Name: inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system
Uploaded: 2016-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System at JoVE.com

This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].

1. Il blocco della replica con FROS <ol><li> Indurre la replica Blocco <ol><li> Diluire una coltura fresca durante la notte di E. coli ceppo portante una matrice TETO e pKM1 18 a OD 600nm = 0.01 in un mezzo complesso diluita (0,1% triptone, 0,05% estratto di lievito, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) con antibiotici come richiesto per la selezione. Nota: non aggiungere tetraciclina per la selezione in quanto non è compatibile con questo sistema. Rendere il volume della coltura equivalente a 10 ml per campione richiesto. Ad esempio, il volume di coltura per il disegno sperimentale in figura 1 è di 60 ml. </li><li> Crescere a 30 ° C con agitazione fino a OD 600 nm = 0,05-0,1. Rimuovere un campione di 10 ml per servire come controllo uninduced e aggiungere 0,1% arabinosio alla cultura rimanente per indurre la produzione di TetR-YFP da pKM1. Continuare a crescere sia il non indotte e indottoculture. Dopo 1 ora, verificare la presenza di un unico punto focale all&#39;interno di ogni cellula della cultura indotta utilizzando la microscopia a fluorescenza (vedere paragrafo 2). </li><li> Se le cellule indotte sono confermati bloccato (oltre il 70% delle cellule hanno un unico fuoco), registrare l&#39;600nm OD e prendere un campione di 7,5 ml per l&#39;analisi gel 2-D (vedi sezione 3). Prendere un campione equivalente dalla cultura di controllo non indotte. </li></ol></li><li> Rilasciando la replica Blocco <ol><li> Per rilasciare il blocco di replica, aggiungere 100 ng ml -1 del anhydrotetracycline induttore gratuita (AT) per un campione di cellule bloccate 10 ml. Continua a crescere a 30 ° C per 10 min e prelevare campioni di densità cellulare (1 ml), analisi al microscopio (10 microlitri) e neutro-neutro gel di agarosio 2-dimensionali (7,5 ml). </li></ol></li><li> Indurre Crollo del replisoma <ol><li> Se le celle contengono un allele sensibile alla temperatura, come ts dnaB o TS dnaC che richiede deactivazione, spostare il pallone contenente le cellule bloccate a 42 ° C. Prelevare campioni per analisi in momenti richiesti (ad esempio, 1 ora dopo l&#39;incubazione). Dopo che le cellule sono incubate a 42 ° C per 1 ora, spostare le cellule a 30 ° C per 10 min (vedere Figura 1). Nota: Le cellule possono essere spostati a 30 ° C per l&#39;analisi riavvio. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig1.jpg" /> Figura 1:. Panoramica sulla procedura di blocco e di rilascio sperimentale FROS replica E. ceppi coli che trasportano l&#39;array Teto sono coltivate a 30 ° C. Quando le cellule raggiungono un 600nm OD superiore a 0.05, produzione TetR-YFP è indotta con arabinosio (ara; 0,1%). Continua a crescere una sottopopolazione di cellule indotte ad agire come controlli a 30 ° C. Un campione di cellule indotte viene analizzata tramite microscopia a fluorescenza dopo 1 - 2 h (vedere 2.1). Se la replica èconfermato di essere bloccato, vengono prelevati campioni per l&#39;analisi del gel 2-D indicata dalle provette (vedi 3.1) e test di vitalità (opzionale). Il blocco replica può essere rimosso con anhydrotetracycline (AT; 0,1 mg / ml) e le cellule analizzate 10 min più tardi. Se le cellule portano un allele sensibile alla temperatura (ad esempio dnaB ts), questo può essere inattivato spostando le cellule bloccate a 42 ° C per l&#39;analisi del caso. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. microscopia a fluorescenza <ol><li> Preparare un tampone agarosio pipettando 500 ml di agarosio fuso (1% in acqua) su un vetrino da microscopio; sovrapporre il vetrino immediatamente prima delle solidifica agarosio. Conservare la slitta (s) in tessuti bagnati a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Quando l&#39;agarosio si è solidificato, rimuovere il vetrino dal pad agarosio e pipetta 10 ml di battericultura sul centro del pad per impedire il movimento delle cellule durante la visualizzazione. Una volta che il campione è essiccato (circa 5 minuti), sostituire il vetrino. Mettere una goccia di olio di immersione sul vetrino e porre il vetrino sotto l&#39;ottica. </li><li> Visualizzare le cellule con la funzione Phase Microscopia a 100X ingrandimento. <ol><li> Nella finestra di dialogo Acquisisci all&#39;interno del software di imaging, impostare il tempo di esposizione a 100 msec. Acquisire l&#39;immagine selezionando Acquire. Non spostare il palco. Nella finestra di dialogo Acquisisci, selezionare YFP come l&#39;illuminazione per l&#39;otturatore esterno collegato alla fotocamera. Impostare il tempo exporsure a 1.000 msec. Spegnere la luce della fase. Acquisire l&#39;immagine di fluorescenza selezionando Acquire. Nota: Il tempo può variare a seconda della fonte di luce, microscopio e fotocamera utilizzata. </li><li> Per sovrapporre la fase e le immagini fluorescenti, selezionare Colore Combina dall&#39;interno del menu Display. Nella colore Combina finestra di dialogo, selezionare l&#39;immagine YFP come l&#39;immagine di fase come il bl componente verde ecomponente ue. Fare clic sul colore combinare. Determinare se la popolazione ha avuto replica bloccato da stabilire se la maggior parte delle cellule hanno un fuoco per cella. Nota: confronto ad un campione dal controllo senza arabinosio aggiunto è utile per identificare visivamente la differenza nella produzione EYFP. </li></ol></li></ol> 3. Spine DNA Estrazione / Agarose <ol><li> Aggiungere azide di sodio (concentrazione finale dello 0,1%) per i campioni di 7,5 ml di coltura da passi 1.1.3 e 1.2.1. Incubare in ghiaccio per almeno 5 minuti. Nota: sodio azide è estremamente tossico. Consultare la scheda di sicurezza prima di iniziare il lavoro e non maneggiare fino a quando tutte le misure di sicurezza sono state lette e comprese. </li><li> Centrifugare le cellule 5.000 xg per 10 minuti per far sedimentare le cellule. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml di Pett IV (PIV) tampone (10 mM Tris: HCl (pH 8.0), 1 M NaCl). Microcentrifuga (13, 000 xg per 2 minuti) per far sedimentare le cellule. discard il surnatante. In questa fase, il processo di pellet ulteriormente o conservare a -20 ° C. </li><li> Risospendere le cellule con la più bassa densità cellulare in 50 microlitri PIV e posto a 50 ° C. Per tutti gli altri campioni, regolare il volume di PIV così la densità cellulare finale è la stessa in ogni tubo (es Campione 1 (OD 600nm = 0,128) risospeso in 50 microlitri; Campione 2 (OD 600nm = 0,138) risospeso in 54 microlitri). <ol><li> Aggiungere un volume uguale di soluzione preparata di agarosio allo 0,8% in PIV (conc finale 0,4%;. Es Esempio 1 50 microlitri, Esempio 2 54 microlitri). Assicurarsi che i campioni, agarosio e PIV sono superiori a 50 ° C per evitare la solidificazione. </li></ol></li><li> Trattare un vetrino da microscopio con 40 ml di una soluzione di vetro idrorepellente o silicone appropriata. Strofinare il vetrino con un fazzoletto di carta fino a quando è asciutto. Nota: Questo può essere fatto in anticipo e le diapositive trattati conservato a lungo termine a temperatura ambiente. </li><li> Mettere 20 gocce microlitri di tegli sospensione cellulare / agarosio sul vetrino per la produzione di tappi che sono emisferica. Nota: Il primo campione (risospeso in 50 ul PIV) produrrà 5 spine su una diapositiva. </li><li> Quando le spine hanno solidificato, farle scivolare dolcemente in una provetta per microcentrifuga e aggiungere 1 ml di tampone di lisi cellulare (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M di NaCl, 100 acido mM etilendiamminotetraacetico (EDTA), lo 0,2% di sodio desossicolato, 0,5% sale di N-Lauroylsarcosine sodio (Sarkosyl), 100 mcg ml - 1 lisozima, 50 mcg ml - 1 RNasi A). Incubare a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Rimuovere il tampone di lisi cellulare e aggiungere la soluzione 1 ml di EDTA / sarcosyl / proteinasi K (ESP) (0,5 M EDTA, 1% sale di sodio N-Lauroylsarcosine (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 proteinasi K). Incubare a 50 ° C durante la notte o fino a quando le spine sono trasparenti. Se è necessaria una seconda notte di incubazione, sostituire la soluzione ESP con tampone fresco dopo circa 18 ore. </li><li> Rimuovi ilESP tampone e lavare i tappi 5 volte con 12 ml di Tris-EDTA (TE) tampone (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), consentendo un 30 min in equilibrio con ogni lavaggio. Conservare a 4 ° C in 1 ml di tampone TE. </li></ol> 4. neutro-neutro 2-Dimensional elettroforesi su gel <ol><li> Trasferire una spina agarosio dal punto 3.8 a una provetta per microcentrifuga fresco e aggiungere 150 ml di tampone enzima di restrizione (1x concentrazione). Aggiungere 25-100 unità di enzima di restrizione (ad esempio, 60 unità di EcoRV; (vedi Figura 3A)). Digest a 37 ° C per 6-8 ore. </li><li> Al 4 ° C, versare un gel di agarosio 0,4% (300 ml) in 1x Tris / borato / EDTA (TBE) in un vassoio di gel di circa 25 x 25 cm. Inserire un pettine per rendere pozzetti circa la stessa larghezza del diametro della spina. Quando il gel è impostato, rimuovere il pettine e spostare il gel a temperatura ambiente. </li><li> Infilare una delle spine agarosio digeriti in un pozzo, posizionando la slitta piatta della spina contro il lato del pozzo dove tegli DNA entrerà nel gel. Inserire una sola spina nello stesso modo in ogni secondo pozzo. </li><li> Pipettare fuso 0,4% agarosio nei pozzetti per sigillare i tappi in posizione. </li><li> Carico 1 kb scala del DNA in un pozzo vuoto, lasciando ancora un divario tra la scala e campioni, ed eseguire il gel durante la notte (16 ore, 55 V) a 1x TBE a temperatura ambiente. </li><li> Macchia il gel in un bagno di acqua contenente etidio bromuro (0,3 mg ml -1) per 20 min. Nota: il bromuro di etidio è considerato un agente mutageno potente ed una tossina. Consultare la scheda di sicurezza prima di iniziare il lavoro e non maneggiare fino a quando tutte le misure di sicurezza sono state lette e comprese. </li><li> Visualizzare il DNA con un transilluminatore UV a onde lunghe e tagliare ogni frammento corsie con una retta, anche tagliare, minimizzando l&#39;inclusione di eccesso di agarosio su entrambi i lati della corsia. Nota: Ad esempio, se il frammento di interesse è di 5,5 kb, tagliare un frammento di 7,5 centimetri per includere i frammenti di DNA da 5 kb al approximatEly 12 kb (vedi Figura 3A). </li><li> Posizionare la corsia di gel asportato in un vassoio di gel a 90 ° direzione di migrazione del DNA. Nota: Due file di 3 frammenti di gel può andare bene in un vassoio di gel 25 x 25 2 cm. La prima fila di corsie del gel è nella parte superiore del vassoio, la seconda fila a 12.5 cm. </li><li> Preparare 300 ml di agarosio per la seconda gel di dimensione (0,9% nel 1 x TBE con 0,3 mg ml -1 bromuro di etidio). Quando l&#39;agarosio si raffredda a 50 ° C, pipetta la agarosio fuso attorno alle fette di gel a solidificare la loro posizione. Versare il agarosio rimanenti nel vassoio per una profondità che è almeno di livello con le fette di gel. </li><li> Una volta che il gel è solidificato, elettroforesi a 4 ° C in TBE 1x contenente 0,3 mg ml -1 bromuro di etidio a 220 V fino a quando il DNA è migrata circa 10 cm. Nota: 4 ore è sufficiente per un frammento di 5,5 kb che un frammento più piccolo avrà bisogno di meno tempo. </li><li> Asportare i blocchi in cui il DNA genomico è presente ucantare bordo di un righello di metallo, compreso il gel sopra includere il DNA non visibile (Figura 3C). </li></ol> 5. Ibridazione del sud <ol><li> soluzione Preparazione <ol><li> Preparare depurinazione tampone (0,125 soluzione M HCl). Nota: Questo buffer può essere riutilizzato ed è stabile a temperatura ambiente per 1 mese. </li><li> Preparare denaturazione tampone (1,5 M di NaCl, 0,5 M NaOH). Nota: denaturazione buffer può essere riutilizzato una volta ed è stabile per un massimo di 3 mesi a temperatura ambiente. </li><li> Preparare tampone di neutralizzazione (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Regolare a pH 7.5 con HCl. Nota: tampone di neutralizzazione può essere riutilizzato una volta ed è stabile per 3 mesi a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 10x Saline citrato di sodio (SSC) tampone (0,15 M citrato trisodico, 1,5 M di NaCl, pH è 7 - 8) per l&#39;uso in passi 5.2.4 e 5.2.6. Da questo buffer, fare una SSC magazzino 2x (per l&#39;uso in fase 5.2.9). Nota: 10x SSC e 2x SSC unri stabile a temperatura ambiente per 3 mesi. </li><li> Preparare Chiesa e Gilbert Hybridization Buffer 19 Modified (0,5 M tampone fosfato [pH 7,2], 7% (w / v) di sodio dodecil solfato (SDS), 10 mM EDTA). Lasciare a 65 ° C per sciogliere completamente prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Trasferimento <ol><li> Sciacquare i blocchi di gel asportati in soluzione depurinazione per 10 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo o agitatore orbitale. Mantenere la velocità di agitazione basso per evitare di danneggiare i blocchi agarosio. </li><li> Risciacquare i blocchi gel brevemente con acqua distillata e quindi con tampone di denaturazione per 30 min. Risciacquare ancora brevemente in acqua distillata e quindi incubare i blocchi di gel in tampone di neutralizzazione per 30 minuti con agitazione a temperatura ambiente. </li><li> Tagliare una membrana di nylon alla dimensione esatta del gel (s). Tagliare un nick in alto a destra per aiutare a orientare la membrana nei passaggi futuri. Nota: Due blocchi gel (6 campioni) può essere visualizzato su una membrana. </li><li> Versare abbastanza 10x SSC in un TRay modo che non si secca durante la notte. Creare una piattaforma circa 5 cm sopra il livello del buffer. Saturare 3 fogli di carta per cromatografia 3MM con 10x SSC e posto sulla piattaforma. Tagliare la carta cromatografia in modo che sia abbastanza lungo per essere immerso in tampone a entrambe le estremità e largo abbastanza da contenere il gel membrana sulla. </li><li> Porre il gel (s) sulla parte superiore della carta cromatografia satura. Inquadrare il gel con involucro di plastica per evitare il buffer by-passando il gel durante il trasferimento. Adagiare la membrana taglio sulla superficie del gel (s). Rimuovere le bolle d&#39;aria tra la membrana e il gel rotolando una bottiglia o una pipetta sierologica dolcemente attraverso la membrana. </li><li> Tagliare tre fogli di carta cromatografia 3MM alle stesse dimensioni della membrana. Saturare i fogli di carta per cromatografia con 10x SSC e posto sulla parte superiore della membrana. Rimuovere eventuali bolle d&#39;aria che si sono formate. </li><li> tovaglioli di carta Stack di almeno 5 cm sulla parte superiore della carta assorbente seguito da un supporto solido (approPeso ximate di 1 kg per una membrana 23 x 16 cm). Lasciare che il trasferimento di procedere durante la notte. </li><li> Esporre la membrana (DNA lato alto) a 1,200 J / m 2 di UV per reticolare il DNA alla membrana. Non sciacquare prima di questo passaggio. </li><li> Sciacquare accuratamente la membrana in 2x SSC per evitare fondo elevato sulle immagini macchia. Utilizzare la macchia immediatamente per l&#39;ibridazione (vedi 5.3) o asciugare a temperatura ambiente, avvolgerlo nella pellicola trasparente e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> ibridazione <ol><li> fornetto Preriscaldare e bottiglie a 55 ° C. </li><li> Aggiungere 100 mcg ml -1 di albumina sierica bovina (BSA) e 10 mg ml -1 DNA non specifico (ad esempio, il salmone DNA spermatico) nel buffer di pre-riscaldato ibridazione. </li><li> Per consentire anche per la copertura del tampone di ibridazione quando la membrana viene arrotolata, collocare il blot su un quadrato di dimensioni simili di rete di nylon con il lato DNA-bound della membrana rivolta verso l&#39;alto. Arrotolare la macchia lungo il suo lato lungo. Diapositivala macchia / mesh all&#39;interno di una bottiglia di ibridazione. Aggiungere una quantità appropriata di tampone di ibridazione preriscaldato a srotolare il blot (ad esempio 30 ml per un cm 2 membrana 23 x 16). </li><li> Incubare in un forno preriscaldato, ruotare le bottiglie, per 1 ora. </li><li> Preparare la sonda mescolando 50 ng purificato omologo prodotto di PCR per la regione di interesse, 150 ng di primer esameriche casuali, tampone per frammento di Klenow e H 2 O per fare un volume di 13 microlitri. Far bollire per 3 minuti poi posto immediatamente sul ghiaccio. Aggiungere 1 ml di 1 mm dCTP / dGTP / dTTP mix, 1 ml di frammento di Klenow (5U) e 50 pCi deossiadenosina radiomarcato 5&#39;-trifosfato sul alfa fosfati (α 32 P-dATP). </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Aggiungere 1 ml di 1 mM dNTP mix e 1 ml di Klenow frammento. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Far bollire Sonda per 5 minuti e aggiungere immediatamente ai tubi di ibridazione. Ibridare overnight a 55 ° C, con rotazione. </li><li> Decantare il prOBE dalla membrana. Nota: La sonda può essere riutilizzato una volta. </li><li> Sciacquare la membrana brevemente nel pre-riscaldato, tampone di lavaggio a bassa severità (2x SSC, 0,1% (w / v) di SDS). Aggiungere fresca tampone di lavaggio a bassa severità e incubare per 5 minuti a 55 ° C con rotazione. Ripetere. </li><li> Lavare due volte in tampone di lavaggio medio stringenza (1x SSC, 0,1% (w / v) di SDS) per 10 min a 55 ° C con rotazione. </li><li> Lavare due volte in tampone di lavaggio stringenza elevata (0.1x SSC, 0.1% (w / v) di SDS) per 5 min a 55 ° C con rotazione. </li><li> Rimuovere la membrana e tamponare con il tessuto per rimuovere il liquido in eccesso. Avvolgere nella pellicola garantire che vi sia alcun residuo di umidità sulla pellicola trasparente e posto in cassette di esposizione con uno schermo di memorizzazione fosforo pre-oscurata. Chiudere la cassetta ed esporre per almeno 2 ore prima della visualizzazione utilizzando un imager fosforo. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most common impediment to replisomes in living cells is a nucleoprotein block2. However, two longstanding difficulties in studying the collision of a replisome with a nucleoprotein blockage have been how to localize the event to a known position on the chromosome and how to make the event frequent enough to allow detailed analysis. The majority of the knowledge of how E. coli copes with stalled/collapsed replication forks comes from the use of UV as a DNA damaging agent. 
The FROS protocol described here is a novel way of creating a site-specific nucleoprotein roadblock, similar to what the replisome will meet when it encounters proteins tightly bound to the chromosome during replication. The induced blockage and controlled release of this block allows the stages of DNA processing to be studied in discrete steps. The array of tetO sites used to block replication has previously been utilized to visualize chromosome organization9,10. While the array can be placed anywhere in the chromosome, for the purpose of the array described here, it should be distant from both the origin and the terminus to avoid complications in interpreting the signals observed from second rounds of initiation at the origin or from the replication fork proceeding around the opposite replichore. By optimizing the overproduction of TetR with the use of the dilute complex medium (protocol 1), we have found that sufficient TetR is produced to create a complete replication blockage that is stably maintained, while limiting the number of new rounds of replication that are initiated. The incorporation of replisome temperature sensitive mutations22 into the system ensures all replisomes are deactivated simultaneously and uncontrolled replisome reloading is prevented.
Whilst the number of foci per cell are useful for knowing the cell's replication status, the most enlightening data for DNA repair is from the analysis of the replication intermediates revealed by 2-D gel electrophoresis during an active replication blockage. Analysis of different genetic backgrounds can identify proteins involved in processing and restart of collapsed replication forks by the different patterns observed following the 2-D gel protocol. Further, intermediates from the processing of collapsed replication forks can be present at the array region or in the DNA upstream of the array, and can be visualized using 2-D gel electrophoresis. Creating duplicate agarose plugs (Protocol 3) has the advantage of allowing for digestion of the same sample with different restriction enzymes to be able to visualize replication intermediates in successive DNA regions. Therefore, the array region should be located in a position where appropriate restriction enzymes can be used to probe these regions of interest using Southern hybridization. 
The most common reasons that this technique may be unsuccessful are having either too little DNA which produces faint signals compared to background, or incomplete digestion of the DNA within the plugs. This can be caused by having too much DNA in the agarose plugs or the carry-over of some inhibitor from the lysis/washing steps. The number of cells taken for lysis within the agarose plugs may need to be varied from the protocol described here if modifications such as growth media are changed. However, it is futile to continue with the hybridization if the DNA in the plugs has not digested to completion. A repeat treatment of ESP may be required to better prepare the DNA (protocol 3.6). 
If the replication intermediates that are of interest are only transient, or are particularly rare within the cell, the DNA sample may need to be enriched for them, for example with the use of BND-cellulose which will bind short stretches of single stranded DNA, such as those found in replicating chromosomes23. Stabilization of replication intermediates by crosslinking with psoralen has also been used as a method of preserving DNA integrity24. When the intermediates are rare, it is important to optimize the probe and blocking of the membrane to prevent background signals from interfering. On completion of the blots the signals may be quantified with appropriate image processing software.
The protocol described here is an optimized system for creating a site-specific nucleoprotein blockage and analyzing replication intermediates when the replisome is unable to proceed through the blockage. With the establishment and optimization of this technique, the roles of various helicases and recombination proteins in processing the replication fork and in allowing the restart of replication can be identified. By varying the genetic background, the effect of the absence of these proteins can be analyzed. However, this technique is limited by requiring not only viable strains but strains that are also able to overproduce TetR at a rate that will create a stable nucleoprotein blockage.

Durante la replicazione del DNA, la replisoma affronta gli ostacoli sul DNA che compromettono la sua progressione. Danno al DNA comprese lesioni e le lacune così come le strutture aberranti possono impedire la replisoma di procedere 1. Recentemente, si è trovato che le proteine ​​legate al DNA sono la fonte più comune di impedimento alla replica progressione forcella 2. La conoscenza degli eventi seguenti l&#39;incontro del replisoma con un blocco nucleoproteina è stata precedentemente limitata dalla incapacità di indurre un tale blocco nel cromosoma di una cellula vivente in una posizione nota. In vitro analisi ha migliorato la nostra comprensione del comportamento cinetico di un replisoma attiva quando incontra un blocco nucleoproteina 3, nonché i dettagli meccanicistici della replisoma sé 4,5. Comprensione corrente della riparazione di replica viene generalmente effettuata con UV come agente dannoso e studiata utilizzando DNA plasmidico in vivo 6-8 </sup&gt;. Mentre le proteine ​​che possono essere coinvolti nella riparazione del DNA dopo incontra un blocco in vivo nucleoproteine ​​sono generalmente inteso da questi studi, se ci sono variazioni di eventi molecolari all&#39;interno delle vie di riparazione a causa della causa distinta nel blocco di replica è ancora ancora essere determinati. Qui, descriviamo un sistema che permette un blocco nucleoproteina da stabilire in una posizione specifica del cromosoma con un System Operator Repressor fluorescente (FROS). Utilizziamo un ceppo di E. coli che ha avuto una serie di 240 siti Teto incorporati nel cromosoma 9. Ogni sito Teto all&#39;interno della matrice ha un 10 bp sequenza casuale fiancheggiante di aumentare la stabilità della matrice impedendo ricombinazione RecA mediata all&#39;interno della matrice. Questo array, e variazioni di esso, sono stati inizialmente utilizzati per comprendere E. coli dinamica dei cromosomi 10,11, ma sono stati poi adattati alle Prevent in vivo la replicazione 12. L&#39;array è stato trovato per essere stabilmente mantenuto e per bloccare quasi il 100% delle forcelle di replica quando vincolato TetR 10,12. L&#39;uso della matrice simile Laco in vitro ha trovato sole 22 siti erano sufficienti a bloccare il 90% di replica, anche se questa matrice inferiore era meno efficace in vivo 13. Per adattare la matrice per creare un blocco nucleoproteina, la proteina repressore deve essere altamente overproduced in condizioni ottimali in cui si lega poi alla matrice per creare un posto di blocco. La formazione del blocco, e il suo successivo rilascio, possono essere monitorate attraverso l&#39;uso di microscopia a fluorescenza se viene utilizzata una variante fluorescently etichettato del repressore Tet. Lo stato della replica in ciascuna cella è indicato dal numero di focolai visto, in cui un unico punto focale significa solo una copia della matrice è presente all&#39;interno della cellula e multiple foci sono indicativi di replicazione attiva. Questa ri attivaplicatura è abilitata quando il blocco nucleoproteina viene invertita mediante l&#39;aggiunta di induttore gratuito che riduce l&#39;affinità di legame del TetR per il sito dell&#39;operatore sufficientemente per la replisoma procedere attraverso l&#39;array. La proteina repressore è ancora in grado di legarsi al DNA con elevata affinità sufficiente che le società più copie della matrice possono essere visualizzati. Maggiori dettagli intricati degli eventi presso il blocco nucleoproteina può essere scoperto usando neutro-neutro elettroforesi bidimensionale agarosio e ibridazione Southern 14-16. Queste tecniche permettono l&#39;analisi di strutture di DNA nella popolazione. Gli intermedi di replica che si formano durante l&#39;evento, e potenzialmente rimangono non riparato, può essere visualizzato. Variando l&#39;enzima di restrizione e la sonda utilizzata, gli intermedi possono essere visualizzati non solo nella regione di matrice, ma anche a monte della matrice quando la forca di replicazione regredisce 17,18. Ilregressione verificatosi dopo la dissociazione replisoma; principali ed afflitte filamenti nascenti separano dai fasci modello e ricottura tra loro come i fili template contemporaneamente ri-ricottura conseguente DNA struttura a quattro vie (una giunzione Holliday). Usando questo sistema è stato dimostrato che la forcella replica non è stabile quando rileva questo blocco 18. Inoltre, derivati ​​termosensibili di componenti replisoma possono essere utilizzati per impedire ricaricare alla forcella di replicazione una volta che è collassata. Una volta che un blocco viene stabilita, il ceppo può essere spostato ad una temperatura non permissive per garantire una disattivazione sincrono del replisoma e prevenzione controllata di ricaricare. La disattivazione di temperatura indotta assicura tutte le forche all&#39;interno della popolazione sono crollati in un dato tempo e permette la valutazione di ciò che accade quando il replisoma collassa, come il DNA viene elaborata, e ciò che è necessario per riavviare il processo di replicazione del DNA. Un vantaggio del sistema descritto qui è che il blocco nucleoproteina è completamente reversibile; Pertanto, la capacità delle cellule di recuperare dal blocco nucleoproteina può essere seguita. L&#39;aggiunta di anhydrotetracycline alle cellule sarà alleviare la stretta legame del repressore, permettendo una forchetta replica di procedere attraverso la cella e per ritrovare la vitalità. Il rilievo del blocco può essere visualizzata neutro neutro elettroforesi bidimensionale agarosio dopo 5 min, e mediante microscopia entro 10 min. Inoltre, l&#39;analisi redditività può rivelare la capacità del ceppo per recuperare dal blocco replica e continuano a proliferare. Alterando il background genetico dei ceppi utilizzati nella procedura sperimentale descritta qui, i percorsi di riparazione per questo tipo di blocco possono essere chiarite.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92144</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>For induction of TetR-YFP production</td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>Release of replication bloackage</td></tr><tr><td>Axioskop 2 Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>452310</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>eYFP filter set</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>Visualization of YFP</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-AG</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>MetaMorph&amp;nbsp; Software (Molecular Devices)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>For agarose plugs and gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Original Glass Water Repellent (Rain-X)</td><td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>For agarose plug manufacture</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td>VWRC103157P</td><td>TE, TBE buffer component</td></tr><tr><td>Ethylene diaminetetraacetic acid</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Bacteriostatic agent</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>TE buffer component</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>Cell lysis and ESP buffer component</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>ESP buffer component</td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 Cell</td><td>BioRad</td><td>1704507</td><td>Electrophoresis system</td></tr><tr><td>UV transilluminator 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>BioRad</td><td>1610433</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>TBE component</td></tr><tr><td>Hybond-XL nylon memrbane</td><td>Amersham</td><td>RPN203S</td><td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used</td></tr><tr><td>3MM Whatman chromatography paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern blotting</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>Crosslinking of DNA and hybridization</td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid from salmon sperm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Denaturation buffer component</td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>Wash buffer component</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Random Hexamer Primers</td><td>Bioline</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>Klenow fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor Screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Visualization of blot</td></tr><tr><td>Hybridization bottle</td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 mm x 300 mm</td></tr></tbody></table>

inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system

Ostacoli presenti sul DNA, tra cui proteine ​​strettamente legate e varie lesioni, può seriamente inibire la progressione del meccanismo di replicazione della cellula. Lo stallo di un replisoma può portare alla sua dissociazione dal cromosoma, in parte o integralmente, portando al collasso della forcella di replica. Il recupero da questo collasso è una necessità per la cella di precisione completa la duplicazione dei cromosomi e successivamente dividere. meccanismi diversi Pertanto, quando si verifica il crollo, la cella si è evoluta che si svolgono per ripristinare la forcella del DNA e consentire la replica da completare con l&#39;alta fedeltà. In precedenza, questi percorsi riparazione replicazione nei batteri sono stati studiati utilizzando danni UV, che ha lo svantaggio di non essere localizzato in un sito conosciuto. Questo manoscritto descrive un sistema che utilizza un sistema di fluorescenza Repressor Operator (FROS) per creare un blocco di proteine ​​site-specific che può indurre la fase di stallo e il crollo di replica FORKS in Escherichia coli. Protocolli dettaglio come lo stato della replica può essere visualizzato in singole cellule viventi utilizzando microscopia a fluorescenza e replicazione del DNA intermedi può essere analizzato da 2-dimensionale elettroforesi su gel di agarosio. Mutanti sensibili temperatura dei componenti replisoma (es DnaBts) possono essere incorporati nel sistema per indurre un crollo sincrona delle forche di replicazione. Inoltre, il ruolo delle proteine ​​ricombinazione e elicasi che sono coinvolti in questi processi possono essere studiate usando fori genetiche all&#39;interno di questo sistema.

Il FROS è un, blocco nucleoprotein site-specific inducibile che consente intermedi di replicazione da visualizzare nelle cellule viventi 12,18. Un disegno sperimentale generale per il campionamento delle cellule è illustrato in Figura 1. I tempi di campionamento e variazioni in background genetico fanno un sistema versatile per studiare la riparazione di un tale blocco. Lo schema illustra come mutanti sensibili alla temperatura, come ad esempio ts dnaB e TS dnaC che sono stati utilizzati in precedenza 18, possono essere utilizzati in questo sistema. L&#39;induzione dei FROS è stata effettuata in un E. coli come mostrato in Figura 1 per i ceppi sensibili non-temperatura. Per confermare che un blocco nucleoproteina era stato stabilito, le cellule sono state visualizzate mediante microscopia a fluorescenza, dopo 1 ora di crescita del 0,1% arabinosio. Questolasso di tempo è di solito sufficiente per produrre il blocco in un ceppo di tipo selvatico, ma i ceppi più esigenti possono richiedere l&#39;ottimizzazione. La maggior parte delle cellule conteneva 1 fuoco (figura 2A, + ara), corrispondente ad una sola copia della matrice all&#39;interno della cella indicando così la replicazione era stato bloccato. Il numero di cellule con 1 fuoco, 2 fuochi o più di 2 focolai sono stati contati in una popolazione di più di 100 cellule. Il 92% delle cellule sono stati trovati ad avere 1 messa a fuoco con il restante 8% con 2 fuochi. E &#39;stato presunto che le cellule che hanno avuto due fuochi ben distanziati, che rappresentano due copie della matrice, avrebbero il prossimo ciclo di replicazione bloccato. Le cellule con due fuochi vicini significano che l&#39;array è stato recentemente replicato e il blocco nucleoproteina non è stato ancora raggiunto. Il blocco nucleoproteina stato invertito mediante aggiunta di anhydrotetracycline (AT) e successiva duplicazione della matrice visualizzato comeaccumulo di cellule con focolai multipli (Figura 2A, + ara / AT). focolai multipli all&#39;interno di una cella visualizzato mediante fluorescenza Microcopy indicare la matrice è stato replicato con successo e il tempo sufficiente è passato per consentire al loci di muoversi a parte, superando ogni sorella cromosoma coesione che era presente. In questo caso, 10 minuti dopo l&#39;aggiunta di AT, 94% di cellule aveva 2 o più foci e fino a 8 focolai per cella sono state visualizzate. Per assicurarsi che il blocco nucleoproteina ha effettivamente inibire la replicazione, la vitalità cellulare è stata analizzata (Figura 2B). Le cellule che hanno avuto replica inibito dalle FROS mostrano una diminuzione circa 1000 volte formanti colonia unità rispetto alle cellule che non sono state coltivate in presenza di arabinosio. Le cellule che sono state successivamente coltivate in presenza di anhydrotetracycline mostra inversione di inibizione della crescita. Se le cellule sono state in grado di riparare il DNA dopo il rilasciodel blocco nucleoproteina, una riduzione della vitalità comporterebbe. Per visualizzare gli intermedi di replicazione, le cellule possono essere lisate all&#39;interno spine agarosio e la proteina e RNA rimossi. Il DNA può essere digerito con un enzima di restrizione appropriato per la regione di interesse. DNA nella Figura 3A è stato digerito con EcoRV che taglia il DNA immediatamente prima matrice, all&#39;interno della matrice e dopo l&#39;array di dare 5,5 kb e 6,7 kb frammenti nella regione di interesse (Figura 3B). I frammenti sono idealmente ~ 3-7 kb per il protocollo descritto qui. Frammenti di fuori di questo intervallo possono richiedere la modifica delle concentrazioni di agarosio utilizzati e le condizioni di elettroforesi per ottenere una buona separazione. Il DNA è stato elettroforesi nella prima dimensione e visualizzata (Figura 3A). Se il DNA ha digerito completamente, tutte le corsie avranno eseguito in modo uniforme e non ci saràuna quantità elevata di basso peso molecolare (inferiore a circa 3 kb, a seconda dell&#39;enzima di restrizione). DNA presente nel pozzo suggerisce lisi cellulare incompleta e un sacco di DNA ad alto peso molecolare (sopra 10 kb) implica incompleta digestione del DNA. Il DNA di interesse per ogni corsia è stato asportato. Nella Figura 3A, DNA sopra 5 kb era inclusa. La successiva seconda dimensione del gel è stato elettroforesi, causando una diagonale di DNA lineare (Figura 3C). Il DNA matrice all&#39;interno di questo gel è stato poi visualizzato mediante ibridizzazione Southern (Figura 3D). Nel sbloccato (- campione ara), due punti possono essere visti, corrispondenti ai 5,5 kb e 6,7 kb frammenti della matrice, come previsto. Il campione che aveva replica bloccato (+ ara) ha mostrato una diminuzione nel punto 5.5 kb in confronto e l&#39;aggiunta di un segnale ellittica, che indica un accumulo di DNA a forma di Y nel campione. Il segnale èlocalizzate a una posizione, a significare le forche di replicazione stanno arrestando in un posto simile in tutta la popolazione. In aggiunta anhydrotetracyline, il segnale di DNA a forma di Y non è più visibile. Un riavvio recente è indicato dalla presenza di un segnale dell&#39;intera Y-arco, raffigurante forche migrano attraverso la regione. È importante normalizzare il DNA all&#39;interno di ciascun tappo agarosio per garantire i segnali dei campioni sono ancora. I segnali possono essere quantificati con adeguato software di imaging. Un altro intermedio comune visto è che l&#39;indicazione di giunzione Holliday (HJ) formazione. Un HJ è visualizzato come un segnale di cono nella parte superiore della Y-dell&#39;arco e un picco dal DNA lineare al termine dell&#39;arco Y (Figura 3D). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig2.jpg" /> Figura 2: microscopia a fluorescenza e Viab<html> ility. (A) Un E. coli ceppo trasporta la matrice Teto è stato coltivato a 30 ° C in presenza di 0,1% arabinosio (+ ara) per 1 ora e poi anhydrotetracycline (AT) è stato aggiunto per 10 minuti ad una sottopopolazione di rilasciare il blocco di replica. micrografie Rappresentante sono indicati per la produzione di YFP (pannello superiore). Barra di scala = 2 micron. La percentuale di cellule che portano 1, 2 o più di 2 foci erano indicati e sono presentati come percentuale (pannello inferiore). (B) Le cellule coltivate in assenza di arabinosio (- ara), con arabinosio (+ ARA) e sia con arabinosio e anhydrotetracycline (AT; 10 min) erano di serie diluito 10 volte e sia macchiato o diffondere sul solo agar contenente ampicillina ( - / + campioni ARA) o ampicillina con anhydrotetracycline (+ AT campione) e coltivate a 30 ° C per determinare la vitalità cellulare. Top: piatto rappresentativo che mostra la crescita a diluizioni indicate. In basso: grafico che mostra la media CFU / ml +/- SEM.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig3.jpg" /> . Figura 3: Visualizzazione di replicazione del DNA intermedi in una nucleoproteina blocco (A) DNA genomico da cellule (1, - ara, 2, + ara, 3, + Ara / AT) che sono stati lisati all&#39;interno spine agarosio e digerito con enzima di restrizione EcoRV è stato separato su un gel di agarosio 0,4% (55 V, 16 ore). 3 kb, 5 kb e 10 bande kb sono indicati. Il DNA sopra il marcatore 5 kb è stato asportato come indicato dalle caselle bianche. (B) Schema del EcoRV digest della regione array. forchette replica introdotti nella matrice dall&#39;origine diventano bloccati all&#39;interno del frammento 5.5 kb quando le cellule sono state coltivate in presenza di arabinosio. I siti di restrizione utilizzati sono indicati da frecce e array è mostrato come una scatola con linee. (C) Il DNA asportata è stata ruotata di 90 ° e separato su gel di agarosio allo 0,8% (220 V, 4 ore). La scatola bianca indica l&#39;escissione del DNA dopo la separazione. (D) La regione array è stato seguito evidenziata mediante analisi Southern blot con una sonda radioattiva alla regione matrice. Le cellule con un blocco di replica in questa posizione avrà il segnale corrispondente al frammento 5.5 kb situato sulla Y-arc. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54434/54434fig3large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Indurre un blocco di replica siti specifici in<i&gt; E. coli</i&gt; Utilizzando un sistema fluorescente Repressor Operator

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

inducing-site-specific-replication-blockage-e-coli-using-fluorescent

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

8.9K Views.  University of Newcastle. We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Video: Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

Determinazione dei percorsi cromosomici ottimali per un elemento di DNA in Escherichia coli usando un approccio novello Transposon-mediata

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Ricerca

Genetica

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Bioingegneria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite this similarity, these bacteria show extreme variations in characteristics like growth behavior, intensity of light emission or regulation of bioluminescence. The method presented here is a newly developed assay that combines recording of cell growth and bioluminescent light emission intensity over time utilizing a plate reader. The resulting growth and light emission characteristics can be linked to important features of the respective bacterial strain, such as quorum sensing regulation. The cultivation of a range of bioluminescent bacteria requires a specific medium (e.g., artificial sea water medium) and defined temperatures. The easy to handle, non-bioluminescent standard-research bacterium Escherichia coli (E. coli), on the other hand, can be cultivated inexpensively in high quantities in laboratory scale. Exploiting E. coli by introducing a plasmid containing the whole lux operon can simplify experimental conditions and additionally opens up many possibilities for future applications. The expression of all lux genes utilizing an E. coli expression strain was achieved by construction of an expression plasmid via Gibson cloning and insertion of four fragments containing seven lux genes and three rib genes of the lux-rib operon into a pET28a vector. E. coli based lux gene expression can be induced and controlled via Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG) addition resulting in bioluminescent E. coli cells. The advantages of this system are to avoid quorum sensing regulation restrictions and complex medium compositions along with non-standard growth conditions, such as defined temperatures. This system enables analysis of lux genes and their interplay, by the exclusion of the respective gene from the lux operon, or even addition of novel genes, exchanging the luxAB genes from one bacterial strain by another, or analyzing protein complexes, such as luxCDE.

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent bacteria regulate light production through a variety of mechanisms, such as quorum sensing. This novel method allows the in situ investigation of bioluminescence and the correlation of light emission to cell density. An artificial bioluminescent Escherichia coli system allows the characterization of lux operons, Lux proteins, and their interplay.

In Situ Misurazione e la correlazione di densità delle cellule ed emissione di luce di batteri bioluminescenti

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Biochimica

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Biologia

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Singola molecola di imaging del regolamento Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzo di attivazione Cotranslational da Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

Generazione di marcato e markerless Mutanti nel modello di cianobatteri Specie

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Imaging a cellule vive dell'attività trascrizionale a rotture a doppio filamento di DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

Indurre un blocco di replica siti specifici in

Riepilogo

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