Name: detecting cortex fragments during bacterial spore germination
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination at JoVE.com

הפרויקט המתואר נתמך על ידי מספר הפרס 5R01AI116895 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות או מכוני בריאות הלאומיים.

1. דוגמאות יצירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים להפעיל ג difficile נבגים על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחסן על הקרח. הערה: ג נבגי difficile ניתן לייצר וטהר כפי שתוארו לעיל 7,9,10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון הנביטה ב X + 1 מ&quot;ל כאשר X הוא מספר דגימות להילקח במהלך assay. הערה: פתרון הנביטה הוא ספציפית המינים של חיידקי Spore נלמדים. עבור assaying ג הנביטה נבג difficile, השתמשנו פתרון של 10 מ&quot;מ טריס (pH 7.5), 150 מ&quot;מ NaCl, 100 גליצין מ&quot;מ ו -10 מ&quot;מ חומצה taurocholic במים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת assay, לצייר מדגם 1.0 מיליליטר של פתרון הנביטה ללא נבגים לשמש ריק לגילוי שבר בקליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נבגים ל OD 600 של ~ 3.0 לפתרון נביטת המערבולת במהירות. הערה: מחקרי הנביטה שלנו ב subtilis, השתמשנו באותן OD 600 נבגים ובאשר ג difficile. הערה: סכום זה של נבגים עבד טוב לשחרור שבר בקליפת ניטור במהלך C. נביטת נבג difficile. כמות הנבגים המשמשת assay זה צריכה להיקבע באופן ניסיוני עבור כל חיידק או זן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדגם 1.2 מ&quot;ל מיד לאחר הוספת הנבגים צנטריפוגות בטמפרטורת החדר למשך דקות 1 ב 14,000 × גרם. זוהי נקודת אפס הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1.0 מיליליטר של supernatant מן המדגם centrifuged לצינור טרי לניתוח שבר בקליפה שלאחר מכן. הערה: האם DPA צריך להיות פיקוח, להסיר מדגם נפרד 100 μl לצורך זיהוי של DPA בתמיסה באמצעות assay המבוסס על הקרינה terbium 9,18,19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את המדגם נאספו ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.4 ו -1.5 במרווחים קבועים עד בכל נקודות הזמן הושלמו. הערה: בגלל הזמן הדרוש צנטריפוגה ודגימה, מועדים לפי שעון ה פחות2 דקות זה מזה לא היו אפשריות במהלך ההליך שלנו, כך מרווחי הדגימה שלנו היו פעם כל 2 דקות במשך 14 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת חיובית להפחתת סוכר איתור וכימות, כוללים את הסכומים הבאים של N -acetylglucosamine (nmol): 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500, ו -5,000. הכן דגימות אלה בעת ובעונה אחת כמו דגימות קליפה ולהפעיל יחד עם דגימות הקליפה כך עקום הסטנדרט רלוונטי הנתונים שעלו נבט נבגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל דגימות נקודת הזמן נאספים, Lyophilize הדגימות. הערה: אנו lyophilized דגימות שלנו צינורות 2 מ&quot;ל בורג מכסה. </li></ol> 2. מדידת Cortex שברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend דגימות lyophilized ב 120 μl של 3 N HCl השלימו עם פנול 1% ו -0.5% β-mercaptoethanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות resuspended לצינורות בורג מכסה 2 מ&quot;ל. הערה: שחזור, להבטיח שכל המדגם lyophilized הוא resuspended והועבר. </li> &lt;li&gt; דגירת הדגימות באמבט מים הסירקולציה המחודשת על 95 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, מניח את הדגימות על קרח עד שהם מגניבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את הדגימות עם 120 μl של 3 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 μl של פתרון סודיום ביקרבונט רווי 80 μl של פתרון אנהידריד אצטית 5% לטעום כל מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הדגימות חזרה באמבט מי C ° 95 בדיוק 3 דקות. הערה: שלב זה הוא זמן פעמים רגישות יותר יכולות להשפיע על התפתחות אות במורד זרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגימות מן האמבטיה במים מגניב על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 μl של 6.54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O כדי צינור כל מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות באמבט מים הסירקולציה המחודשת ב 95 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות בדיוק. הערה: שלב זה הוא זמן פעמים רגישות יותר יכולות להשפיע על התפתחות אות במורד זרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהַסִירהדגימות ומניחות על קרח למשך 5 דקות. </li></ol> 3. צבע מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד דגימות הן על קרח (שלב 2.12), להכין את מגיב הצבע. ממיסים 0.320 גרם של p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; מגיב של ארליך) ב 1.9 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחונית. הערה: מגיב זמן, טמפרטורה רגישה לאור ולא צריך להיעשות מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר DMAB מתמוסס לחלוטין, להוסיף 100 μl של 10 N HCl ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחונית מערבולת. </li></ol> 4. תגובת מדד-צבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של כל מקורר מדגם קליפת לצינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 μl של פתרון צבע טרי מוכן מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את דגימות באמבט מים 37 ° C ו דגירה של בדיוק 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 200 μl של כל דגימה לצלחת 96-גם ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הדגימות ב 585 ננומטר על צלחתקוֹרֵא. דוגמאות צריכות להתחיל בכל צבע צהוב תגובה חיובית תעבור לסגול. ככל נוכחי הקליפה, הצבע הסגול העמוקה. </li></ol>

<ol>
	<li>Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clostridium+sporulation+programs:+diversity+and+preservation+of+endospore+differentiation.">The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).</li><li>Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+formation+in+Bacillus+subtilis.">Spore formation in Bacillus subtilis.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).</li><li>Fimlaid, K. A., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+mechanisms+regulate+sporulation+sigma+factor+activity+in+the+Firmicutes.">Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes.</a> Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).</li><li>Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+peptidoglycan+structure+of+Bacillus+subtilis+endospores.">Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores.</a> J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).</li><li>Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+168+endospore+peptidoglycan+and+its+role+during+differentiation.">Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation.</a> J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).</li><li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+and+glycine+as+cogerminants+for+Clostridium+difficile+spores.">Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores.</a> J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).</li><li>Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+spore+biology:+sporulation,+germination,+and+spore+structural+proteins.">Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins.</a> Trends Microbiol. 22 (7), (2014).</li><li>Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+cortex+hydrolysis+precedes+DPA+release+during+Clostridium+difficile+spore+germination.">Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination.</a> J Bacteriol. 197 (14), (2015).</li><li>Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+recognition+by+the+Clostridium+difficile+Germinant+Receptor,+CspC,+is+important+for+establishing+infection.">Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection.</a> PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).</li><li>Moir, A., Smith, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+bacterial+spore+germination.">The Genetics of bacterial spore germination.</a> Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).</li><li>Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Raman+tweezers+and+quantitative+differential+interference+contrast+microscopy+for+measurement+of+dynamics+and+heterogeneity+during+the+germination+of+individual+bacterial+spores.">Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores.</a> Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).</li><li>Ghuysen, J. -. M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymes+that+degrade+bacterial+cell+walls.">Enzymes that degrade bacterial cell walls.</a> Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).</li><li>Park, J. T., Johnson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+submicrodetermination+of+glucose.">A submicrodetermination of glucose.</a> J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).</li><li>Thompson, J. S., Shockman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modification+of+the+Park+and+Johnson+reducing+sugar+determination+suitable+for+the+assay+of+insoluble+materials:+its+application+to+bacterial+cell+walls.">A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls.</a> Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).</li><li>Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SleC+is+essential+for+cortex+peptidoglycan+hydrolysis+during+germination+of+spores+of+the+pathogenic+bacterium+Clostridium+perfringens.">SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens.</a> J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).</li><li>Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+cortex-lytic+enzyme+SleC+from+non-food-borne+Clostridium+perfringens+on+the+germination+properties+of+SleC-lacking+spores+of+a+food+poisoning+isolate.">Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate.</a> Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).</li><li>Hindle, A. A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipicolinic+acid+(DPA)+assay+revisited+and+appraised+for+spore+detection.">Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection.</a> The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).</li><li>Kort, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+heat+resistance+of+bacterial+spores+from+food+product+isolates+by+fluorescence+monitoring+of+dipicolinic+acid+release.">Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).</li><li>Elson, L. A., Morgan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+method+for+the+determination+of+glucosamine+and+chondrosamine.">A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine.</a> The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).</li><li>Ramirez, N., Abel-Santos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+germination+of+Clostridium+sordellii+spores+in+vitro.">Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro.</a> J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).</li><li>Akoachere, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indentification+of+an+in+vivo+inhibitor+of+Bacillus+anthracis+spore+germination.">Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination.</a> J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).</li><li>Duncan, C. L., Strong, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+medium+for+sporulation+of+Clostridium+perfringens.">Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens.</a> Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).</li><li>Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+four+cortex+lytic+enzymes+to+germination+of+Bacillus+anthracis+spores.">Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores.</a> J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).</li><li>Meador-Parton, J., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+spore+peptidoglycan+during+sporulation.">Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation.</a> J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).</li><li>Lambert, E. A., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+anthracis+SleL+(YaaH)+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization.">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li><li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

על הגירוי, נבגים עוברים תהליך הנביטה לאבד התכונות העמידות שלהם ללא צורך סינתזת macromolecular. כאשר נביטת נבג מופעלת, ליבת הנבג משחררת DPA תמורת מים 2. בשל תכולת DPA הגבוהה של הנבג הרדום, ליבת הנבג היא בלחץ האוסמוטי אינטנסיבי ואת פפטידוגליקן המיוחד, קליפה, עוזר למנוע את הליבה של נפיחות המבצע במשחק, ככל הנראה, כמחסום רחב 2. השיטה המתוארת לעיל משתמשת מגיבה של ארליך (פתרון צהוב) כדי לזהות את נוכחותו של הפחתת סוכרים כמו שינוי מדיד כדי גוון סגול. במהלך הידרוליזה קליפה, סוכרים לנדנד NAM משוחררים (תלוי במידה של אנזימים hydrolyzing, סוכרים יכול להיות משוחרר כמו disaccharides או סוכרים). הידרוליזה של קשרים glycosidic ידי HCl (שלב 2.1) יוצרת מונוסכרידים עם קצוות צמצום חינם 7. לאחר neutralizing החומצה עם כמות שווה של נתרן הידרוקסידי (שלב 2.5), את כהלים סביב ולנדנד מונוסכרידים NAM הם acylated ידי אנהידריד אצטית (שלב 2.6) 13. בהמשך לכך, אנהידריד אצטית unreacted מומר חומצה אצטית על ידי חימום המדגם (שלב 2.8). כמו שיערו של מורגן אלסון 20, אלדהיד מסוף ממירה באופן ספונטני בצורה אנול. תחת תנאי בסיסי (שלב 2.10), טופס אנול זה יכול להגיב עם אצטיל סמוך ליצור נגזר oxazole אשר מגיב עם ריאגנט של ארליך (שלב 4.3) כדי ליצור צבע סגול 15,20. שיטה זו שתוארה לעיל מניב תוצאות עקביות אמינות לצורך זיהוי של שברי קליפה מן נובטי נבגים, הן ב subtilis ו- C. difficile 9,16,17. את assay דורש תשומת לב מיוחדת על מנת להבטיח את התגובה פעמים, טמפרטורות הליכים מתבצעות בדייקנות. ללא תשומת לב ראויהלפרטים, קל עבור תנאי התגובה להיכשל או לא לשחזר בין ניסויי 13. עם זאת, הכללת עזרי תקן נאג ביישום של assay בין סביבות מעבדה. התקן הבקרה החיובי נאג כלול בכל שולטת ניסוי עבור כל השתנות בין ניסוי (למשל, שינויים קלים זמן תגובה או יעילות של מגיב הצבע). תגובות באמצעות תנאי חיץ רק ותגובות עם נבגים מסוגלים hydrolyzing קליפה הן הניבו שום שינוי הצבע. הבעיה הנפוצה ביותר בשיטה זו היא השתנות בין-ניסיוני או חוסר מוחלט של אות. כדי לשלוט על ההשתנות, הכנות הנבג חייבות להיות נקיות מכל פסולת תא וגטטיבי. פסולת התא הזה תכיל שברי פפטידוגליקן (ולנדנד NAM) תגרום אות רקע גבוהה עבור הנבגים הנובטים. כדי להבטיח הכנת נבג טהורה (&gt; 99.9 נבגי%), עיין literatuמחדש עבור שיטות להכין השעיות נבג טהורות באורגניזם להיחקר 7,9,21-23. אם assay אינו מניב כל אות לזיהוי, צפינו כי הצעד lyophilizing יכול להציג השתנות. בשל הכח שבו הוואקום משתחרר, צפינו כי אבקת המדגם היבשה ניתן פוצצה מתוך הצינור המדגם. כדי להפחית / למנוע זאת התרחשות, השתמש מחט מזרק קטנה חורי הצמרות דוגמיות. האזור הקטן של החורים הציגו יפחית את הסבירות של מדגם lyophilized (כיום בצורת אבקה) מלהיות מוטרד. לבסוף, כפי שמצוין השיטות הנ&quot;ל, השלבים הדגירה כמה הם מאוד בתקופה רגישה. ודא שכל השלבים מתוזמן מנוטרים בקפידה. שיקול חשוב עבור assay זה הוא כי שברי הקליפה חייבים להשתחרר הנבג הנובט כדי להתגלות. אם הקליפה היא הידרוליזה לרסיסים גדולים, שברים אלה עשויים להיות גדולים מכדי להיות released דרך מעטפת הנבג. למרות שיקול חשוב בעת פתרון ניסוי שאינו להניב אות, אנו ממליצים לאשר כי התנאים בשימוש לנבוט ביותר של נבגי הפתרון ואת האפשרויות נוספות לפתרון בעיות האחרות המפורטות כאן לפני בהתחשב בגודל שבר בקליפה כמו בעיה פוטנציאלית assay. לא כל מאגרי הנביטה / תנאים מתאימים assay זה. בגלל זה assay מזהה הנוכחות של הפחתת סוכרים שוחררו במהלך תהליך הנביטה 13, כל חיץ נביטה המכיל הפחתת סוכרים או כל germinant כי הוא, כשלעצמו, סוכר צמצום (למשל, גלוקוז) יגרום איתות חזקה ב assay זה. אם זה המקרה, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) שניתן להשתמש בהם כדי לזהות נוכחות של שברי קליפת 24-26. עם זאת, כי לא כל המעבדות מצוידות במכשור כזה, השיטה המתוארת במסמך זה יכול להיות בשימוש על ידי רובמעבדות ומציע תוצאות פשוט לכימות בקלות. נביטה ידי נבגים של חיידקים נחקרה בעיקר Bacillus וכמה מינים Clostridium 2,8. התהליך נשמר בדרך כלל, אולם קיימים הבדלים. חשוב לציין, לא כל האורגניזמים לנבוט באמצעות מנגנונים של נביטה נבג כפי שנצפה במודל נבג-ומעצבי 9,27. בגלל נביטה הופכת למדה באורגניזמים מגוון יותר, assay שתואר לעיל ניתן ליישם אורגניזמים אלה כדי לזהות שברי קליפה במהלך נביטת נבג. על ידי יישום שיטה זו כדי היצורים שנחקרו חדשות הללו, חוקרים יכולים לקבוע את התפקיד חלבוני נביטה שונה לשחק הידרוליזה הקורטקס.

Endospores הם מטבולית צורות רדומות של חיידקים המאפשרים חיידקים להתמיד בסביבות שליליות. אצל חיידקים רבים יוצרי נבגים, יצירת נבגים היא מושרה על ידי מחסור באבות מזון אך תהליך זה יכול להיות נשלט על ידי שינויי pH, חשיפה לחמצן או מדגיש אחרים 1. בעוד בצורה מטבולית הרדומה הנבג שלהם, חיידקים להתנגד קרינת UV, התייבשות, בטמפרטורות גבוהות, והקפאת 2. רוב הידע על תהליך נביגה מגיעה ממחקרים באורגניזם מודל, subtilis Bacillus. תהליך נביגה מתחיל עם שכפול הדנ&quot;א ואת ההיווצרות של 3,4 נימה צירית. מחץ סימטרית אז מחלק התא לשני תאים בגודל שווה. התא הגדול יותר, התא האם, בולע את התא הקטן יותר, forespore. שניהם תא אמא forespore לתאם ביטוי גנים להבשיל לנבגים ואת התא האם בסופו של דבר lyses, שחרור דורמןt נבג לתוך הסביבה 1. מבנה הנבג וההרכב נשמרים על פני מינים רבים של חיידקים. ליבת הנבג יש תכולת מים נמוכה יותר מאשר בתא וגטטיבי והוא עשיר בחומצת dipicolinic (DPA) 1,2. במהלך יצירת נבגים, DPA נשאב לתוך ליבת נבג תמורת מים. המקיף את הליבה הוא קרום נבג פנימי שבו, רוב החיידקים ויוצרים נבג, הקולטנים אשר מזהים את המולקולות הקטנות המעודדות נביטה (germinants) ממוקמים 2. ממוקם ממש מחוץ הקרום הפנימי של הנבג היא שכבה של פפטידוגליקן דופן תא. שכבת פפטידוגליקן מיוחדת (קורטקס) המקיפה את פפטידוגליקן דופן תא והוא מורכב רב של אותם הרכיבים כמו פפטידוגליקן דופן תא [לסירוגין N-acetylglucosamine (נאג) וחומצת N-acetylmuramic (NAM)]. עם זאת, כ -50% של שאריות NAM בקליפה הומרו muramic-δ-לקטם 5,6 </sעד&gt;. במהלך נביטת נבג, שאריות muramic-δ-לקטם אלה מוכרות על ידי האנזימים הממסים קליפת נבג (SCLEs), ובכך מאפשרות את הקליפה להיות מושפלת (תהליך חיוני כדי להשלים נביטה) אבל לא את דופן התא. המקיף את הקליפה הוא קרום חיצוני וכמה שכבות של מעייל חלבונים 2. שליטה על תהליך הנביטה היא חשובה ביותר עבור חיידקים יוצרי נבגים. נביטה מופעלת כאשר קולטנים germinant אינטראקציה עם germinants שלהם 2. אצל חיידקים רבים יוצרי נבגים, germinants אלה הם חומצות אמינו, סוכרים, נוקלאוטידים, יונים או צירופם של אלה 2. ג נביטת נבג difficile היא שיזמה שילובים של חומצות מרות מסוימות, [למשל, חומצת taurocholic (ת&quot;א)] וחומצות אמינו (למשל, גליצין) 7-10. אמנם יש הבדלים בין ג מסלול נביטת difficile ואת המסלולים למדו אחרים נבג יוצריםחיידקים, כגון B. subtilis, משותף לכל הוא הדרישה ההכרחית כדי לבזות את קליפת הנבג לאפשר תא צמח לצמוח מן הנבג ניבט 2,8. השפלה Cortex ניתן להשיג על ידי SCLEs CwlJ / SleB (כפי שנמצאו ב subtilis) או SleC (כפי שנמצאו רבים וקלוסטרידיאה.את). הידרוליזה Cortex מפחיתה את המגבלה על קיר התא לבין הנבג. זה מאפשר התייבשות ליבה מלאה, צעד הכרחי בהפעלה מחדש של רבים מן החלבונים דרושים חילוף חומרים תאיים 2. כאשר נבגים לנבוט, שינויי הנבג הרדומים ממצב שלב בהיר למצב שלב כהה ותהליך זה יכול להימדד על ידי שינוי הצפיפות אופטית (OD) ב 600 ננומטר 11. דו&quot;ח קודם מצביע על כך הרבה מהשינוי הזה ב OD הוא עקב השחרור של DPA מן הנבג 12. במהלך מחקר שנערך לאחרונה שלנו, ביקשנו להשוות עיתוי ג נביטת נבג difficile וליוותה אתשחרורו של שברי DPA ואת קליפת 9. במחקר זה היה חיוני כדי לפקח על שחרורו של שברי קליפה כשהחלו להתפרסם על ידי נובטי נבגים. את assay colorimetric משמש כאן התבסס על שיטה לאיתור סוכרים עם קצות צמצום שפותח Ghuysen et al. 13. מכיוון אחרים תיארו פרוטוקולים לצורך זיהוי של סוכרים הפחתת 14 או שינית אותם פרוטוקולים 15, בספרות העוסקת בנושא זה יכול להיות מבלבל. כאן, אנו בפירוט צעד-אחר-צעד שיטה לאיתור colorimetric הפחתת סוכרים ששוחרר נובטת ג נבגי difficile. למרות מחקר זה משתמש ג נבגי difficile, סוכרי הצמצום שפורסמו במהלך הנביטה של נבגים מחיידקים אחרים להרכיב נבג מסוגלים להתגלות עם פרוטוקול זה 9,16,17.

<table><tbody><tr><td>2.0 ml screw cap tube</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,250 &amp;#956;l pipet tips</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &amp;#956;ll pipet tips</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-D-glucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Tetraborate tetrahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>Saturated Phenol</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Heated, Circulating Water Bath</td><td>VWR Scientific</td><td>Model 1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 well clear tissue culture plates</td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat Blocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Machine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecting cortex fragments during bacterial spore germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

טבלת 1 מראה תוצאות אופייניות באמצעות סטנדרטים נאג. נתונים משמשים ליצירת עקומה סטנדרטית. טבלה 2 מראה תוצאות אופייניות מתוך assay נביטה במאגר נביטה בתוספת 100 גליצין מ&quot;מ ו -10 המ&quot;מ ת&quot;א (תנאים לקידום נביטה) או 100 גליצין מ&quot;מ בלבד (תנאים שאינם נובטים). בהעדר ת&quot;א, ג נבגי difficile לא לנבוט ויש שינוי קטן בנוכחות שברת קליפה בתמיסה. עם זאת, בנוכחות שני ת&quot;א גליצין, ג נבגי difficile לנבוט ולשחרר שברי קליפה לתוך התמיסה. זה הוא ציין גם מגידול OD 585 לאורך זמן של דגימות הגיבו. הסכום הכולל של שברי קליפת המוח (nmol) שפורסמו במהלך assay זה חושב באמצעות עקומת סטנדרט דומה איור 1B. ב assay זה, רוב הקורטקס הוא הידרוליזה (או שוחרר) ב -15 דקות פוסטחשיפת germinant, דבר המצביעה על כך שרוב הנבגים ניבטו במסגרת הזמן הזה (איור 2; בקנה אחד עם פרסום קודם 7). לאחר פיתוח הדגימות מגיבים הצבע, רוב הדגימות לא יכול להראות את הצבע הסגול לעין בלתי המזוינת. איור 1 מציג מדגם מייצג שנוצר בין ה- N-acetylglucosamine. רבים מן הדגימות לא מראים צבע סגול גלוי. עם זאת, 250 nmol, 500 nmol ו -5,000 nmol דגימות להופיע ויזואלית שונה בקרה שלילית (0 nmol). כאשר הנמדדים ננומטר OD 585, האות שנוצר בצורה מיטבית רגרסיה ליניארית (R 2 = 0.999). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig1.jpg" /> איור 1:. זיהוי N-acetylglucosamine (א) דגימות N-acetylglucosamine (0 nmol, 12.5 nmol,25 ננומול, 50 ננומול, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5,000 nmol) היו lyophilized והגיב בהתאם לנוהל המתואר. דוגמאות (B) נוספו צלחת 96-היטב את כמות החומר הגיב זוהתה 585 ננומטר. האות היה השתמש כדי ליצור עקומת סטנדרט. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig2.jpg" /> איור 2:. ייצוג גרפי של תוצאות הנביטה קליפת nmol מחושב בטבלה 2 היה להתוות לעומת הזמן. (●) 100 מ&quot;מ גליצין + 10 מ&quot;מ ת&quot;א; (■) 100 מ&quot;מ גליצין. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54146/54146fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריכוז נאג (nmol) </td><td> OD 585 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0.047 </td></tr><tr><td> 12.5</td><td> 0.054 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 0.066 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.084 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 0.128 </td></tr><tr><td> 250 </td><td> 0.285 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> .556 </td></tr><tr><td> 5,000 </td><td> 4.0 </td></tr><tr><td> = ריק </td><td> 0.046 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: נאג רגיל. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Clostridium difficile Spore נביטה </td></tr><tr><td></td><td colspan="4"> פתרון נביטה (10 מ&quot;מ טריס (7.5 pH), 150 מ&quot;מ NaCl) </td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> 100 מ&quot;מ גליצין + 10 מ&quot;מ ת&quot;א </td><td colspan="2"> 100 מ&quot;מ גליצין </td></tr><tr><td> זמן (דקות) </td><td> OD 585 </td><td>מחושב (nmol) </td><td> OD 585 </td><td> מחושב (nmol) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0.046 </td><td> 0.00 </td><td> 0.047 </td><td> 0.00 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.048 </td><td> 2.54 </td><td> 0.048 </td><td> 1.27 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.05 </td><td> 5.07 </td><td> 0.049 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 0.055 </td><td> 11.41 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 0.059 </td><td> 16.49 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0.06 </td><td> 17.76 </td><td> .051 </td><td> 5.07 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0.061 </td><td> 19.02 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 14 </td><td> .063 </td><td> 21.56 </td><td> .051 </td><td> 5.07 </td></tr></tbody></table> טבלה 2: בואו לטעום Spore Germinatiעל תוצאות.

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination at JoVE.com

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Views.  Texas A&M University. Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Video: Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

Environment

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

שיפור של Bacillus subtilis ספירת נבגים וניתוח תוויות בציטומטריית זרימה

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Biochemistry

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Bioengineering

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci14. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).
The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a "spore discharge assay", which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.
F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain1. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexual crosses and isolation of recombinant progeny are important research tools for the filamentous fungus, Fusarium graminearum, The techniques necessary successfully carry out these processes are presented.

התפתחות מינית והפרשות Ascospore ב Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

Biology

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure makes the spore extremely stable and resistant and has suggested the use of the spore as a platform to display heterologous molecules. So far, a variety of antigens and enzymes have been displayed on spores of Bacillus subtilis and of a few other species, initially by a recombinant approach and, then, by a simple and efficient nonrecombinant method. The nonrecombinant display system is based on the direct adsorption of heterologous molecules on the spore surface, avoiding the construction of recombinant strains and the release of genetically modified bacteria in the environment. Adsorbed molecules are stabilized and protected by the interaction with spores, which limits the rapid degradation of antigens and the loss of enzyme activity at unfavorable conditions. Once utilized, spore-adsorbed enzymes can be collected easily with a minimal reduction of activity and reused for additional reaction rounds. In this paper is shown how to adsorb model molecules to purified spores of B. subtilis, how to evaluate the efficiency of adsorption, and how to collect used spores to recycle them for new reactions.

This protocol focuses on the use of bacterial spores as a &#34;live&#34; nanobiotechnological tool to adsorb heterologous molecules with various biological activities. The methods to measure the efficiency of adsorption are also shown.

נבג ספיחה כמערכת התצוגה Nonrecombinant אנזימים ו אנטיגנים

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

חוקרים נביטה Teliospore באמצעות ניתוח Microrespiration ו- Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...