Name: inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system
Uploaded: 2016-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System at JoVE.com

This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].

1. Bloqueio de replicação com FROS <ol><li> Induzindo a replicação de bloqueio <ol><li> Dilui-se uma cultura durante a noite fresca de uma E. coli estirpe transportando uma matriz tetO e pKM1 18 a OD 600nm = 0,01 em um meio complexo diluído (0,1% de triptona, 0,05% de extracto de levedura, 0,1% de NaCl, 0,17 M de KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4), com antibióticos conforme requerido para selecção. Nota: Não adicione tetraciclina para a seleção, uma vez que não é compatível com este sistema. Completar o volume de cultura equivalente a 10 ml por amostra necessário. Por exemplo, o volume de cultura para o desenho experimental na Figura 1 é de 60 ml. </li><li> Crescer a 30 ° C com agitação até DO600 nm = 0,05-0,1. Retirar uma amostra de 10 ml para servir como controlo não induzido e adiciona-se 0,1% de arabinose a restante cultura para induzir a produção de TetR-YFP de pKM1. Continuar a crescer tanto a não induzido e induzidoculturas. Depois de 1 hora, para verificar a presença de um único ponto focal dentro de cada célula da cultura induzida usando microscopia de fluorescência (ver secção 2). </li><li> Se as células induzidas são confirmadas bloqueado (mais de 70% das células têm um único foco), registrar a 600nm OD e tirar uma amostra de 7,5 ml para análise por gel 2-D (ver secção 3). Tome uma amostra equivalente a partir da cultura de controlo não induzido. </li></ol></li><li> Liberando a replicação de bloqueio <ol><li> Para libertar o bloco para a replicação, adiciona-se 100 ng mL -1 de anidrotetraciclina o indutor gratuito (NA) a uma amostra das células bloqueadas 10 ml. Continuar a crescer a 30 ° C durante 10 minutos e recolher amostras de densidade celular (1 ml), A análise por microscopia (10 ul) e geles de agarose a 2-dimensionais neutro-neutras (7,5 mL). </li></ol></li><li> Induzindo Colapso da replissoma <ol><li> Se as células contêm um alelo sensível à temperatura, tais como TS dnaB ou TS dnaC que requer deactivação, mover o frasco contendo as células bloqueadas a 42 ° C. Retirar amostras para análises em pontos de tempo necessário (por exemplo, 1 hora, após incubação). Depois as células foram incubadas a 42 ° C durante 1 h, deslocar as células a 30 ° C durante 10 minutos (ver Figura 1). Nota: As células podem ser deslocada para 30 ° C para análise de reinicialização. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig1.jpg" /> Figura 1:. Overview of the Block and Release Procedimento Experimental FROS replicação E. estirpes de E. coli que transportam a matriz tetO são cultivadas a 30 ° C. Quando as células atingem uma OD 600nm de 0,05 acima, a produção de TetR-YFP é induzida com arabinose (ara; 0,1%). Continuar a crescer uma subpopulação de células não induzidas para actuar como controlos a 30 ° C. Uma amostra das células induzidas é analisada através de microscopia de fluorescência após 1-2 horas (ver 2.1). Se a replicação éconfirmou a ser bloqueado, são tomadas amostras para análise em gel 2-D indicada pelos tubos de ensaio (ver 3.1) e para testes de viabilidade (opcional). O bloqueio de replicação pode ser removido com anidrotetraciclina (AT; 0,1 ug / ml) e analisadas células 10 minutos mais tarde. Se as células portadores de um alelo sensível à temperatura (por exemplo, dnaB ts), isso pode ser inactivado por deslocar as células bloqueadas a 42 ° C para análise apropriada. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2. Microscopia por fluorescência <ol><li> Prepara-se uma almofada de agarose por pipetagem de 500 ul de agarose fundida (1% em água) sobre uma lâmina de microscópio; sobrepor a lamela imediatamente antes das solidifica agarose. Armazenar as lâminas (s) em tecidos molhados, a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Quando a agarose foi solidificada, retirar a lamela do bloco de agarose e pipeta 10 ul de bacterianacultura para o centro do teclado para impedir o movimento de células durante a visualização. Uma vez que a amostra foi seca (aproximadamente 5 minutos), substitua a lamela. Coloque uma gota de óleo de imersão para a lamela e colocar a corrediça sob ótica. </li><li> Visualize as células usando Fase Microscopia de 100x. <ol><li> Na caixa de diálogo Adquirir dentro do software de imagem, definir o tempo de exposição a 100 ms. Capturar a imagem selecionando Adquirir. Não mova o palco. Na caixa de diálogo Adquirir, selecione YFP como a iluminação para o Shutter externa relacionada com a Câmara. Defina o tempo exporsure a 1.000 ms. Desligue a luz palco. Capturar a imagem de fluorescência, selecionando Adquirir. Nota: O tempo pode variar de acordo com fonte de luz, microscópio e câmera utilizada. </li><li> Para sobrepor a fase e imagens fluorescentes, selecione Cor Combine a partir do menu Display. Na caixa de diálogo Cor Combine, selecione a imagem YFP como o componente verde e a imagem de fase como o blue componente. Clique na cor combinar. Determinar se a população tinha replicação bloqueada com sucesso por estabelecer se a maioria das células têm um foco por célula. Nota: comparação com uma amostra de controlo sem a adição de arabinose é útil para identificar visualmente a diferença na produção de EYFP. </li></ol></li></ol> 3. Extração de DNA / agarose Plugs <ol><li> Adicionar azeto de sódio (concentração final de 0,1%) para as amostras de cultura de 7,5 ml a partir de passos 1.1.3 e 1.2.1. Incubar em gelo durante pelo menos 5 min. Nota: A azida de sódio é extremamente tóxico. Consulte a Ficha de Segurança antes de iniciar o trabalho e não lidar com isso até que todas as precauções de segurança tenham sido lidas e compreendidas. </li><li> Centrifugar as células 5000 xg durante 10 min para sedimentar as células. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de tampão Pett IV (PIV) (10 mM de Tris: HCl (pH 8,0), NaCl 1 M). Microcentrífuga (13, 000 xg durante 2 min) para sedimentar as células. diScard o sobrenadante. Neste estágio, o processo os peletes ainda mais ou armazenar a -20 ° C. </li><li> Ressuspender as células com a densidade celular mais baixo em 50 ul de PIV e colocar a 50 ° C. Para todas as outras amostras, ajustar os volumes de PIV assim a densidade celular final é a mesma em cada um dos tubos (por exemplo, amostra 1 (OD 600 nm = 0,128) ressuspenso em 50 ul; Amostra 2 (OD 600 nm = 0,138) ressuspenso em 54 ul). <ol><li> Adicionar um volume igual de solução recém-preparada de agarose a 0,8% em PIV (concentração final de 0,4%;. Por exemplo, uma amostra de 50 ul, 54 ul de amostra 2). Certifique-se de que as amostras, de agarose e PIV são acima de 50 ° C para impedir a solidificação. </li></ol></li><li> Tratar uma lâmina de microscópio com 40 mL de uma solução de vidro repelente de água ou silicone apropriado. Esfregue o slide com um lenço de papel até que esteja seco. Nota: Isto pode ser feito com antecedência e as lâminas tratadas armazenado a longo prazo à temperatura ambiente. </li><li> Coloque 20 gotas ul de tEle suspensão de células / agarose no slide para produzir plugs que são hemisférica. Nota: A primeira amostra (ressuspenso em 50 pi PIV) irá produzir 5 fichas em um slide. </li><li> Quando os tampões de ter solidificado, deslizar com suavidade em um tubo de microcentrífuga e adicionar 1 ml de tampão de lise celular (10 mM de Tris-HCl [pH 8], 1 M de NaCl, 100 ácido etilenodiaminotetracético mM (EDTA), 0,2% de desoxicolato de sódio, 0,5% sal de N-lauroilsarcosina de sódio (sarcosil), 100 ug ml de lisozima - 1, 50 ng mL - 1 de RNase A). Incubar a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Remover o tampão de lise de células e adicionar Sarcosil / proteinase K (ESP) solução de 1 ml de EDTA / (0,5 M de EDTA, sal de sódio a 1% de N-lauroilsarcosina (Sarcosil), 1 mg mL - 1 de proteinase K). Incubar a 50 ° C durante a noite ou até que as fichas são transparentes. Se uma segunda incubação durante a noite se necessário, substituir a solução com tampão de ESP fresco depois de aproximadamente 18 horas. </li><li> Remova oESP tampão e lava-se os tampões de 5 vezes com 12 ml de Tris-EDTA (TE) de tampão (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 8,0), permitindo um equilíbrio de 30 min com cada lavagem. Armazenar a 4 ° C em 1 ml de tampão TE. </li></ol> 4. Neutral neutro 2-Dimensional eletroforese em gel <ol><li> Transferir uma ficha de agarose do passo 3.8 para um tubo de microcentrífuga fresco e adicionar 150 ul de tampão de enzima de restrição (1x concentração). Adicionar 25-100 unidades de enzima de restrição (por exemplo, 60 unidades de EcoRV; (ver Figura 3A)). Digerir a 37 ° C durante 6-8 h. </li><li> A 4 ° C, verter um gel de agarose a 0,4% (300 ml) em 1x Tris / borato / EDTA (TBE) para um tabuleiro de gel de cerca de 25 x 25 cm. Inserir um pente para poços de fazer aproximadamente a mesma largura que o diâmetro do bujão. Quando o gel é fixado, remover o pente e mover o gel até à temperatura ambiente. </li><li> Deslize um dos tampões de agarose digerida em um poço, posicionar a lâmina plana do encaixe de encontro ao lado do poço onde tADN que vai entrar no gel. Inserir um único plug da mesma maneira em cada segundo poço. </li><li> Pipetar 0,4% de agarose fundida nas cavidades para selar as fichas em posição. </li><li> Carga escada de DNA de 1 kb num poço vazio, mais uma vez deixando um intervalo entre a escada e amostras, e executar o gel durante a noite (16 horas, 55 V) em TBE 1x, à temperatura ambiente. </li><li> Corar o gel num banho de água contendo brometo de etídio (0,3 ug mL-1) durante 20 min. Nota: O brometo de etídio é considerado um agente mutagénico potente e uma toxina. Consulte a Ficha de Segurança antes de iniciar o trabalho e não lidar com isso até que todas as precauções de segurança tenham sido lidas e compreendidas. </li><li> Visualizar o DNA com um transiluminador de UV de onda longa e cortar cada pista com um fragmento linear, mesmo cortado, minimizando a inclusão de excesso de agarose em ambos os lados da pista. Nota: Por exemplo, se o fragmento de interesse é de 5,5 kb, cortado um fragmento de 7,5 centímetros para incluir os fragmentos de ADN a partir de 5 kb a approximately 12 kb (ver Figura 3A). </li><li> Coloque a pista de gel excisado num tabuleiro de gel a 90 ° em direcção da migração de DNA. Nota: Duas fileiras de 3 fragmentos de gel pode caber em um tabuleiro de gel 25 x 25 2 cm. A primeira linha de pistas de gel está na parte superior do tabuleiro, a segunda fileira de 12,5 cm. </li><li> Preparar 300 ml de agarose para o segundo gel dimensão (0,9% em 1 x TBE com 0,3? G ml -1 de brometo de etídio). Quando a agarose é arrefecida a 50 ° C, pipetar a agarose fundida em torno das fatias de gel para solidificar a sua posição. Verta a agarose restantes na bandeja a uma profundidade que é pelo menos o nível com as fatias de gel. </li><li> Uma vez que o gel é solidificado, electroforese a 4 ° C em TBE 1x contendo 0,3 ug mL1 brometo de etidio a 220 V até que o ADN tenha migrado cerca de 10 cm. Nota: 4 horas é suficiente para um fragmento de 5,5 kb, mas um fragmento mais pequeno será necessário menos tempo. </li><li> Extirpar os blocos onde o DNA genómico está presente ucantar a borda de uma régua de metal, incluindo o gel acima, para incluir o ADN que não é visível (ver a Figura 3C). </li></ol> 5. Hibridação Southern <ol><li> Preparação de Soluções <ol><li> Preparar tampão despurinação (solução 0,125 M de HCl). Nota: Este tampão pode ser reutilizado e que é estável à temperatura ambiente durante até um mês. </li><li> Preparar tampão de desnaturação (NaCl a 1,5 M, NaOH a 0,5 M). Nota: tampão de desnaturação pode ser reutilizada uma vez e é estável até 3 meses à temperatura ambiente. </li><li> Preparar tampão de neutralização (NaCl 1,5 M, Tris 0,5 M). Ajustar a pH 7,5 com HCl. Nota: tampão de neutralização pode ser reutilizada uma vez e é estável até 3 meses à temperatura ambiente. </li><li> Prepare 10x Solução salina de citrato de sódio (SSC) tampão (citrato 0,15 M Tri-sódio, 1,5 M de NaCl, pH é 7-8), para utilização em passos 5.2.4 e 5.2.6. A partir deste tampão, faça um estoque SSC 2x (para uso no passo 5.2.9). Nota: 10x SSC e 2 x SSC umre estável à temperatura ambiente durante 3 meses. </li><li> Preparar tampão 19 de modificação Church e Gilbert hibridação (tampão fosfato 0,5 M [pH 7,2], 7% (w / v) de sulfato de dodecilo de sódio (SDS), EDTA 10 mM). Deixar a 65 ° C para dissolver completamente antes de usar. </li></ol></li><li> Transferir <ol><li> Lavar os blocos de gel excisados ​​em solução depurinação durante 10 min à temperatura ambiente num agitador rotativo ou agitador orbital. Mantenha a velocidade de agitação baixa para evitar danificar os blocos de agarose. </li><li> Lavar os blocos de gel brevemente com água destilada e depois com tampão de desnaturação durante 30 min. Lavar novamente brevemente em água destilada e, em seguida, incubar os blocos de gel em tampão de neutralização, durante 30 min com agitação suave à temperatura ambiente. </li><li> Cortar uma membrana de nylon para a dimensão exacta do gel (s). Corte um nick no canto superior direito para ajudar a orientar a membrana em etapas futuras. Nota: Dois blocos de gel (6 amostras) pode ser visualizado em uma membrana. </li><li> Pour suficiente 10x SSC em uma de trAy de modo que não vai secar durante a noite. Criar uma plataforma de cerca de 5 cm acima do nível do tampão. Saturar 3 folhas de 3mm de papel para cromatografia com 10x SSC e coloque sobre a plataforma. Cortar o papel de cromatografia de modo que é suficientemente longo para ser imersa em tampão em ambas as extremidades e de largura suficiente para encaixar o gel na membrana. </li><li> Colocar o gel (s) na parte superior do papel cromatográfico saturado. Enquadrar o gel com película de plástico para evitar que o tampão de by-passar o gel durante a transferência. Cuidadosamente colocar a membrana de corte no topo do gel (s). Retirar as bolhas de ar entre a membrana e o gel por laminagem uma garrafa ou pipeta serológica suavemente através da membrana. </li><li> Corte três folhas de papel 3MM cromatograf ia com o mesmo tamanho como a membrana. Saturar as folhas de papel de cromatografia com 10x SSC e colocar na parte superior da membrana. Remova as bolhas de ar que se formaram. </li><li> Pilha toalhas de papel, pelo menos, 5 cm de altura em cima do papel mata-borrão seguido por um suporte sólido (apropeso ximate de 1 kg para uma membrana de 23 x 16 cm). Permitir que a transferência prosseguir durante a noite. </li><li> Expor a membrana (ADN lado para cima) a 1200 J / m2 de UV para reticular o ADN à membrana. Não enxaguar antes desta etapa. </li><li> Lavar a membrana completamente em SSC 2x para evitar elevado ruído de fundo nas imagens blot. Use a mancha imediatamente para hibridação (ver 5.3) ou secá-lo à temperatura ambiente, embrulhe em filme plástico e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> hibridização <ol><li> Pré-aqueça o forno de hibridação e os frascos a 55 ° C. </li><li> Adicionar 100? G ml -1 de albumina de soro bovino (BSA) e 10? G ml -1 de ADN não específico (por exemplo, ADN de esperma de salmão) ao tampão de hibridação pré-aquecida. </li><li> Para permitir uma cobertura uniforme do tampão de hibridação, quando a membrana é enrolado, coloque a mancha sobre um quadrado de tamanho similar de malha de nylon com o lado ligado ao ADN da membrana virada para cima. Role a blot ao longo de sua borda longa. Deslizara mancha / mesh dentro de uma garrafa de hibridização. Adicionar uma quantidade apropriada de tampão de hibridação pré-aquecida para desenrolar o blot (por exemplo 30 ml para uma membrana de 23 x 16 cm2). </li><li> Incubar em um forno pré-aquecido, girando os frascos, durante 1 h. </li><li> Preparar a sonda através da mistura de 50 ng de produto de PCR purificado homóloga à região de interesse, 150 ng de iniciadores de hexâmero aleatório, para tamponar o fragmento de Klenow e H 2 O para fazer um volume de 13 ul. Ferver durante 3 min, em seguida, colocar imediatamente em gelo. Adicionar 1 ml de 1 mM de dCTP / dGTP / dTTP mistura, 1 ul de fragmento de Klenow (5 U) e 50 uCi de desoxiadenosina-trifosfato marcado radioactivamente 5&#39;no fosfato alfa (α 32 P-dATP). </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Adicionar 1 ml de 1 dNTP mM misturar e 1 ml de fragmento de Klenow. Incubar 20 min a RT. </li><li> Ferva sonda para 5 min e adicionar imediatamente para tubos de hibridização. Hibridar durante a noite a 55 ° C, com rotação. </li><li> Decantar o prOBE de membrana. Nota: A sonda é capaz de ser reutilizada uma vez. </li><li> Lavar a membrana rapidamente em pré-aquecido, tampão de lavagem de baixo rigor (2 x SSC, 0,1% (w / v) de SDS). Adicionar tampão fresco de baixo rigor na lavagem e incubar durante 5 min a 55 ° C com rotação. Repetir. </li><li> Lavar duas vezes em tampão de lavagem de rigor médio (1x SSC, 0,1% (w / v) de SDS) durante 10 min a 55 ° C com rotação. </li><li> Lavar duas vezes em tampão de lavagem de severidade elevada (0,1 x SSC, 0,1% (w / v) de SDS) durante 5 min a 55 ° C com rotação. </li><li> Remover a membrana e DAB com tecido para remover o excesso de líquido. Embrulhe em filme plástico assegurando que não há umidade remanescente sobre o filme plástico e coloque na gaveta exposição com uma tela de armazenamento de fósforo pré-inibida. Fechar a cassete e expor durante pelo menos 2 horas antes de visualização usando um gerador de imagens de fósforo. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most common impediment to replisomes in living cells is a nucleoprotein block2. However, two longstanding difficulties in studying the collision of a replisome with a nucleoprotein blockage have been how to localize the event to a known position on the chromosome and how to make the event frequent enough to allow detailed analysis. The majority of the knowledge of how E. coli copes with stalled/collapsed replication forks comes from the use of UV as a DNA damaging agent. 
The FROS protocol described here is a novel way of creating a site-specific nucleoprotein roadblock, similar to what the replisome will meet when it encounters proteins tightly bound to the chromosome during replication. The induced blockage and controlled release of this block allows the stages of DNA processing to be studied in discrete steps. The array of tetO sites used to block replication has previously been utilized to visualize chromosome organization9,10. While the array can be placed anywhere in the chromosome, for the purpose of the array described here, it should be distant from both the origin and the terminus to avoid complications in interpreting the signals observed from second rounds of initiation at the origin or from the replication fork proceeding around the opposite replichore. By optimizing the overproduction of TetR with the use of the dilute complex medium (protocol 1), we have found that sufficient TetR is produced to create a complete replication blockage that is stably maintained, while limiting the number of new rounds of replication that are initiated. The incorporation of replisome temperature sensitive mutations22 into the system ensures all replisomes are deactivated simultaneously and uncontrolled replisome reloading is prevented.
Whilst the number of foci per cell are useful for knowing the cell's replication status, the most enlightening data for DNA repair is from the analysis of the replication intermediates revealed by 2-D gel electrophoresis during an active replication blockage. Analysis of different genetic backgrounds can identify proteins involved in processing and restart of collapsed replication forks by the different patterns observed following the 2-D gel protocol. Further, intermediates from the processing of collapsed replication forks can be present at the array region or in the DNA upstream of the array, and can be visualized using 2-D gel electrophoresis. Creating duplicate agarose plugs (Protocol 3) has the advantage of allowing for digestion of the same sample with different restriction enzymes to be able to visualize replication intermediates in successive DNA regions. Therefore, the array region should be located in a position where appropriate restriction enzymes can be used to probe these regions of interest using Southern hybridization. 
The most common reasons that this technique may be unsuccessful are having either too little DNA which produces faint signals compared to background, or incomplete digestion of the DNA within the plugs. This can be caused by having too much DNA in the agarose plugs or the carry-over of some inhibitor from the lysis/washing steps. The number of cells taken for lysis within the agarose plugs may need to be varied from the protocol described here if modifications such as growth media are changed. However, it is futile to continue with the hybridization if the DNA in the plugs has not digested to completion. A repeat treatment of ESP may be required to better prepare the DNA (protocol 3.6). 
If the replication intermediates that are of interest are only transient, or are particularly rare within the cell, the DNA sample may need to be enriched for them, for example with the use of BND-cellulose which will bind short stretches of single stranded DNA, such as those found in replicating chromosomes23. Stabilization of replication intermediates by crosslinking with psoralen has also been used as a method of preserving DNA integrity24. When the intermediates are rare, it is important to optimize the probe and blocking of the membrane to prevent background signals from interfering. On completion of the blots the signals may be quantified with appropriate image processing software.
The protocol described here is an optimized system for creating a site-specific nucleoprotein blockage and analyzing replication intermediates when the replisome is unable to proceed through the blockage. With the establishment and optimization of this technique, the roles of various helicases and recombination proteins in processing the replication fork and in allowing the restart of replication can be identified. By varying the genetic background, the effect of the absence of these proteins can be analyzed. However, this technique is limited by requiring not only viable strains but strains that are also able to overproduce TetR at a rate that will create a stable nucleoprotein blockage.

Durante a replicação do DNA, o replisome enfrenta obstáculos no DNA que prejudicar a sua progressão. Danos no ADN incluindo lesões e as lacunas assim como estruturas aberrantes pode impedir a replissoma de prosseguir 1. Recentemente, verificou-se que as proteínas ligadas ao ADN são a fonte mais comum de impedimento à replicação progressão forquilha 2. O conhecimento dos eventos após o encontro do replissoma com um bloco de nucleoproteína foi previamente limitada pela incapacidade de induzir uma tal bloco no cromossoma de uma célula viva no local conhecido. Análise in vitro aumentou a nossa compreensão do comportamento cinético de um replissoma activo quando se encontra com uma nucleoproteína bloqueio 3, bem como os detalhes mecanísticos da própria replissoma 4,5. Entendimento atual da reparação de replicação é geralmente realizada com UV como o agente prejudicial e estudada usando DNA plasmídeo in vivo 6-8 </s-se&gt;. Enquanto as proteínas que podem estar envolvidos na reparação do ADN após encontra um bloco de nucleoproteína in vivo são geralmente entendidos a partir destes estudos, se existem variações nos eventos moleculares no interior das vias de reparação devido à causa distinta no bloco de replicação é ainda contudo estar determinado. Aqui, descrevemos um sistema que permite que um bloco de nucleoproteína a ser criada em um local específico do cromossoma utilizando um repressor Sistema Operador Fluorescente (FROS). Nós utilizamos uma cepa de E. coli, que teve uma matriz de 240 locais tetO incorporados no cromossoma 9. Cada local tetO dentro da matriz tem uma sequência aleatória de 10 pb flanqueando-o a aumentar a estabilidade do conjunto, impedindo que a recombinação mediada por RecA-dentro da matriz. Esta matriz, e variações do mesmo, foram originalmente usado para entender E. coli dinâmica cromossómicas 10,11 mas foram depois adaptadas para PreveNT replicação in vivo 12. A matriz foi encontrado para ser mantida de forma estável e para bloquear perto de 100% de garfos de replicação quando ligado por TetR 10,12. A utilização da matriz de lacO semelhante in vitro descobriu tão poucos como 22 locais foram suficientes para bloquear 90% da replicação, embora esta gama mais curto foi menos eficaz in vivo 13. Para se adaptar a matriz para criar um bloqueio nucleoproteína, a proteína repressora deve ser altamente overproduced em condições otimizadas, onde então se liga à matriz para criar um obstáculo. A formação do bloqueio, e a sua subsequente libertação, pode ser controlada através da utilização de microscopia de fluorescência, se uma variante fluorescente etiquetado do repressor Tet é usado. O estado de replicação em cada célula está indicado pelo número de focos visto, em que um único ponto focal significa apenas uma cópia da matriz está presente no interior da célula e múltiplos focos são indicativos de replicação activa. Esta re ativaplicação é activado quando o bloqueio nucleoproteína é revertida pela adição do indutor gratuito que diminui a afinidade de ligação para o local de TetR operador suficientemente para replissoma para prosseguir através da matriz. A proteína repressora é ainda capaz de se ligar ao ADN com uma afinidade suficientemente alta que os agora múltiplas cópias da matriz pode ser visualizado. Detalhes mais intrincados dos eventos no bloqueio nucleoproteína pode ser descoberto usando eletroforese em gel neutro neutro bidimensional agarose e hibridação Southern 14-16. Estas técnicas permitem a análise das estruturas de ADN através da população. Os intermediários de replicação que são formados durante o evento, e potencialmente permanecer não reparado, pode ser visualizada. Através da variação da enzima de restrição e da sonda utilizada, os intermediários podem ser visualizados não só na região da matriz, mas também a montante da matriz, quando o garfo de replicação regride 17,18. oregressão tenham ocorrido depois da dissociação replisome; os fios de condução e de retardamento nascentes separar a partir das cadeias molde e emparelham com uns aos outros como os cordões de modelo simultaneamente re-recozimento que resulta em uma estrutura de ADN de quatro vias (uma junção Holliday). Utilizando este sistema, foi demonstrado que o garfo de replicação não é estável quando se encontra presente 18 bloco. Além disso, os derivados de componentes sensíveis à temperatura réplisome pode ser utilizada para impedir a recarga do garfo de replicação, uma vez que entrou em colapso. Uma vez que um bloco é estabelecida, a tensão pode ser deslocada para uma temperatura não permissiva para assegurar uma desactivação síncrona do replissoma e uma prevenção controlada de recarga. Esta desativação induzida pela temperatura garante todos os garfos dentro da população entraram em colapso em um determinado momento e permite a avaliação do que acontece quando o replisome entra em colapso, como o DNA é processado, eo que é necessário para reiniciar o processo de replicação do ADN. Uma vantagem do sistema descrito aqui é que o bloco de nucleoproteína é totalmente reversível; portanto, a capacidade das células para se recuperar a partir do bloco nucleoproteína é capaz de ser seguido. A adição de anidrotetraciclina para as células irão aliviar a forte ligação do repressor, permitindo um garfo de replicação para prosseguir através da célula e para o restabelecimento da viabilidade. O relevo do bloqueio pode ser visualizada por electroforese em gel de agarose bidimensional neutro neutro depois de 5 min, e por microscopia dentro de 10 min. Além disso, a análise de viabilidade pode revelar a capacidade da estirpe para se recuperar a partir do bloqueio da replicação e continuam a proliferar. Ao alterar o fundo genético das estirpes utilizadas no procedimento experimental descrito aqui, as vias de reparação para este tipo de bloqueio pode ser elucidado.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92144</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>For induction of TetR-YFP production</td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>Release of replication bloackage</td></tr><tr><td>Axioskop 2 Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>452310</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>eYFP filter set</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>Visualization of YFP</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-AG</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>MetaMorph&amp;nbsp; Software (Molecular Devices)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>For agarose plugs and gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Original Glass Water Repellent (Rain-X)</td><td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>For agarose plug manufacture</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td>VWRC103157P</td><td>TE, TBE buffer component</td></tr><tr><td>Ethylene diaminetetraacetic acid</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Bacteriostatic agent</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>TE buffer component</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>Cell lysis and ESP buffer component</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>ESP buffer component</td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 Cell</td><td>BioRad</td><td>1704507</td><td>Electrophoresis system</td></tr><tr><td>UV transilluminator 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>BioRad</td><td>1610433</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>TBE component</td></tr><tr><td>Hybond-XL nylon memrbane</td><td>Amersham</td><td>RPN203S</td><td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used</td></tr><tr><td>3MM Whatman chromatography paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern blotting</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>Crosslinking of DNA and hybridization</td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid from salmon sperm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Denaturation buffer component</td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>Wash buffer component</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Random Hexamer Primers</td><td>Bioline</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>Klenow fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor Screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Visualization of blot</td></tr><tr><td>Hybridization bottle</td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 mm x 300 mm</td></tr></tbody></table>

inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system

Obstáculos presentes no DNA, incluindo proteínas firmemente ligados e várias lesões, pode inibir seriamente a progressão da maquinaria de replicação da célula. O retardamento de um replissoma pode levar a sua dissociação do cromossoma, em parte ou a sua totalidade, levando ao colapso do garfo de replicação. A recuperação a partir deste colapso é uma necessidade para que a célula completa com precisão a duplicação cromossómica e subsequentemente se dividem. diversos mecanismos Portanto, quando ocorre o colapso, a célula tem evoluído que tomam lugar para restabelecer a forquilha de ADN e permitir a replicação para ser preenchido com alta fidelidade. Anteriormente, estas vias de reparação de replicação em bactérias, foram estudados utilizando os danos UV, o que tem a desvantagem de não ser localizada a um local conhecido. Este manuscrito descreve um sistema que utiliza um sistema de fluorescência repressor Operator (FROS) para criar um bloco de proteína específica do local que podem induzir a estagnação e colapso da replicação forks em Escherichia coli. Protocolos detalhe como o estado de replicação podem ser visualizados em células vivas individuais usando microscopia de fluorescência e de replicação de ADN intermediários podem ser analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 2-dimensional. Temperatura mutantes sensíveis de componentes réplisome (por exemplo DnaBts) pode ser incorporada no sistema para induzir um colapso síncrona dos garfos de replicação. Além disso, as funções das proteínas de recombinação e helicases que estão envolvidas nestes processos podem ser estudados utilizando knockouts genéticas dentro deste sistema.

O FROS é um bloco de nucleoproteína induzível, específica do local que permite intermediários de replicação para ser visualizado em células vivas 12,18. Um projeto experimental geral para células de amostragem é ilustrada na Figura 1. O momento da amostragem e variações no fundo genético tornar este um sistema versátil para estudar o reparo de um tal bloco. O esquema ilustra como mutantes sensíveis à temperatura, tais como TS e TS dnaB dnaC que têm sido utilizados previamente 18, pode ser utilizado neste sistema. A indução dos FROS foi levada a cabo num E. estirpe de E. coli tal como mostrado na Figura 1 para as estirpes sensíveis não-temperatura. Para confirmar que um bloco de nucleoproteína tinha sido estabelecido, as células foram visualizadas por microscopia de fluorescência após 1 h de crescimento em 0,1% de arabinose. esteprazo é geralmente adequada para produzir o bloco em uma cepa do tipo selvagem, mas cepas mais exigentes podem requerer otimização. A maioria das células continha um foco (Figura 2A, + ARA), o que corresponde a uma única cópia da matriz no interior da célula, indicando desse modo a replicação tinha sido bloqueado. Os números de células com um foco, 2 focos ou mais do que 2 focos foram contados numa população de mais do que 100 células. 92% das células foram encontrados a ter um foco com os restantes 8% com 2 focos. Presumiu-se que as células que tiveram dois focos bem afastados, o que representa duas cópias do array, teria a próxima rodada de replicação bloqueada. As células com dois focos próximos uns dos outros significam que a matriz recentemente tenha sido replicada e o bloco de nucleoproteína ainda não tenha sido alcançada. O bloco de nucleoproteína foi revertido pela adição de anidrotetraciclina (AT) e duplicação subsequente da matriz visualizado como aacumulação de células com múltiplos focos (Figura 2A, + ara / AT). Múltiplos focos dentro de uma célula visualizadas por microscopia de fluorescência significar a matriz tenha sido replicada com sucesso e tenha passado tempo suficiente para permitir que o loci para se separam, superar qualquer irmã cromossoma coesão que estava presente. Neste exemplo, a 10 minutos após a adição de pelo, 94% de células tinham 2 ou mais focos e até 8 focos por célula foram visualizados. Para assegurar que o bloco de nucleoproteína efectivamente inibir a replicação, a viabilidade celular foi analisado (Figura 2B). As células que tenham tido replicação inibida pelos FROS mostram uma diminuição de aproximadamente 1.000 vezes em unidades formadoras de colónias comparativamente com as células que não foram cultivadas na presença de arabinose. As células que foram subsequentemente cultivadas na presença de anidrotetraciclina mostram reversão dessa inibição do crescimento. Se as células não foram capazes de reparar o DNA após o lançamentonucleoproteína do bloqueio, uma redução na viabilidade resultaria. Para visualizar os intermediários de replicação, as células podem ser lisadas dentro tampões de agarose e a proteína e o ARN removido. O ADN pode então ser digerido com uma enzima de restrição apropriada para a região de interesse. ADN representado na Figura 3A foi digerido com EcoRV que corta o ADN imediatamente antes da matriz, dentro da matriz e depois a matriz para se obter 5,5 kb e 6,7 kb em fragmentos da região de interesse (Figura 3B). Os fragmentos são idealmente ~ 3-7 kb para o protocolo aqui descrito. Fragmentos fora desta gama pode exigir a alteração das concentrações de agarose utilizados e as condições de electroforese para conseguir uma boa separação. O ADN foi submetido a electroforese na primeira dimensão e visualizada (Figura 3A). Se o DNA foi digerido completamente, todas as pistas terão rodar de maneira uniforme e não haveráuma quantidade elevada de baixo peso molecular (menos do que cerca de 3 kb, dependendo da enzima de restrição). ADN presente no poço sugere lise celular incompleta e uma grande quantidade de ADN de elevado peso molecular (acima de 10 kb) implica a digestão incompleta do ADN. O ADN de interesse em cada pista foi excisado. Na Figura 3A, o ADN acima de 5 kb foi incluído. A segunda dimensão subsequente do gel foi submetido a electroforese, resultante de uma diagonal de ADN linear (Figura 3C). O DNA matriz dentro deste gel foi então visualizadas por hibridização de Southern (Figura 3D). No desbloqueado (- amostra ARA), duas manchas pode ser visto, o que corresponde a 5,5 kb e 6,7 kb fragmentos da matriz, como era esperado. A amostra que havia replicação bloqueada (+ ara) mostrou uma diminuição do ponto de 5,5 kb em comparação e a adição de um sinal elíptica, o que indica uma acumulação de ADN em forma de Y na amostra. O sinal élocalizada em uma posição, significando os garfos de replicação estão prendendo em um lugar semelhante em toda a população. Por adição de anhydrotetracyline, o sinal em forma de Y de ADN já não pode ser visto. Um recente reinicialização é indicada pela presença de um sinal de todo o Y-arco, que descreve os garfos que migram através da região. É importante para normalizar o ADN no interior de cada vela de agarose para garantir os sinais das amostras são mesmo. Os sinais podem ser quantificados com software de imagem apropriado. Outro intermediário comum visto é que indicando junção Holliday formação (HJ). Um HJ é visualizado como um sinal de cone no topo do Y de arco e um pico a partir do ADN linear no final do arco Y (Figura 3D). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig2.jpg" /> Figura 2: microscopia de fluorescência e VIAB<html> ility. (A) Um E. coli estirpe transportando a matriz tetO foi cultivada a 30 ° C na presença de 0,1% de arabinose (Ara +) durante 1 hora e, em seguida, anidrotetraciclina (AT) foi adicionado durante 10 min a uma subpopulação para libertar o bloco para a replicação. micrografias representativas estão apresentados para a produção de YFP (painel superior). Barra de escala = 2 uM. A proporção de células que transportam uma, duas ou mais do que 2 focos foram enumerados e são apresentados como uma percentagem (painel inferior). (B) As células cultivadas na ausência de arabinose (- ARA), com arabinose (+ ARA) e com ambos arabinose e anidrotetraciclina (NO; 10 min) foram diluídas em série de 10 vezes e, ou manchado ou espalhada sobre única ampicilina agar contendo ( - / + ara amostras) ou ampicilina com anidrotetraciclina (+ AT amostra) e cultivadas a 30 ° C para determinar a viabilidade celular. Top: placa representativa mostrando crescimento em diluições indicadas. Parte inferior: gráfico que mostra a média CFU / mL +/- SEM.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig3.jpg" /> . Figura 3: A visualização do DNA Replication Intermediates Num bloco Nucleoproteína (A) O ADN genómico a partir de células (1, - ara; 2, + ara; 3, + ara / AT) que foram lisadas dentro tampões de agarose e digerido com a enzima de restrição EcoRV foi separada num gel de agarose 0,4% (55 V, 16 hr). 3 kb, 5 kb e 10 kb bandas são indicados. O ADN acima do marcador de 5 kb foi excisado como indicado pelas caixas brancas. (B) Esquema de EcoRV a digestão da região da matriz. garfos de replicação que entram na matriz a partir da origem ficar bloqueados dentro do fragmento de 5,5 kb quando as células foram cultivadas na presença de arabinose. Os locais de restrição utilizados estão indicados por setas e a ARraio é mostrado como uma caixa com linhas. (C) O ADN excisada foi rodado 90 ° e separados num gel de agarose a 0,8% (220 V, 4 h). A caixa branca indica a excisão do ADN após a separação. (D) A região matriz foi subsequentemente visualizado por análise de transferência de Southern utilizando uma sonda radioactiva a região da matriz. As células com um bloco de replicação nesta posição terá o sinal correspondente ao fragmento de 5,5 kb localizado no Y-arco. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54434/54434fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Induzir um bloqueio de replicação de site específico no<i&gt; E. coli</i&gt; Usando um sistema fluorescente repressor de operador

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

inducing-site-specific-replication-blockage-e-coli-using-fluorescent

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

8.9K visualizações.  University of Newcastle. We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

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Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Genética

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

Testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Engenharia bactérias aderentes pela criação de um único sintético Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Bioengenharia

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite this similarity, these bacteria show extreme variations in characteristics like growth behavior, intensity of light emission or regulation of bioluminescence. The method presented here is a newly developed assay that combines recording of cell growth and bioluminescent light emission intensity over time utilizing a plate reader. The resulting growth and light emission characteristics can be linked to important features of the respective bacterial strain, such as quorum sensing regulation. The cultivation of a range of bioluminescent bacteria requires a specific medium (e.g., artificial sea water medium) and defined temperatures. The easy to handle, non-bioluminescent standard-research bacterium Escherichia coli (E. coli), on the other hand, can be cultivated inexpensively in high quantities in laboratory scale. Exploiting E. coli by introducing a plasmid containing the whole lux operon can simplify experimental conditions and additionally opens up many possibilities for future applications. The expression of all lux genes utilizing an E. coli expression strain was achieved by construction of an expression plasmid via Gibson cloning and insertion of four fragments containing seven lux genes and three rib genes of the lux-rib operon into a pET28a vector. E. coli based lux gene expression can be induced and controlled via Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG) addition resulting in bioluminescent E. coli cells. The advantages of this system are to avoid quorum sensing regulation restrictions and complex medium compositions along with non-standard growth conditions, such as defined temperatures. This system enables analysis of lux genes and their interplay, by the exclusion of the respective gene from the lux operon, or even addition of novel genes, exchanging the luxAB genes from one bacterial strain by another, or analyzing protein complexes, such as luxCDE.

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent bacteria regulate light production through a variety of mechanisms, such as quorum sensing. This novel method allows the in situ investigation of bioluminescence and the correlation of light emission to cell density. An artificial bioluminescent Escherichia coli system allows the characterization of lux operons, Lux proteins, and their interplay.

In Situ Medição e correlação da densidade celular e emissão de luz de bactérias bioluminescentes

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Bioquímica

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Medição contínua do ruído biológico em Escherichia Coli Usando microscopia de lapso de tempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Biologia

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Molécula única imagem da regulação gênica<em&gt; Em vivo</em&gt; Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

Geração de mutantes sem marcadores marcados e no modelo de cianobactérias da espécie

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Imagem de células vivas da atividade transcricional no DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

Induzir um bloqueio de replicação de site específico no

Resumo

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