Le projet décrit est soutenu par le Prix Numéro 5R01AI116895 de l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses ou de la National Institutes of Health.

1. Échantillons Génération <ol><li> Heat activer C. difficile spores à 65 ° C pendant 30 min et magasin sur la glace. Remarque: C. Les spores difficile peuvent être produits et purifiés comme décrit précédemment 7,9,10. </li><li> Préparer la solution de germination à X + 1 ml où X est le nombre d&#39;échantillons à prélever au cours de l&#39;essai. Remarque: La solution de germination est spécifique aux espèces de bactéries SPORE à l&#39;étude. Pour doser C. difficile la germination des spores, on a utilisé une solution de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glycine 100 mM , et 10 mM d&#39; acide taurocholique dans de l&#39; eau déminéralisée. </li><li> Avant de commencer l&#39;essai, prélever un échantillon de la solution de germination 1,0 ml sans spores pour servir de blanc pour la détection de fragments de cortex. </li><li> Ajouter des spores à une DO 600 de 3,0 ~ à la solution de germination et vortexer rapidement. Remarque: Pour nos études de germination en B. subtilis, nous avons utilisé le même OD 600 spores en tant que de C. difficile. Note: Cette quantité de spores a bien fonctionné pour la surveillance du cortex fragment de presse au cours de C. difficile la germination des spores. La quantité de spores utilisée dans cet essai doit être déterminée expérimentalement pour chaque bactérie ou souche. </li><li> Prélever un échantillon de 1,2 ml immédiatement après l&#39;addition des spores et centrifuger à la température ambiante pendant 1 min à 14 000 x g. Ceci est le point de temps zéro. </li><li> Transférer 1,0 ml du surnageant de l&#39;échantillon centrifugé à un nouveau tube pour analyse subséquente des fragments de cortex. Remarque: Si DPA doivent être surveillés, prélever un échantillon de 100 pi séparé pour la détection de la DPA dans la solution en utilisant un test basé sur la fluorescence de terbium 9,18,19. </li><li> Congeler l&#39;échantillon prélevé à -80 ° C. </li><li> Répétez les étapes 1.4 et 1.5 à intervalles réguliers jusqu&#39;à ce que tous les points de temps terminés. Remarque: En raison du temps nécessaire pour la centrifugation et de l&#39;échantillonnage, des points de temps moins th2 min étaient en dehors pas possible lors de notre procédure, de sorte que nos intervalles d&#39;échantillonnage ont été une fois toutes les 2 min pour 14 min. </li><li> En tant que contrôle positif pour la réduction de la détection du sucre et la quantification, comprennent les montants suivants de N - acétylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 et 5000. Préparer ces échantillons en même temps que des échantillons de cortex et exécuter en même temps que les échantillons de cortex de telle sorte que la courbe d&#39;étalonnage est pertinente pour les données générées par la germination des spores. </li><li> Une fois que tous les échantillons de points de temps sont collectées, lyophiliser les échantillons. Note: Nous lyophilisée nos échantillons dans 2 ml tubes à bouchon à vis. </li></ol> 2. La mesure Cortex Fragments <ol><li> Remettre en suspension les échantillons lyophilisés dans 120 ul de HCl 3N additionné de 1% de phénol et 0,5% de β-mercaptoéthanol. </li><li> Transférer les échantillons remis en suspension à 2 ml tubes à bouchon à vis. Remarque: Pour la reproductibilité, d&#39;assurer toute l&#39;échantillon lyophilisé est remis en suspension et transféré. </li> &lt;li&gt; Incuber les échantillons dans un bain d&#39;eau de remise en circulation à 95 ° C pendant 4 heures. </li><li> Après incubation, placer les échantillons sur la glace jusqu&#39;à ce qu&#39;ils sont cool. </li><li> Neutraliser les échantillons avec 120 pi de NaOH 3 M. </li><li> Ajouter 80 ul d&#39;une solution de bicarbonate de sodium saturée et de 80 ul d&#39;une solution à 5% d&#39;anhydride acétique à chaque échantillon et vortexer. </li><li> Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Transférer les échantillons vers le bain C de l&#39;eau à 95 ° C pendant EXACTEMENT 3 min. Remarque: Cette étape est temps fois plus sensibles et peuvent affecter le développement du signal en aval. </li><li> Retirer les échantillons du bain d&#39;eau et refroidir sur glace. </li><li> Ajouter 400 pi de 6,54% de K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O dans chaque tube et vortexer. </li><li> Incuber les échantillons dans un bain d&#39;eau de remise en circulation à 95 ° C pendant exactement 7 minutes. Remarque: Cette étape est temps fois plus sensibles et peuvent affecter le développement du signal en aval. </li><li> Retirerles échantillons et les placer sur la glace pendant 5 min. </li></ol> 3. Couleur Réactif <ol><li> Alors que les échantillons sont sur la glace (étape 2.12), préparer le réactif coloré. Dissoudre 0,320 g de p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB, le réactif d&#39;Ehrlich) dans 1,9 ml d&#39;acide acétique glacial. Remarque: Le réactif est temps, la température et sensible à la lumière et ne doit pas être fait à l&#39;avance. </li><li> Après la DMAB se dissout complètement, ajouter 100 pi de N HCl et vortex 10. </li><li> Ajouter 5 ml d&#39;acide acétique glacial et vortex. </li></ol> 4. Réaction Colorimétrie <ol><li> Transfert 100 ul de chaque échantillon refroidi cortex dans un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 700 ul de la solution de couleur fraîchement préparé pour chaque échantillon. </li><li> transférer immédiatement les échantillons dans un bain d&#39;eau C 37 ° et incuber pendant EXACTEMENT 20 min. </li><li> Transfert 200 ul de chaque échantillon à une plaque de 96 puits clair. </li><li> Quantifier les échantillons à 585 nm sur une plaquelecteur. Les échantillons doivent commencer à une couleur jaune et une réaction positive se déplacera au violet. Plus cortex présente, plus la couleur pourpre. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Lors de la stimulation, les spores subissant le processus de germination perdent leurs propriétés de résistance, sans la nécessité de la synthèse macromoléculaire. Lorsque la germination des spores est déclenchée, le noyau de spores libère DPA en échange d&#39;eau 2. En raison de la forte teneur en DPA de la spore dormante, le noyau de spores est sous pression osmotique intense et le peptidoglycane spécialisé, cortex, aide à prévenir le noyau de l&#39; enflure en agissant, sans doute, comme un obstacle à l&#39; expansion 2. Le procédé décrit ci-dessus utilise le réactif d&#39;Ehrlich (solution jaune) pour détecter la présence de sucres réducteurs comme un changement mesurable d&#39;une teinte pourpre. Au cours de l&#39;hydrolyse du cortex, NAG et les sucres sont libérés NAM (en fonction de l&#39;étendue des enzymes hydrolysant les sucres peuvent être libérés comme disaccharides ou polysaccharides). L&#39; hydrolyse des liaisons glycosidiques par HCl (étape 2.1) génère oses avec des extrémités libres 7 réductrices. Après Neutraliztion de l&#39;acide avec une quantité égale d&#39;hydroxyde de sodium (étape 2.5), les alcools entourant la NAG et des monosaccharides NAM sont acylés par de l&#39; anhydride acétique (étape 2.6) 13. Par la suite, l&#39;anhydride acétique qui n&#39;a pas réagi est converti en acide acétique, en chauffant l&#39;échantillon (étape 2.8). Comme l&#39; hypothèse par Morgan et Elson 20, l&#39;aldéhyde terminal convertit spontanément à la forme énol. Dans des conditions alcalines (étape 2.10), cette forme énol peut réagir avec l&#39;acétyl adjacent pour générer un dérivé d&#39;oxazole qui réagit avec le réactif d&#39;Ehrlich (étape 4.3) pour générer une couleur pourpre 15,20. Cette méthode décrite ci - dessus donne des résultats cohérents, fiables pour la détection de fragments de cortex de germination des spores, à la fois B. subtilis et C. difficile 9,16,17. Le dosage nécessite une attention particulière pour assurer la réaction fois, les températures et les procédures sont effectuées avec précision. Sans une attention appropriéeau détail, il est facile pour les conditions de réaction à l&#39; échec ou pas reproduire entre les expériences 13. Toutefois, l&#39;inclusion d&#39;un adjuvants classiques NAG dans l&#39;application du dosage entre les environnements de laboratoire. La norme de contrôle positif NAG inclus dans tous les contrôles d&#39;expérimentation pour toute variabilité inter-expérimental (par exemple, de légères variations dans le temps de réaction ou de l&#39; efficacité du réactif de couleur). Les réactions en utilisant uniquement des conditions et des réactions avec des spores incapables d&#39;hydrolyser cortex deux tampons ont donné aucun changement de couleur. Le problème le plus commun avec cette méthode est la variabilité inter-expérimentale ou absence totale de signaux. Pour contrôler la variabilité, les préparations de spores doivent être exempts de tout débris de cellule végétative. Ces débris de cellules contient des fragments peptidoglycane (NAG et NAM) et se traduira par un signal de fond élevé pour les spores germent. Pour assurer une préparation de spores pur (&gt; 99,9% des spores), reportez-vous à la Literature des méthodes pour préparer des suspensions de spores pures dans l&#39;organisme à étudier 7,9,21-23. Si l&#39;essai ne cède pas tout signal détectable, nous avons observé que l&#39;étape de lyophilisation peut introduire une variabilité. En raison de la force avec laquelle le vide est libéré, on a observé que la poudre d&#39;échantillon séché peut être soufflée hors du tube d&#39;échantillon. Pour réduire / éviter ce problème, utilisez une petite aiguille de la seringue pour faire des trous dans les sommets des tubes d&#39;échantillons. La petite zone des trous introduits réduira la probabilité de l&#39;échantillon lyophilisé (maintenant sous forme de poudre) d&#39;être dérangé. Enfin, comme il est indiqué dans les procédés ci-dessus, les différentes étapes d&#39;incubation sont très sensibles au temps. Veiller à ce que toutes les étapes chronométrées sont surveillées attentivement. Une considération importante pour cette analyse est que les fragments de cortex doivent être libérés de la spores de germination pour être détectée. Si le cortex est hydrolyse dans de grands fragments, ces fragments peuvent être trop grandes pour être releelon à travers la couche de spores. Bien que d&#39;une considération importante lors de la résolution d&#39;une expérience qui ne donne pas un signal, nous recommandons de confirmer que les conditions utilisées pour germer la plupart des spores dans la solution et les autres options de dépannage répertoriés ici avant d&#39;envisager la taille des fragments de cortex comme un problème potentiel le dosage. tous les tampons de germination / conditions ne conviennent pas pour ce dosage. Étant donné que cet essai détecte la présence de sucres réducteurs libérés au cours du processus de germination 13, tout tampon de germination contenant des sucres réducteurs ou tout germinant qui est lui - même un sucre réducteur (par exemple, le glucose) se traduira par un signal fort dans cet essai. Si tel est le cas, la chromatographie liquide haute pression (HPLC) peut être utilisée pour détecter la présence de fragments de cortex 24-26. Cependant, parce que tous les laboratoires sont équipés de tels instruments, le procédé décrit ici peut être utilisé par la plupartlaboratoires et offre des résultats simples et facilement quantifiables. Germination par des spores bactériennes a été largement étudié dans Bacillus et quelques espèces de Clostridium 2,8. Le procédé est généralement conservée, mais des différences existent. Surtout, tous les organismes germent en utilisant des mécanismes de germination des spores comme observé dans les modèles sporulés 9,27. Parce que la germination est de plus en plus étudié divers organismes, le dosage décrit ci-dessus peut être appliquée à ces organismes pour détecter des fragments de cortex pendant la germination des spores. En appliquant cette méthode à ces nouveaux organismes étudiés, les chercheurs peuvent déterminer le rôle des protéines différentes de germination jouent dans l&#39;hydrolyse du cortex.

Endospores sont métaboliquement formes dormantes de bactéries qui permettent aux bactéries de persister dans des environnements défavorables. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, la formation de spores est induite par une carence en nutriments , mais ce processus peut être contrôlé par des changements à pH, l&#39; exposition à l&#39; oxygène ou d&#39; autres contraintes 1. Alors que dans leur forme de spores métaboliquement dormance, les bactéries résistent rayonnement UV, la dessiccation, des températures plus élevées, et le gel 2. La plupart des connaissances sur le processus de sporulation provient d&#39;études dans l&#39;organisme modèle, Bacillus subtilis. Le processus de sporulation commence avec la réplication de l&#39; ADN et la formation d&#39;un filament de 3,4 axiale. Un septum asymétrique divise ensuite la cellule en deux compartiments de taille inégale. Le grand compartiment, la cellule mère, engloutit plus petit compartiment, préspore. Tant la cellule mère et préspore coordonner l&#39;expression des gènes à mûrir la spore et la cellule mère lyses finalement, libérant le dormant spores dans le milieu environnant 1. La structure des spores et la composition est conservée dans de nombreuses espèces bactériennes. Le noyau de spores a une teneur en eau inférieure à la cellule végétative et est riche en acide dipicolinique (DPA) 1,2. Au cours de la formation de spores, le DPA est pompée dans le noyau de spores en échange de l&#39;eau. Entourant le noyau est une membrane de spores intérieure où, dans la plupart des bactéries sporulantes, les récepteurs qui reconnaissent les petites molécules qui stimulent la germination germinants (2) sont situés. Situé juste en dehors de la membrane interne de la spore est une couche de peptidoglycane de la paroi cellulaire. Une couche de peptidoglycane spécialisée (cortex) entoure le peptidoglycane de la paroi cellulaire et se compose d&#39;un grand nombre des mêmes composants que le peptidoglycane de la paroi cellulaire [alternance N-acétylglucosamine (NAG) et de l&#39;acide N-acétylmuramique (NAM)]. Toutefois, environ 50% des résidus non alignés dans le cortex ont été convertis en muramique-δ-lactame 5,6 </sup&gt;. Au cours de la germination des spores, ces résidus muramique-δ-lactame sont reconnus par les spores cortex enzymes lytiques (les SCLEs), permettant ainsi le cortex à dégrader (un processus essentiel pour achever la germination), mais pas de la paroi cellulaire. Autour du cortex est une membrane externe et plusieurs couches de protéines d&#39;enveloppe 2. Contrôle du processus de germination est d&#39;une importance cruciale pour les bactéries formant des spores. Germination est déclenchée lorsque les récepteurs de germination interagissent avec leurs germinants respectifs 2. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, ces plantules sont des acides aminés, des sucres, des nucléotides, des ions ou des combinaisons de ces deux. C. difficile la germination des spores est initiée par des combinaisons de certains acides biliaires, [par exemple, l&#39; acide taurocholique (TA)] et des acides aminés (par exemple la glycine) , 7-10. Bien qu&#39;il existe des différences entre le C. voie de germination difficile et les voies étudiées dans d&#39; autres sporuléedes bactéries telles que B. subtilis, commun à tous est l&#39;exigence absolue de dégrader le cortex de spores pour permettre à une cellule végétative de croître à partir de la spore germée 2,8. La dégradation de Cortex peut être accompli par le SCLEs CWLj / SLEB (que l&#39;on trouve dans B. subtilis) ou SLEC (que l&#39;on trouve dans de nombreux Clostridia). Cortex hydrolyse réduit la contrainte sur la paroi cellulaire et de la spore. Cela permet noyau pleine réhydratation, une étape nécessaire dans réactivant la plupart des protéines nécessaires pour le métabolisme cellulaire 2. Lorsque les spores germent, les spores dormantes passe d&#39;un état de phase lumineuse à un état de phase sombre et ce processus peut être mesurée par un changement de densité optique (DO) à 600 11 nm. Un précédent rapport suggère qu&#39;une grande partie de ce changement de OD est due à la libération de DPA de la spore 12. Au cours de notre étude récente, nous avons cherché à comparer le moment de C. difficile la germination des spores et la surveillancelibération de DPA et cortex fragments 9. Pour cette étude, il était essentiel de surveiller la libération de fragments de cortex comme ils ont commencé à être libéré par la germination des spores. Le dosage colorimétrique utilisé ici a été basé sur une méthode de détection des sucres avec des extrémités réductrices développé Ghuysen et al. 13. Parce que d&#39; autres ont décrit des protocoles pour la détection des sucres réducteurs 14 ou ont modifié les protocoles 15, la littérature sur ce sujet peut être déroutant. Ici, nous détaillons une méthode étape par étape pour la détection colorimétrique de sucres réducteurs libérés de germant C. Les spores difficile. Bien que cette étude utilise C. Les spores difficile, les sucres réducteurs libérés au cours de la germination des spores provenant d&#39; autres bactéries formant des spores puissent être détectées avec ce protocole 9,16,17.

<table><tbody><tr><td>2.0 ml screw cap tube</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,250 &amp;#956;l pipet tips</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &amp;#956;ll pipet tips</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-D-glucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Tetraborate tetrahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>Saturated Phenol</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Heated, Circulating Water Bath</td><td>VWR Scientific</td><td>Model 1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 well clear tissue culture plates</td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat Blocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Machine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecting cortex fragments during bacterial spore germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Le tableau 1 présente des résultats typiques en utilisant des normes NAG. Les données sont utilisées pour générer une courbe standard. Le tableau 2 montre des résultats typiques d&#39;un essai de germination dans un tampon de germination supplémenté avec de la glycine 100 mM et TA 10 (conditions de germination favorisant) ou mM de glycine 100 uniquement (conditions de non-germination). En l&#39;absence de TA, C. spores Difficile ne germent et il y a peu de changement dans la présence de fragments de cortex dans la solution. Cependant, en présence des deux TA et de la glycine, C. Les spores germent et Difficile libérer des fragments de cortex dans la solution. Ceci est observé comme une augmentation de la densité optique 585 au cours du temps des échantillons ayant réagi. La quantité totale de fragments de cortex (de nmol) libérés au cours de cet essai a été calculée en utilisant une courbe standard semblable à la figure 1B. Dans cet essai, la plupart du cortex est hydrolyse (ou libérés) par 15 minutes post-exposition germinant, ce qui suggère que la plupart des spores ont germé dans ce laps de temps (figure 2; compatible avec une publication antérieure 7). Après avoir développé les échantillons dans le réactif de couleur, la plupart des échantillons ne peuvent pas montrer la couleur pourpre à l&#39;œil nu. La figure 1 montre un échantillon représentatif généré à partir de N-acétyl-glucosamine. La plupart des échantillons ne montrent pas une couleur pourpre visible. Cependant, les 250 nmol, 500 nmol et 5.000 nmol échantillons apparaissent visuellement différent du contrôle négatif (0 nmol). Lorsqu&#39;elle est mesurée à une DO de 585 nm, le signal généré correspond le mieux à une régression linéaire (R2 = 0,999). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig1.jpg" /> Figure 1: Détection. N-acétylglucosamine échantillons (A) N-acétylglucosamine (0 nmol, 12,5 nmol,25 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5000 nmol) ont été lyophilisées et on fait réagir selon le mode opératoire décrit. (B) Des échantillons ont été introduits dans une plaque à 96 puits et la quantité de matériau ayant réagi détectée à 585 nm. Le signal a été utilisé pour générer une courbe standard. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig2.jpg" /> Figure 2:. Représentation graphique des résultats Germination Le cortex nmol calculé dans le tableau 2 a été tracée en fonction du temps. (●) mM glycine + 10 mM TA 100; (■) glycine 100 mM. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54146/54146fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> NAG Concentration (nmol) </td><td> OD 585 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0,047 </td></tr><tr><td> 12.5</td><td> 0,054 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 0,066 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,084 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 0,128 </td></tr><tr><td> 250 </td><td> 0,285 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 0,556 </td></tr><tr><td> 5000 </td><td> 4.0 </td></tr><tr><td> = blank </td><td> 0,046 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: NAG standard. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Clostridium difficile Spore Germination </td></tr><tr><td></td><td colspan="4"> Solution de germination (10 mM de Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM) </td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> 100 mM Glycine + 10 mM TA </td><td colspan="2"> 100 mM Glycine </td></tr><tr><td> Temps (minutes) </td><td> OD 585 </td><td>Calculé (nmol) </td><td> OD 585 </td><td> Calculé (nmol) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0,046 </td><td> 0.00 </td><td> 0,047 </td><td> 0.00 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,048 </td><td> 2,54 </td><td> 0,048 </td><td> 1,27 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0,05 </td><td> 5.07 </td><td> 0,049 </td><td> 2,54 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 0,055 </td><td> 11.41 </td><td> 0,05 </td><td> 3,80 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 0,059 </td><td> 16,49 </td><td> 0,05 </td><td> 3,80 </td></tr><tr><td> dix </td><td> 0,06 </td><td> 17.76 </td><td> 0,051 </td><td> 5.07 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0,061 </td><td> 19.02 </td><td> 0,05 </td><td> 3,80 </td></tr><tr><td> 14 </td><td> 0,063 </td><td> 21.56 </td><td> 0,051 </td><td> 5.07 </td></tr></tbody></table> Tableau 2: Exemple de Spore Germinatisur les résultats.

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Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K vues.  Texas A&M University. Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Vidéo: Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Isolement physique des Endospores partir d&#39;échantillons environnementaux par ciblé lyse des cellules végétatives

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

Recherche

Environnement

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Détection des bactéries à l&#39;aide ADNzymes fluorogènes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Immunologie et infection

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

Amélioration du dénombrement des spores de Bacillus subtilis et de l’analyse des marquages en cytométrie en flux

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Biochimie

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Visualisation de Germinosomes et de la Membrane interne dans les Spores de Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Bio-ingénierie

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Évaluation visuelle et microscopique de Streptomyces Mutants du développement

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci14. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).
The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a "spore discharge assay", which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.
F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain1. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexual crosses and isolation of recombinant progeny are important research tools for the filamentous fungus, Fusarium graminearum, The techniques necessary successfully carry out these processes are presented.

Développement sexuel et la libération des ascospores dans Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

Biologie

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure makes the spore extremely stable and resistant and has suggested the use of the spore as a platform to display heterologous molecules. So far, a variety of antigens and enzymes have been displayed on spores of Bacillus subtilis and of a few other species, initially by a recombinant approach and, then, by a simple and efficient nonrecombinant method. The nonrecombinant display system is based on the direct adsorption of heterologous molecules on the spore surface, avoiding the construction of recombinant strains and the release of genetically modified bacteria in the environment. Adsorbed molecules are stabilized and protected by the interaction with spores, which limits the rapid degradation of antigens and the loss of enzyme activity at unfavorable conditions. Once utilized, spore-adsorbed enzymes can be collected easily with a minimal reduction of activity and reused for additional reaction rounds. In this paper is shown how to adsorb model molecules to purified spores of B. subtilis, how to evaluate the efficiency of adsorption, and how to collect used spores to recycle them for new reactions.

This protocol focuses on the use of bacterial spores as a &#34;live&#34; nanobiotechnological tool to adsorb heterologous molecules with various biological activities. The methods to measure the efficiency of adsorption are also shown.

Adsorption de spores comme un système d’affichage recombinants pour les Enzymes et les antigènes

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Enquête sur les néfastes effets de basse pression Plasma stérilisation sur la survie de Bacillus subtilis Spores en utilisant Live microscopie des cellules

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

Germination des téliospores chargée de l’enquête à l’aide de l’analyse Microrespiration et Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

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Détection des bactéries à l'aide ADNzymes fluorogènes