Il progetto descritto è supportato da premio Numero 5R01AI116895 dal National Institute of Allergy e Malattie infettive. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute of Allergy e Malattie infettive o il National Institutes of Health.

1. Generazione di campioni <ol><li> Calore attivare C. difficile spore a 65 ° C per 30 min e conservare in ghiaccio. Nota: C. spore difficile può essere prodotto e purificato come descritto in precedenza 7,9,10. </li><li> Preparare la soluzione di germinazione a X + 1 ml dove X è il numero di campioni da prelevare durante il dosaggio. Nota: La soluzione di germinazione è specifico per le specie di batteri spore in fase di studio. Per saggiare C. difficile germinazione delle spore, abbiamo utilizzato una soluzione di 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glicina e 10 mM acido taurocolico in acqua deionizzata. </li><li> Prima di iniziare il test, estrarre un campione della soluzione di germinazione 1,0 ml senza spore per servire come bianco per il rilevamento frammento corticale. </li><li> Aggiungere spore ad un OD 600 di ~ 3,0 alla soluzione germinazione e vortex rapidamente. Nota: per i nostri studi di germinazione in B. subtilis, abbiamo utilizzato la stessa OD 600 spore come per C. difficile. Nota: Questa quantità di spore ha funzionato bene per il monitoraggio corteccia rilascio frammento durante C. difficile la germinazione delle spore. La quantità di spore saggio utilizzare deve essere determinato sperimentalmente per ogni batterio o ceppo. </li><li> Rimuovere un campione 1,2 ml subito dopo aver aggiunto le spore e centrifugare a temperatura ambiente per 1 min a 14.000 xg. Questo è il punto di tempo zero. </li><li> Trasferire 1,0 ml del surnatante dal campione centrifugato in una nuova provetta per la successiva analisi di frammenti corteccia. Nota: Dovrebbe DPA devono essere monitorati, rimuovere un campione di 100 microlitri separato per il rilevamento di DPA nella soluzione utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza terbio 9,18,19. </li><li> Congelare il campione raccolto a -80 ° C. </li><li> Ripetere i punti 1.4 e 1.5, a intervalli regolari fino a quando tutti i punti di tempo completati. Nota: A causa dei tempi necessari per la centrifugazione e campionamento, punti di tempo meno esimoun 2 min a parte, non fosse possibile durante la nostra procedura, così i nostri intervalli di campionamento sono stati una volta ogni 2 min per 14 min. </li><li> Come controllo positivo per ridurre rilevamento zucchero e quantificazione, includere le seguenti quantità di N -acetylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 e 5.000. Preparare questi campioni allo stesso tempo come campioni corteccia e correre lungo con i campioni di corteccia in modo che la curva standard è rilevante ai dati generati da germinare spore. </li><li> Dopo che tutti i campioni punto di tempo vengono raccolti, liofilizzare i campioni. Nota: liofilizzato nostri campioni in tubi con tappo a vite 2 ml. </li></ol> 2. Misura Cortex Frammenti <ol><li> Risospendere campioni liofilizzati in 120 ml di 3 N HCl integrato con 1% di fenolo e 0,5% β-mercaptoetanolo. </li><li> Trasferire i campioni risospeso in provette con tappo a vite a 2 ml. Nota: Per la riproducibilità, garantire tutto il campione liofilizzato viene risospeso e trasferito. </li> &lt;li&gt; Incubare i campioni in un bagno d&#39;acqua di ricircolo a 95 ° C per 4 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, posizionare i campioni sul ghiaccio fino a quando non sono cool. </li><li> Neutralizzare i campioni con 120 ml di 3 M NaOH. </li><li> Aggiungere 80 ml di una soluzione satura di sodio bicarbonato e 80 ml di una soluzione di anidride acetica 5% per ciascun campione e vortex. </li><li> Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Trasferire i campioni di nuovo al bagno di acqua C 95 ° per esattamente 3 min. Nota: questo passaggio è il tempo periodi sensibili e più lunghi possono influenzare lo sviluppo del segnale a valle. </li><li> Rimuovere campioni dal bagnomaria e raffreddare su ghiaccio. </li><li> Aggiungere 400 ml di 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O per ogni provetta e vortex. </li><li> Incubare i campioni in un bagno d&#39;acqua di ricircolo a 95 ° C per esattamente 7 min. Nota: questo passaggio è il tempo periodi sensibili e più lunghi possono influenzare lo sviluppo del segnale a valle. </li><li> Rimuoverei campioni e posto in ghiaccio per 5 min. </li></ol> 3. Colore reagente <ol><li> Mentre i campioni sono sul ghiaccio (Passo 2.12), preparare il reagente colorato. Sciogliere 0,320 g di p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; reagente di Ehrlich) in 1,9 ml di acido acetico glaciale. Nota: Il reagente è tempo, temperatura e sensibile alla luce e non dovrebbe essere fatta in anticipo. </li><li> Dopo il DMAB dissolve completamente, aggiungere 100 ml di 10 N HCl e vortice. </li><li> Aggiungere 5 ml di acido acetico glaciale e vortice. </li></ol> 4. reazione colorimetrica <ol><li> Trasferire 100 ml di ogni campione raffreddati corteccia in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 700 ml di soluzione di colore appena preparata per ogni campione. </li><li> trasferire immediatamente i campioni ad un bagno d&#39;acqua C 37 ° e incubare per esattamente 20 minuti. </li><li> Trasferire 200 ml di ogni campione in una piastra a 96 pozzetti chiaro. </li><li> Quantificare i campioni a 585 nm su un piattolettore. I campioni dovrebbero iniziare in un colore giallo e una reazione positiva si sposteranno al viola. Il più corticale presente, il più profondo il colore viola. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dopo stimolazione, spore sottoposti al processo di germinazione perdono le loro caratteristiche di resistenza senza la necessità per la sintesi macromolecolare. Quando la germinazione delle spore viene attivato, il nucleo spore rilascia DPA in cambio di acqua 2. A causa dell&#39;elevato contenuto DPA della spora dormienti, il nucleo spore è sotto forte pressione osmotica ed il peptidoglicano specializzata, corteccia, aiuta a prevenire il nucleo di gonfiore agendo, presumibilmente, come barriera all&#39;espansione 2. Il metodo sopra descritto utilizza il reagente di Ehrlich (una soluzione gialla) per rilevare la presenza di zuccheri riducenti come misurabile ad una tinta viola. Durante corteccia idrolisi NAG e NAM zuccheri sono liberati (a seconda della portata di enzimi idrolizzano, gli zuccheri possono essere liberati come disaccaridi o polisaccaridi). L&#39;idrolisi dei legami glicosidici da HCl (Step 2.1) genera monosaccaridi con estremità libere riducendo 7. dopo neutralizzione dell&#39;acido con una pari quantità di idrossido di sodio (punto 2.5), gli alcoli circondano il NAG e monosaccaridi NAM sono acilati da anidride acetica (punto 2.6) 13. Successivamente, non reagito anidride acetica viene convertito in acido acetico riscaldando il campione (passo 2.8). Come ipotizzato da Morgan e Elson 20, l&#39;aldeide terminale converte spontaneamente alla forma enolica. In condizioni alcaline (passo 2.10), questa forma enolica può reagire con l&#39;acetil adiacente per generare un derivato oxazole che reagisce con il reagente di Ehrlich (Passo 4.3) per generare un colore viola 15,20. Questo metodo sopra descritto produce risultati coerenti e affidabili per la rivelazione di frammenti di corteccia di germinare spore, sia B. subtilis e C. difficile 9,16,17. Il test richiede una particolare attenzione per assicurare la reazione di tempi, temperature e le procedure vengono eseguite con precisione. Senza la giusta attenzioneper i dettagli, è facile per le condizioni di reazione a fallire o non riprodurre tra esperimenti 13. Tuttavia, l&#39;inserimento di un NAG serie contribuisce nell&#39;applicazione del dosaggio tra gli ambienti di laboratorio. Lo standard di controllo positivo NAG incluso in ogni esperimento di controllo per qualsiasi variabilità inter-sperimentale (ad esempio, leggere variazioni nei tempi di reazione e l&#39;efficacia del reagente colore). Le reazioni che utilizzano solo le condizioni di buffer e le reazioni con le spore incapaci di idrolizzare corteccia sia ceduto nessun cambiamento di colore. Il problema più comune con questo metodo è la variabilità inter-sperimentale o completa mancanza di segnale. Per controllare la variabilità, la preparazione di spore devono essere privi di qualsiasi residuo cellula vegetativa. Questo detriti cellulari conterrà frammenti di peptidoglicano (NAG e NAM) e si tradurrà in un segnale alto di sfondo per le spore germinano. Per garantire una preparazione spora puro (&gt; 99,9% spore), fare riferimento alla Literature per i metodi per preparare sospensioni di spore puro nell&#39;organismo da studiare 7,9,21-23. Se il test non sta dando alcun segnale rilevabile, abbiamo osservato che la fase di liofilizzazione può introdurre variabilità. Grazie alla forza con cui viene rilasciato il vuoto, abbiamo osservato che la polvere campione essiccato può essere soffiata fuori della provetta. Per ridurre / impedire che ciò si verifichi, utilizzare un piccolo ago della siringa per colpire i fori nella parte superiore delle provette dei campioni. La piccola area dei fori introdotte riduce la probabilità che il campione liofilizzato (ora in forma di polvere) venga disturbato. Infine, come osservato nei metodi di cui sopra, le varie fasi di incubazione sono molto sensibili tempo. Assicurarsi che tutti i passaggi cronometrati sono monitorati con attenzione. Una considerazione importante per questo dosaggio è che i frammenti corteccia devono essere rilasciati dal spore germinazione per essere rilevata. Se la corteccia viene idrolizzato in grandi frammenti, questi frammenti possono essere troppo grandi per essere released attraverso il cappotto spore. Anche se una considerazione importante per la risoluzione di un esperimento che non cede un segnale, si consiglia di confermare che le condizioni utilizzate per germinare la maggior parte delle spore nella soluzione e le altre opzioni di risoluzione dei problemi elencati di seguito, prima di considerare dimensione del frammento corticale come un potenziale problema in il dosaggio. Non tutti i buffer di germinazione / condizioni sono adatti per questo test. Poiché questo test rileva la presenza di zuccheri riducenti liberati durante il processo di germinazione 13, ogni buffer di germinazione che contiene zuccheri riducenti o qualsiasi germinant che è, a sua volta, uno zucchero riducente (ad esempio, glucosio) si tradurrà in un forte segnale in questo saggio. Se questo è il caso, ad alta pressione cromatografia liquida (HPLC) può essere utilizzato per rilevare la presenza di frammenti corteccia 24-26. Tuttavia, poiché non tutti i laboratori sono dotati di tale strumentazione, il metodo descritto può essere utilizzato da piùlaboratori e offre risultati semplici e facilmente quantificabili. La germinazione da spore batteriche è stato ampiamente studiato in Bacillus e un paio di specie di Clostridium 2,8. Il processo è generalmente conservata, tuttavia esistono differenze. È importante sottolineare che non tutti gli organismi germinano utilizzando meccanismi di germinazione delle spore, come osservato nelle modello di spore-formatori 9,27. Poiché la germinazione sta diventando studiato in organismi più diversi, il test sopra descritto può essere applicato a questi organismi per rilevare frammenti corteccia durante la germinazione delle spore. Applicando questo metodo a questi nuovi organismi studiati, i ricercatori possono determinare il ruolo delle proteine ​​diverse germinazione giocano nella corteccia idrolisi.

Endospore sono metabolicamente forme dormienti di batteri che permettono ai batteri di persistono in ambienti sfavorevoli. In molti batteri sporigeni, formazione di spore è indotta da privazione di nutrienti, ma questo processo può essere controllato da cambiamenti di pH, esposizione ad ossigeno o altre sollecitazioni 1. Mentre nella loro forma spore metabolicamente dormiente, i batteri resistono ai raggi UV, essiccazione, temperature più elevate, e il congelamento 2. La maggior parte delle conoscenze sul processo di sporulazione deriva da studi in organismo modello, Bacillus subtilis. Il processo inizia con sporulazione replicazione del DNA e la formazione di un 3,4 filamento assiale. Un setto asimmetrica quindi divide la cella in due compartimenti di dimensioni disuguale. Il vano più grande, la cellula madre, avvolge il vano più piccolo, il forespore. Sia la cellula madre e forespore coordinare l&#39;espressione genica a maturare le spore e la cellula madre alla fine lisa, rilasciando il Dormant spore nell&#39;ambiente circostante 1. La struttura e la composizione delle spore si conserva in molte specie batteriche. Il nucleo spora ha un contenuto d&#39;acqua inferiore a quella cellula vegetativa ed è ricco di acido dipicolinico (DPA) 1,2. Durante la formazione di spore, DPA viene pompato nel nucleo spore in cambio di acqua. Che circonda il nucleo è una membrana spore interno dove, nella maggior parte dei formare spore dei batteri, i recettori che riconoscono le piccole molecole che stimolano la germinazione (germinants) si trovano 2. Situato appena fuori membrana interna della spora è uno strato di peptidoglicano della parete cellulare. Uno strato peptidoglicano specializzata (corteccia) circonda la peptidoglicano della parete cellulare ed è composto da molti degli stessi componenti come peptidoglicano della parete cellulare [alternati N-acetilglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM)]. Tuttavia, circa il 50% dei residui NAM nella corteccia sono stati convertiti in muramico-δ-lattame 5,6 </sup&gt;. Durante la germinazione delle spore, questi residui muramico-δ-lattamici sono riconosciuti dalle spore corteccia enzimi litici (SCLEs), consentendo in tal modo la corteccia di essere degradata (un processo essenziale per completare la germinazione), ma non la parete cellulare. Intorno corteccia è una membrana esterna e diversi strati di proteine ​​di rivestimento 2. Controllo del processo di germinazione è di fondamentale importanza per la sporulazione. La germinazione è iniziato quando i recettori germinant interagiscono con i loro rispettivi germinants 2. In molti sporulazione, questi germinants sono aminoacidi, zuccheri, nucleotidi, ioni o loro combinazioni 2. C. difficile germinazione è avviata da combinazioni di alcuni acidi biliari, [ad esempio, acido taurocolico (TA)] e amminoacidi (ad esempio, glicina) 7-10. Anche se ci sono differenze tra il C. percorso di germinazione difficile e le vie studiate in altri sporebatteri, come B. subtilis, comune a tutti è il requisito assoluto per degradare la corteccia spore per consentire una cellula vegetativa a crescere dal spore germinato 2,8. Il degrado della corteccia può essere compiuta dal SCLEs CwlJ / SleB (come si trova in B. subtilis) o SLEC (come si trova in molti clostridi). Cortex idrolisi riduce il vincolo sulla parete cellulare e spore. Questo permette di reidratazione pieno centro, un passo necessario per riattivare molte delle proteine ​​necessarie per il metabolismo cellulare 2. Quando spore germinano, i cambiamenti spore dormienti da uno stato di fase luminoso ad uno stato di fase buia e questo processo può essere misurato da un cambiamento di densità ottica (OD) a 600 nm 11. Un rapporto precedente suggerisce che gran parte di questo cambiamento di OD è dovuto al rilascio di DPA dalla spore 12. Durante il nostro recente studio, abbiamo cercato di confrontare i tempi di C. difficile la germinazione delle spore e monitorato ilrilascio di DPA e corteccia frammenti 9. Per questo studio è stato fondamentale per monitorare il rilascio di frammenti di corteccia come hanno cominciato ad essere rilasciato dalla germinazione delle spore. Il saggio colorimetrico qui usato si basava su un metodo per rilevare gli zuccheri con estremità riducenti sviluppato Ghuysen et al. 13. Perché altri hanno descritto i protocolli per la rilevazione di zuccheri riducenti 14 o hanno modificato i protocolli 15, la letteratura su questo argomento può essere fonte di confusione. Qui, noi dettaglio un metodo step-by-step per la determinazione colorimetrica di zuccheri riduttori liberati da germinare C. spore difficile. Anche se questo studio utilizza C. spore difficile, gli zuccheri riducenti liberati durante la germinazione di spore da altri batteri sporigeni sono in grado di essere rilevato con questo protocollo 9,16,17.

<table><tbody><tr><td>2.0 ml screw cap tube</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,250 &amp;#956;l pipet tips</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &amp;#956;ll pipet tips</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-D-glucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Tetraborate tetrahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>Saturated Phenol</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Heated, Circulating Water Bath</td><td>VWR Scientific</td><td>Model 1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 well clear tissue culture plates</td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat Blocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Machine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecting cortex fragments during bacterial spore germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

La tabella 1 mostra i risultati tipici utilizzando standard NAG. I dati vengono utilizzati per generare una curva standard. La tabella 2 mostra i risultati tipici della un saggio di germinazione in tampone germinazione supplementato con 100 mM glicina e 10 mM TA (condizioni di germinazione-promozione) o 100 mM glicina solo (condizioni non germinazione). In assenza di TA, C. spore difficile del non germinano e c&#39;è poco cambiamento nella presenza di frammenti corteccia nella soluzione. Tuttavia, in presenza di entrambi TA e glicina, C. spore germinano difficile del rilascio e frammenti di corteccia nella soluzione. Questo si osserva come l&#39;aumento della OD 585 nel tempo dei campioni reagito. La quantità totale di frammenti di corteccia (nmol) rilasciati nel corso di questo dosaggio è stata calcolata usando una curva standard simile alla Figura 1B. In questo saggio, la maggior parte della corteccia è idrolizzato (o rilasciato) per 15 minuti postesposizione germinant, suggerendo che la maggior parte delle spore sono germinati in questo lasso di tempo (Figura 2; coerente con una precedente pubblicazione 7). Dopo aver sviluppato i campioni nel reagente colorato, la maggior parte dei campioni non possono mostrare il colore viola ad occhio nudo. La Figura 1 mostra un campione rappresentativo generato da N-acetilglucosamina. Molti dei campioni non mostrano un colore viola visibile. Tuttavia, i 250 nmol, 500 nmol e 5.000 nmol campioni appaiono visivamente diverso dal controllo negativo (0 nmol). Quando misurata a OD 585 nm, il segnale generato meglio si adatta una regressione lineare (R 2 = 0,999). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig1.jpg" /> Figura 1: Rilevamento. N-acetilglucosamina campioni (A) N-acetilglucosamina (0 nmol, 12.5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5,000 nmol) sono state liofilizzate e fatti reagire secondo la procedura descritta. (B) I campioni sono stati aggiunti ad una piastra a 96 pozzetti e la quantità di materiale reagito rilevato a 585 nm. Il segnale è stato utilizzato per generare una curva standard. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig2.jpg" /> Figura 2:. Rappresentazione grafica di germinazione Risultati La corteccia nmol calcolato nella tabella 2 è stata tracciata in funzione del tempo. (●) 100 mM glicina + 10 mM TA; (■) 100 mM glicina. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54146/54146fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> NAG Concentrazione (nmol) </td><td> OD 585 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0.047 </td></tr><tr><td> 12.5</td><td> 0,054 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 0,066 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,084 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 0,128 </td></tr><tr><td> 250 </td><td> 0,285 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 0,556 </td></tr><tr><td> 5.000 </td><td> 4.0 </td></tr><tr><td> = vuote </td><td> 0,046 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: NAG standard. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Clostridium difficile germinazione delle spore </td></tr><tr><td></td><td colspan="4"> Germinazione Solution (10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl) </td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> 100 mM glicina + 10 mM TA </td><td colspan="2"> 100 mM glicina </td></tr><tr><td> Tempo (minuti) </td><td> OD 585 </td><td>Calcolato (nmol) </td><td> OD 585 </td><td> Calcolato (nmol) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0,046 </td><td> 0.00 </td><td> 0.047 </td><td> 0.00 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,048 </td><td> 2,54 </td><td> 0,048 </td><td> 1.27 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.05 </td><td> 5.07 </td><td> 0,049 </td><td> 2,54 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 0,055 </td><td> 11.41 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 0,059 </td><td> 16.49 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0.06 </td><td> 17.76 </td><td> 0.051 </td><td> 5.07 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0,061 </td><td> 19.02 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 14 </td><td> 0,063 </td><td> 21.56 </td><td> 0.051 </td><td> 5.07 </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Sample Spore Germinatisui risultati.

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Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Rilevamento Cortex Frammenti Durante la germinazione delle spore batteriche

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Views.  Texas A&M University. Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

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Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Isolamento fisico di Endospore da campioni ambientali da mirata Lisi di cellule vegetative

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

Ricerca

Ambiente

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Immunologia e infezioni

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

Miglioramento dell'enumerazione delle spore di Bacillus subtilis e analisi dell'etichetta nella citometria a flusso

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Biochimica

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Visualizzazione di Germinosomes e la membrana interna in Bacillus subtilis spore

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Bioingegneria

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Valutazione visiva e microscopiche di Streptomyces mutanti inerente allo sviluppo

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci14. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).
The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a "spore discharge assay", which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.
F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain1. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexual crosses and isolation of recombinant progeny are important research tools for the filamentous fungus, Fusarium graminearum, The techniques necessary successfully carry out these processes are presented.

Sviluppo sessuale e scarico in ascospore Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

Biologia

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure makes the spore extremely stable and resistant and has suggested the use of the spore as a platform to display heterologous molecules. So far, a variety of antigens and enzymes have been displayed on spores of Bacillus subtilis and of a few other species, initially by a recombinant approach and, then, by a simple and efficient nonrecombinant method. The nonrecombinant display system is based on the direct adsorption of heterologous molecules on the spore surface, avoiding the construction of recombinant strains and the release of genetically modified bacteria in the environment. Adsorbed molecules are stabilized and protected by the interaction with spores, which limits the rapid degradation of antigens and the loss of enzyme activity at unfavorable conditions. Once utilized, spore-adsorbed enzymes can be collected easily with a minimal reduction of activity and reused for additional reaction rounds. In this paper is shown how to adsorb model molecules to purified spores of B. subtilis, how to evaluate the efficiency of adsorption, and how to collect used spores to recycle them for new reactions.

This protocol focuses on the use of bacterial spores as a &#34;live&#34; nanobiotechnological tool to adsorb heterologous molecules with various biological activities. The methods to measure the efficiency of adsorption are also shown.

Adsorbimento di spora come un sistema di visualizzazione Nonrecombinant per gli enzimi e gli antigeni

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Indagando i dannosi effetti di basso pressione sterilizzazione al Plasma sulla sopravvivenza di Bacillus subtilis spore utilizzando Live Cell microscopia

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

Indagando Teliospore germinazione utilizzando analisi Microrespiration e Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...