 270ms della AT è valutato con l'amministrazione di isoproterenolo o altri farmaci. Nella nostra esperienza, i topi wild-type appena mostrano qualsiasi ATs anche dopo un protocollo di stimolazione completo. Così, il 270ms di AT dovrebbero essere informazioni importanti per valutare il contributo di diverse condizioni patologiche quali mutazioni genetiche, le procedure chirurgiche e la somministrazione di farmaci11. Tali modifiche potrebbero ottimizzare la valutazione elettrofisiologica precisa nell'atrio murino intatto.
Questo metodo ha anche alcune limitazioni. In primo luogo, con una massima risoluzione spaziale con una lente di obiettivo X 5, il campo visivo (FOV) è limitato ad una parte dell'atrio (cioè. solo l'auricola sinistra come mostrato in Figura 2a). Per ottenere il FOV più grande dell'atrio, un obiettivo X 1,6 è a volte preferibile (Figura 2b). In secondo luogo, senza l'atrio di fissaggio con perni, a volte è difficile misurare le proprietà di conduzione atriale correttamente, perché la superficie atriale è curvo. Così, abbiamo messo il vetro di copertura sulla sua superficie per appiattirla invece di risolverlo tramite perni. Questo metodo è anche utile per prevenire artefatto movimento dalle vibrazioni della soluzione. In terzo luogo, con il nostro metodo, è abbastanza difficile ottenere il FOV intero di esso, quindi, di utilizzare correttamente la vista anteriore e posteriore è più importante nel nostro approccio rispetto all'altro approccio, come mostrato nella Figura 2. Il vantaggio della vista anteriore sarebbe la chiara osservazione di rientro in caso di condizioni patologiche, soprattutto nell'annesso (Figura 4). D'altra parte, la vista posteriore ha un vantaggio di ottenere una buona vista della parete atriale posteriore e potrebbe essere una registrazione dettagliata di innescare attività dal manicotto del miocardio. Quando è difficile ottenere una visualizzazione appropriata e per appiattire la sua superficie curva con il nostro metodo, l'atrio può essere fissato con tensione minima di perni.
Con il nostro metodo, ci sono 3 possibili problemi, errore di colorazione, la cadenza e induzione di aritmia. Per errore di colorazione, se nessuna o lieve fluorescenza si osserva, si dovrebbe verificare se l'apparecchiatura di mappatura ottica è montata correttamente, e se il reagente è adeguatamente memorizzato e utilizzato. La condizione della soluzione perfusione è anche cruciale, che può colpire anche le proprietà elettrofisiologiche del cuore stesso, così, la condizione di soluzione incluso il pH, temperatura, e se c'era sufficiente aerazione deve essere strettamente monitorati. È inoltre importante evitare qualsiasi aria gli emboli nel cuore. Per stimolazione fallimento, se gli stimoli pacing non possono eccitare l'atrio, i ricercatori dovrebbero verificare se il cablaggio è corretto con un tester di circuito. Quando gli stimoli pacing outputted correttamente, il problema è il contatto dell'elettrodo con il tessuto. Riposizionamento degli elettrodi in grado di risolvere il problema, e il nostro approccio utilizzando il catetere stimolazione lo rende facile. Per difficoltà nell'induzione di aritmia, RV stimolazione può essere utilizzato per l'induzione di un AT in alcuni casi limitati. Utilizzando un catetere elettrodo quadripolar di cui l'elettrodi prossimali e distali due elettrodi possono trovarsi nel RV e RA, rispettivamente, è facile cambiare il sito di stimolazione da RA per il camper. Questo catetere è inoltre utile per l'eccitazione ventricolare di spostamento quando un segnale di attivazione ventricolare simultanea maschera il segnale di eccitazione atriale.
Questo metodo contribuirà alla valutazione il genotipo-fenotipo interazioni in AF relativi geni trovati di recente dagli studi romanzo come GWAS, soprattutto per i geni con cui l'indagine non è riuscito a mostrare loro di altri approcci. Con il progresso dei dispositivi e delle tecniche, le proprietà elettrofisiologiche del manicotto della vena polmonare, che è la fonte importante di AF20, possono essere valutate nel cuore intatto con questo approccio.

Il cuore è costituito da 4 camere in mammiferi. Le due camere superiori sono atri e quelle inferiori sono i ventricoli. Ventricoli funzionano come una pompa per espellere sangue alla circolazione sistemica o polmonare. Atri ricevono il sangue che ritorna dalle vene polmonari o sistemiche e assistono al trasporto del sangue nei ventricoli per ottenere una funzione di pompa cardiaca efficiente. Da un aspetto elettrofisiologico, l'importante funzione degli atrii è di regolare il ritmo cardiaco. I segnali elettrici hanno origine dal nodo del seno che si trova alla giunzione fra la vena cava superiore (SVC) e l'atrio destro (RA), quindi propagano il RA e l'atrio sinistro (LA) e conducono al ventricolo attraverso il nodo atrioventricolare e il suo-Purkinje sistema di conduzione.
Aritmia, che sono disturbi del ritmo cardiaco, sono classificate in atriali e ventricolari secondo la loro origine. La fibrillazione atriale (AF) è la forma più comune sostenuta di un'aritmia, caratterizzata da un'eccitazione rapida e casuale degli atrii. Recenti analisi genetiche e studi di associazione genome-wide (GWAS) hanno dimostrato l'associazione tra AF e mutazioni genetiche o monopolymorphisms1,2,3,4. Questi risultati indicano che AF è almeno in parte associato con una causa genetica. Pertanto, è fondamentale per valutare le interazioni genotipo-fenotipo negli atrii utilizzando un modello animale geneticamente. È ampiamente accettato che il mouse è il mammifero più affermato per la modificazione genetica.
La tecnica di mappatura ottico è stata sviluppata per valutare l'eccitazione del tessuto del cuore. Tuttavia, l'osservazione dell'atrio murino da ottico mapping è ostacolata dalla sua dimensione relativamente piccola. Tentiamo di realizzare una valutazione dettagliata dell'atrio murino con un'alta risoluzione temporale e spaziale.

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin</td><td>SIGMA</td><td>B0560-1MG</td><td>E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>Voltage-sensitive dye</td></tr><tr><td>Rhod2AM</td><td>Biotium</td><td>50024</td><td>Ca indicator</td></tr><tr><td>Pluronic F-127 20% solution in DMSO</td><td>Biotium</td><td>#59000</td><td>To enhance the staining with Rhod2AM</td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPS</td><td>Wako</td><td>041-29111</td><td>Voltage-sensitive dye</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Wako</td><td>046-21981</td><td>Solvent for reagents</td></tr><tr><td>Bottle top filter</td><td>Corning</td><td>430513</td><td>For filtering Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>Haparin Sodium</td><td>Mochida Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>N/A</td><td>To avoid blood clots in the coronary artery</td></tr><tr><td>Air stone (&amp;phi;8 mm x 10 mm)</td><td>Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho</td><td>N/A</td><td>for aeration</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td><td>N/A</td><td>For an anesthesia</td></tr><tr><td>Programmable stimulator</td><td>Fukuda Denshi</td><td>BC-05</td><td>Fukuda Denshi kindly rented us.</td></tr><tr><td>Power Lab</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab 26/8SP</td><td>To record blood pressure and electrocardiogram</td></tr><tr><td>Bio Amp</td><td>AD Instruments</td><td>ML132</td><td>Amprifier for electrocardiogram</td></tr><tr><td>BP Amp</td><td>AD Instruments</td><td>FE117</td><td>Amprifier for blood pressure</td></tr><tr><td>LabChart</td><td>AD Instruments</td><td>Version 7</td><td>Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram</td></tr><tr><td>Disposable BP transducer</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td>pressure transducer</td></tr><tr><td>1-Fr custom made electrode catheter</td><td>Unique Medical</td><td>N/A</td><td>To pace right atrium</td></tr><tr><td>Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm)</td><td>Natume Seisakujo</td><td>SP31</td><td>Put into superior vena cava to introduce electrode catheter</td></tr><tr><td>Millex-SV 5.00 &amp;mu;m</td><td>Merk Millipore</td><td>SLSV025LS</td><td>To filter the circulating Tyrode</td></tr><tr><td>24-gauge indwelling needle</td><td>TERUMO</td><td>SR-FS2419</td><td>Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber</td></tr><tr><td>21-gauge needle</td><td>TERUMO</td><td>SN-2170</td><td>We cut the tip of needle and blunted it by filing</td></tr><tr><td>25-guage needle</td><td>TERUMO</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>1-ml syringe</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>PVC tube</td><td>TERUMO</td><td>SF-ET0525</td><td>for Langendorff&#039;s perfusion circuit</td></tr><tr><td>Three-way stopcock</td><td>TERUMO</td><td>TS-TL2K</td><td>for Langendorff&#039;s perfusion circuit</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>As one</td><td>3-1491-01</td><td></td></tr><tr><td>Custum made heating glass coil</td><td>Motohashi Rika</td><td>N/A</td><td>to keep temperature of perfusion solution</td></tr><tr><td>Custum made warming glass chamber</td><td>Motohashi Rika</td><td>N/A</td><td>to keep temperature of perfusion solution</td></tr><tr><td>Constant temperature circulating device</td><td>Lauda</td><td>E100</td><td>connected to heating coil and warming chamber</td></tr><tr><td>Cover glass (25 mm &amp;times; 60 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C025601</td><td>Put on the atria to flatten the recording area</td></tr><tr><td>Perista pump</td><td>ATTO</td><td>SJ-1211</td><td>peristaltic pump</td></tr><tr><td>Stemi DV4</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Stereomicroscope</td></tr><tr><td>MiCAM ULTIMA-L2</td><td>Brainvision Inc.</td><td>UL-L2</td><td>Optical mapping System</td></tr><tr><td>BV_Ana Software</td><td>Brainvision Inc.</td><td>BV_Ana</td><td>Data Analysis Software</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>Brainvision Inc.</td><td>THT-ZS</td><td>Epi-Illumination Unit</td></tr><tr><td>LED Light Source</td><td>Brainvision Inc.</td><td>LEX2-G</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Mirror 560nm</td><td>Brainvision Inc.</td><td>DM560</td><td>Epi-Illuminatinon</td></tr><tr><td>Excitation Filter 520/35nm</td><td>Semrock, Inc.</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>Projection lens Plan S 1.0X</td><td>Carl Zeiss</td><td>435200-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Focus Drive</td><td>Carl Zeiss</td><td>435400-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens Revolver</td><td>Carl Zeiss</td><td>435302-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Manual Focus Column</td><td>Carl Zeiss</td><td>435400-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Macroscope Base</td><td>Carl Zeiss</td><td>435430-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>Straight Light Guide</td><td>MORITEX Corporation</td><td>MSG10-2200S</td><td>Epi-Illuminatinon</td></tr><tr><td>Condenser Lens</td><td>MORITEX Corporation</td><td>ML-50</td><td></td></tr><tr><td>PLANAPO 5.0X</td><td>Leica Microsystems</td><td>10447243</td><td>Objective Lens</td></tr><tr><td>PLANAPO 1.0X</td><td>Leica Microsystems</td><td>10447157</td><td>Objective Lens</td></tr><tr><td>PLANAPO 1.6X</td><td>Leica Microsystems</td><td>10447050</td><td>Objective Lens</td></tr><tr><td>Beam-Splitter</td><td>Brainvision Inc.</td><td>FLSP-2</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Mirror 665nm</td><td>Brainvision Inc.</td><td>DM665</td><td>Beam-Splitter</td></tr><tr><td>Emission Filter 572/28nm</td><td>Edmund Optics</td><td>#84-100</td><td>Rhod2-AM</td></tr><tr><td>Emission Filter 697/75nm</td><td>Semrock, Inc.</td><td>FF01-697/75-25</td><td>RH237 and Di-4-ANEPPS</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>671201</td><td></td></tr><tr><td>aluminum foil</td><td>Toyo alumi</td><td>0020</td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping

Recenti studi di associazione genome-wide targeting per la fibrillazione atriale (AF) hanno indicato una forte associazione fra il genotipo ed il fenotipo elettrofisiologico negli atrii. Che ci incoraggia ad utilizzare un modello di topo geneticamente per delucidare il meccanismo di AF. Tuttavia, è difficile valutare le proprietà elettrofisiologiche in atri murini grazie alle loro piccole dimensioni. Questo protocollo descrive la valutazione elettrofisiologica degli atrii utilizzando un sistema di mappatura ottico con un'alta risoluzione temporale e spaziale nei cuori murini Langendorff irrorati. Il sistema di mappatura ottico è assemblato con ossido di metallo complementare ad alta velocità dual semiconductor fotocamere e lenti dell'obiettivo ad alto ingrandimento, per rilevare la fluorescenza di un colorante tensione-sensibili e Ca2 + indicatore. Per concentrarsi sulla valutazione degli atrii murini, ottico mapping viene eseguito con una superficie di 2 × 2 mm o 10 mm x 10 mm, con un 100 × 100 ad alta risoluzione (20 µm/pixel o 100 µm/pixel) e frequenza di campionamento fino a 10 kHz (0.1 ms) al massimo. Un elettrodo quadripolar 1-francese dimensioni catetere di stimolazione è collocato nell'atrio destro attraverso la vena cava superiore evitando danni meccanici all'atrio, e la cadenza di stimolazione è trasportata attraverso il catetere. Uno studio elettrofisiologico viene eseguito con stimolazione programmata tra cui cadenza costante, burst pacing e fino a tripla extrastimuli stimolazione. In modo spontaneo o cadenza ritmica, la mappatura ottica registrata la durata del potenziale d'azione, mappa di attivazione, velocità di conduzione e Ca2 + transitoria individualmente negli atri destro e sinistro. Inoltre, la stimolazione programmata determina anche la 270ms dei tachyarrhythmias atriali. Mappatura precisa attivazione viene eseguita per identificare la propagazione dell'eccitazione nell'atrio durante una tachiaritmia atriale indotta. Ottica mapping con un ambiente specializzato consente un'approfondita valutazione elettrofisiologica dell'atrio in modelli murini di patologie.

Gli esperimenti di mappatura ottico vengono eseguiti utilizzando i dispositivi come mostrato in Figura 1a. Lo schema del sistema ottico è illustrato in Figura 1b. Il sistema fornisce un'analisi ad alta risoluzione del potenziale di membrana e Ca2 + transitoria nell'atrio.
Come raffigurato in Figura 1 c e d, il cuore isolato è posizionato in una camera a temperatura controllata. Un catetere di elettrodo di misura 1-francese viene inserito nella RA attraverso un tubo di PE inserito nel SVC e un altro tubo PE indwelling è inserito nella cavità LV dall'apice LV per evitare una pressione eccessiva sulla camera di cuore. Per una registrazione simultanea di ECG, il catodo (lead ECG [-]) è collegato all'ago di inserimento di una canula e l'anodo (cavo ECG [+]) è collegato all'elettrodo pin inserito all'apice ventricolare. La caratteristica di questa Assemblea è per evitare danni meccanici agli atrii.
Per la valutazione della tensione della membrana, fluorescenza usando di-4-ANEPPS è registrato con fino ad un tasso di campionamento di 10.000 fotogrammi/s (Figura 2). La mappa di attivazione è ottenuta durante la cadenza costante consegnato da RA. La mappatura fine consente l'analisi del modello dettagliato di conduzione in piccoli atri murini.
La figura 3 illustra rappresentante tracce delle tensioni di membrana e Ca2 + transitoria in LA utilizzando RH237 e Rhod2AM durante la cadenza costante da RA. Riduciamo la frequenza di campionamento di mapping da 1000 fotogrammi/s per ottenere un rapporto segnale/rumore sufficiente del segnale Rhod2AM con l'impostazione attuale. Tuttavia, il sistema fornisce una qualità sufficiente per analizzare il rapporto tra il potenziale d'azione e Ca2 + transitoria.
Quindi eseguiamo un'induzione di una tachiaritmia atriale con stimolazione programmate utilizzando topi sotto una condizione patologica. Figura 4 esibisce una registrazione ottica di un indotto AT in un atrio murino macchiato con di-4-ANEPPS. Il mouse subisce un procedimento di restringimento aortico trasversale per applicare un sovraccarico di pressione all'atrio di 10 giorni prima l'esperimento6. Abbiamo indurre AT extrastimuli tripla stimolazione (120/100/100/80) e osservare la propagazione del circuito rientrante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig1.jpg"> Figura 1. Sistema ottico mapping. r. Assemblea generale del sistema di mappatura elettrofisiologia/ottico. b. schema della composizione del sistema ottico mappatura: la freccia blu indica la luce di eccitazione generata dalla sorgente luminosa. La lente dell'obiettivo possono essere scambiata con la torretta. La luce emessa dal cuore macchiato è diviso tra telecamera 1 e la telecamera 2. 1 la fotocamera rileva i segnali di lunghezza d'onda per la tensione di membrana, e fotocamera 2 registra le lunghezze d'onda con un filtro passa-banda di 580 ± 20 nm per il transitorio2 + Ca. Durante la procedura, l'ECG e l'aspersione pressione vengono registrati continuamente, e il segnale ECG è anche contemporaneamente importato nella mappa dell'ottica software di registrazione. c. preparazione dei cuori isolati: I cuori sono cannulati con un ago smussato tramite aorta ascendente per aspersione. Per registrazioni simultanee di ECG, il catodo è collegato all'ago di inserimento di una canula e l'anodo con l'elettrodo a perno viene inserito l'apice ventricolare. d. tubo di inserimento di una canula e gli elettrodi: il cuore è cannulato con un ago di calibro 21 smussato per aspersione (ago di inserimento di una canula). Una dimensione di 1-francese stimolando elettrodo (elettrodo) è collocata nell'atrio di destra attraverso un tubo di polietilene inserito nella vena cava superiore. La camera di vetro è riscaldata a 37 ˚ c da circolazione nella cavità della camera dell'acqua riscaldata. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56478/56478fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig2.jpg"> Figura 2. Mappa di attivazione nell'atrio. r. rappresentante attivazione mappe nella vista anteriore con obiettivo 5x e b. la vista posteriore con un 1,6 X lente obiettiva. (Pannello sinistro) Disegno schematico del cuore isolato e atrio. (Pannello di destra) Mappa di attivazione dell'atrio sinistro ottenuta con di-4-ANEPPS colorazione a 10.000 fotogrammi/s. La registrazione viene eseguita sotto stimolazione costante con l'elettrodo stimolante collocato nell'atrio di destra. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56478/56478fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig3.jpg"> Nella figura 3. Doppia registrazione del potenziale d'azione e Ca2 + transitori in atrio sinistro. r. schematica del cuore isolato. b. immagine rappresentativa dell'intensità della fluorescenza nell'atrio di sinistra usando RH237 per la tensione di membrana (Vm) e Rhod2AM per i transienti del Ca2 + . La registrazione viene eseguita con un obiettivo di obiettivo X 5 a 1.000 fotogrammi/s. c. Registrazione simultanea del ECG (in alto), segnale di RH237 (al centro) e Rhod2AM segnale (in basso), durante la cadenza costante con l'elettrodo di stimolazione nell'atrio di destra. Le frecce nere indicano i picchi di stimolazione e frecce gialle l'eccitazione ventricolare. Un effetto di dispersione della luce dal ventricolo anche possa essere osservato (frecce gialle) sia nel segnale di RH237 e Rhod2AM segnale. d. una traccia unita RH237 e Rhod2AM. Il potenziale d'azione e Ca2 + cambiamenti transitori sono registrati simultaneamente. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56478/56478fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig4.jpg"> Figura 4. Mappatura di attivazione durante la tachicardia atriale. (Pannello sinistro) Disegno schematico del cuore isolato. (Pannello centrale) Mappa di attivazione durante una tachicardia atriale (AT). AT è stata indotta da stimolazione tripla extrastimuli consegnato dall'atrio di destra. (Pannello di destra) Mappa di attivazione durante ritmo sinusale nel cuore stesso del mouse. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56478/56478fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Film supplementare 1. Film rappresentativi della membrana potenziale nell'atrio usando la macchiatura con di-4-ANEPPS. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56478/Supplementary_movie_1.zip">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Film supplementare 2. Film rappresentativo del mapping dell'attivazione durante il ritmo del seno e della tachicardia atriale. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56478/Supplementary_movie_2.zip">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

Questo protocollo descrive la valutazione elettrofisiologica degli atrii murini che utilizza un sistema di mappatura ottico con un'alta risoluzione temporale e spaziale, tra cui registrazioni duale della tensione della membrana e Ca2 + transitoria sotto programmato stimolazione tramite un catetere elettrodo specializzato.

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

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Medicine

9.7K Views.  Tokyo Medical and Dental University. Questo protocollo descrive la valutazione elettrofisiologica degli atrii murini che utilizza un sistema di mappatura ottico con un'alta risoluzione temporale e spaziale, tra cui registrazioni duale della tensione della membrana e Ca2 + transitoria sotto programmato stimolazione tramite un catetere elettrodo specializzato.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Ricerca

Bioingegneria

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

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High-Resolution Endocardial and Epicardial Optical Mapping in a Sheep Model of Stretch-Induced Atrial Fibrillation

Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance seen in clinical practice and its prevalence is expected to increase in the coming years.3 Increased intra-atrial pressure and dilatation have been long recognized to lead to AF,1,4 which highlights the relevance of using animal models and stretch to study AF dynamics. Understanding the mechanisms underlying AF requires visualization of the cardiac electrical waves with high spatial and temporal resolution. While high-temporal resolution can be achieved by conventional electrical mapping traditionally used in human electrophysiological studies, the small number of intra-atrial electrodes that can be used simultaneously limits the spatial resolution and precludes any detailed tracking of the electrical waves during the arrhythmia. The introduction of optical mapping in the early 90's enabled wide-field characterization of fibrillatory activity together with sub-millimeter spatial resolution in animal models5,6 and led to the identification of rapidly spinning electrical wave patterns (rotors) as the sources of the fibrillatory activity that may occur in the ventricles or the atria.7-9 Using combined time- and frequency-domain analyses of optical mapping it is possible to demonstrate discrete sites of high frequency periodic activity during AF, along with frequency gradients between left and right atrium. The region with fastest rotors activates at the highest frequency and drives the overall arrhythmia.10,11 The waves emanating from such rotor interact with either functional or anatomic obstacles in their path, resulting in the phenomenon of fibrillatory conduction.12 Mapping the endocardial surface of the posterior left atrium (PLA) allows the tracking of AF wave dynamics in the region with the highest rotor frequency. Importantly, the PLA is the region where intracavitary catheter-based ablative procedures are most successful terminating AF in patients,13 which underscores the relevance of studying AF dynamics from the interior of the left atrium. Here we describe a sheep model of acute stretch-induced AF, which resembles some of the characteristics of human paroxysmal AF. Epicardial mapping on the left atrium is complemented with endocardial mapping of the PLA using a dual-channel rigid borescope c-mounted to a CCD camera, which represents the most direct approach to visualize the patterns of activation in the most relevant region for AF maintenance.

This report provides a detailed description of the methodology and results of simultaneous endocardial and epicardial optical mapping of electrical excitation in the intact left atrium of a Langendorff-perfused sheep heart during stretch-induced atrial fibrillation.

Ad alta risoluzione Mappatura endocardica e epicardici ottico in un modello di pecora Stretch indotta fibrillazione atriale

 Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance ...

Medicina

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biologia

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Analisi ad alta velocità effettiva dei dati di mappatura ottica tramite ElectroMapHigh-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Optocardiografia ed elettrofisiologia Studi di Ex Vivo Langendorff-perfusi

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensione e Calcio mappatura ottica a doppio canale di Colta HL-1 atriale miociti monostrato

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

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