Name: isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells
Uploaded: 2015-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells at JoVE.com

ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.

Il protocollo che segue è effettuata secondo le linee guida stabilite dal Dipartimento di Medicina di Laboratorio animali presso la University of North Carolina a Chapel Hill. 1. Preparare il seguente materiale e reagenti prima di iniziare <ol><li> Preparare supporti CE, completandola 400 ml glucosio basso (1 g / l D-glucosio o LG) Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM) con 50 ml di siero fetale bovino inattivato al calore, 50 ml di Nu-Siero IV, 5 ml di antibiotico-antimicotico, e la hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, e componenti eparina dal kit commerciale. </li><li> Preparare 500 ml FACS tampone (0,5% BSA e 2 mM EDTA in PBS); filtrare attraverso una sterile 0,22 micron coppa del filtro. </li><li> Sterilizzare o disinfettare dissezione bordo. </li><li> Sterilizzare perni dissezione, forbici chirurgiche e dissettori. </li></ol> 2. Isolamento CE (1 ° giorno, ~ 5 ore) <ol><li> Euthanize mouse con anidride carbonica o altri metodi di spirito compatibileh la cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) politiche. Nota: Più tumori mammari di dimensioni variabili (5 - 15 mm di diametro) possono sviluppare in un singolo mouse geneticamente modificati come C3-Tag, assicurarsi di raccogliere tutti loro per l&#39;isolamento TEC. Se si utilizza tumori che sono ortotopicamente innestato nei topi, piscina due o tre 1 centimetro 3 tumori per un singolo isolamento CE. Qui usiamo tumori mammari come dimostrazione, ma il protocollo può essere modificato per altri tipi di tumori. </li><li> Disinfettare topo nebulizzare o passare la parte ventrale mouse con ampie quantità di 75% v / v di etanolo. </li><li> Resecare tumori con un paio di forbici e dissettori utilizzando tecniche asettiche in una cappa sterile o in un banco pulito. <ol><li> Stendi e pin le membra del mouse su una scheda di dissezione. Effettuare una incisione ventrale linea mediana con le forbici senza aprire il peritoneo. Sezionare lateralmente tra la pelle ed il peritoneo verso le ghiandole mammarie in cui si trovano i tumori.Non aprire il peritoneo. </li><li> Accise solo tessuto tumorale dalle ghiandole mammarie, lasciando fuori normali margini mammarie. Rifilare con cura off tessuti non tumorali, come la pelle ei muscoli, e il luogo tumori sezionato in una provetta contenente 30 ml di LG-DMEM su ghiaccio. </li></ol></li><li> Portare campioni di tumore alla cappa coltura di tessuti; lavare i tessuti con sterile LG-DMEM 1 - 2 volte. </li><li> Trasferire i tumori del tubo conico di una capsula di Petri tessuto-cultura sterili, aggiungere 2 ml di LG-DMEM nel piatto, e tritare con un paio di forbici sterili in pezzi &lt;5 mm. </li><li> Aggiungere 5 ml di collagenasi (magazzino = 2 mg / ml in soluzione salina bilanciata di Hank, seguito HBSS), 1 ml di dispasi (magazzino = 2,5 U / ml in HBSS) e 75 ml di deossiribonucleasi (magazzino = 1 mg / ml in PBS ) nella capsula di Petri. Il volume totale è ora ~ 10 ml. </li><li> Trasferire il mix collagenasi / tessuto dal capsula di Petri di un tubo di tessuto-dissociatore ed eseguire su un dissociatore tessuto per 60 secondi per due volte (pre-impostato di dissociazione prOgram sul dissociatore: 1.270 giri totali per corsa). Incubare con la luce agitando su un agitatore per 75 min a 37 ° C. </li><li> Filtro digerito tessuto attraverso un colino cella 100 micron su una provetta conica da 50 ml. Filtro Sciacquare con 5 ml di tampone FACS per lavare tutte le cellule rimanenti. Spin a 280 xg per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Diluire 1 ml di brodo RBC tampone di lisi (10x) in 9 ml di acqua sterile. Lisare globuli rossi con 10 ml di tampone di lisi (1x), e subito girare 5 min a 280 x g. Nota: Questo passaggio può essere saltato se po &#39;di sangue è visibile. </li><li> Risospendere in 10 ml di tampone FACS. Miscelare 10 ml di sospensione cellulare con 10 ml di trypan blu, e contare le cellule vive con un emocitometro. </li><li> Risospendere le cellule a ~ 10 7 cellule / 100 ml. Aggiungere 10 ml di FcR blocco per 100 ml di sospensione cellulare e incubare in ghiaccio per 10 min. </li><li> Aggiungere anticorpi CD31 ratto anti topo PE coniugato secondo. alla Tabella 1 Incubare in ghiaccio per 10-15 minuti e tubo flick di tanto in tanto. </li><li> Aggiungere 10 ml di tampone FACS al tubo e girare a 280 xg per 5 minuti. Rimuovere con attenzione il surnatante, e lavare il pellet cellulare nuovo con 5 ml di tampone FACS. Centrifuga a pellet cellule. Aspirare il surnatante senza pellet inquietante. </li><li> Aggiungere FACS tampone e anti-PE microsfere secondo la Tabella 2 Incubare in ghiaccio per 10 -. 15 min. Flick tubo di tanto in tanto. </li><li> Aggiungere 10 ml di FACS tampone e di spin campioni a 280 xg per 5 minuti; Risciacquare una volta con 5 ml di tampone FACS e centrifugare nuovamente. Aspirare il surnatante senza disturbare pellet. </li><li> Portare il volume a 300 ml in tampone FACS. Spin attraverso 35 micron cellula-filtro ricoperto tubo 5 min a 280 x g. Utilizzare 2 tubi e un volume maggiore, se necessario. </li><li> Impostare multistand magnetica e colonne magnetici in cappuccio, collegare una colonna al separatore ed equilibrare la colonna con 2 ml di tampone FACS. </li><li> Aspirate il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 - 1 ml di tampone FACS. </li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso la colonna magnetica equilibrata. </li><li> Lavare la colonna tre volte con 2 ml di tampone FACS, e raccogliere flow-through (FT) in un tubo di 15 ml (frazione FT). </li><li> Prendere colonna fuori il separatore ed eluire con 2 ml di tampone FACS in un altro tubo 15 ml (frazione di eluato). Utilizzare stantuffo per garantire tutte le cellule sono fuori dalla colonna. Ripetere la eluizione altre due volte con 2 ml di tampone FACS ogni volta. </li><li> Spin l&#39;eluato a 280 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di media CE. </li><li> Altrettanto dividere la frazione di eluato (~ 6 ml) in 10 piatti cm rivestiti di gelatina. Per tre 1 cm 3 tumori, le cellule piastra eluita in almeno quattro piatti. Cellule alternativa, piatto eluito a diverse concentrazioni in più lastre (ad es., Seminare 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml e 3 ml di eluato in quattro piatti) per garantire che unat almeno una piastra è scarsamente seminato con le cellule eluite. Verificare che la confluenza delle cellule attaccate è ~ 1% il giorno dopo (cioè, circa 1,0 - 2,0 x 10 5 cellule allegate). Nota: le cellule devono essere placcato sparso in modo che le colonie CE possono formarsi senza essere contaminato da altri tipi di cellule. </li><li> Piastra frazione FT in un piatto 10 centimetri di lasciare le cellule recuperare O / N. Controllare che il piatto è 80-100% confluenti il ​​giorno successivo. Congelare le cellule (-80 ° C) a 250 supporti cellulari congelamento microlitri in un cryotube e conservarli in azoto liquido il giorno successivo. Nota: frazione FT può essere utilizzato per l&#39;isolamento delle cellule tumorali in una fase successiva e / o come controllo negativo per l&#39;analisi di espressione genica CE dei cloni isolati CE. </li><li> Modificare i media ogni 2 - 3 giorni. Colonies cominciano a formarsi dopo 7 - 10 giorni. Colonie piccole CE possono essere individuati prima giornata 3. Mark le colonie con un pennarello fine punta sul fondo del piatto. </li><li> Raschiare non specifico cells circondano le colonie identificate con una sterile, punta Pippet 200 microlitri. </li></ol> 3. Colony selezione Anelli Usare Clonazione <ol><li> Modificare i media ogni 2 - 3 giorni. Purezza CE può essere controllato da LDL (DII-Ac-LDL), oltre a circa 5-7 giorni. Aggiungere 50 ml di LDL per 10 ml di mezzo CE e incubare per 3-4 ore prima di controllare le cellule al microscopio a fluorescenza. Nota: Multiple LDL + cloni CE possono essere osservati a ~ 7 giorni. </li><li> Inizia la raccolta colonie CE quando raggiungono diametri di 3 - 5 mm di dimensione. (Scegliere grandi colonie che sono pieni di piccoli LDL + cellule per ottenere i migliori risultati.) </li><li> Prima della raccolta CE con anelli di clonazione, pre-coat alcune 6 pozzetti con 0,5% di gelatina. Aspirare gelatina, aggiungere 2 ml di media CE per ogni bene, e tenere le piastre in un incubatore fino al momento. </li><li> Raschiare non CE sui bordi delle colonie per assicurarsi che non altri tipi di cellule saranno intrappolati all&#39;interno dell&#39;anello clonazione. </li><li> Utilizzando unmicroscopio a contrasto di fase (4X o 10X obiettivo), contorno con un pennarello fine-tip sul fondo del piatto cultura delle aree contenenti colonie CE. </li><li> Lavare la piastra con 10 ml di PBS e lasciare uno strato molto sottile di PBS nella piastra durante l&#39;aspirazione. (Importante: una piccola quantità (~ 0,5 ml) di PBS manterrà cellule vive durante la procedura di clonazione-ring, anche, tessuto adesivo ha bisogno di acqua per legare.) </li><li> Scegliere un anello di clonazione di dimensioni adeguate. Utilizzare un paio di dissettore a prendere un anello, e con una punta di pipetta 10 microlitri uniformemente applicare una piccola quantità di tessuto adesivo sull&#39;anello clonazione. Nota: utilizzare solo minima quantità (~ 0,2 microlitri per un piccolo anello) di tessuto adesivo su anelli di clonazione, e assicurarsi che il tessuto adesivo è distribuito in modo uniforme intorno alla superficie di fondo per garantire una buona tenuta. Tessuto adesivo eccessivo produce calore e forma film che possono uccidere le cellule. </li><li> Posizionare l&#39;anello di clonazione sopra la colonia CE. Premere delicatamente verso il basso l&#39;anello di clonazione per incollare i ring sul piatto. Assicurarsi che le colonie non sono asciugato prima di incollare l&#39;anello. </li><li> Immediatamente pipettare 25 ml di soluzione di distacco delle cellule enzimatica sul ring clonazione e incubare ~ 1 min o fino a quando le cellule sono vagamente collegati. </li><li> Cellule pipetta sul ring clonazione goccia a goccia in un pozzetto di un 6-pozzetti contenenti supporti CE pre-riscaldato. (Importante: Non agitare la piastra per disperdere le cellule, CE preferiscono crescere in ammassi stretti.) Lavare l&#39;anello di clonazione con 50 - 100 supporti CE microlitri di raccogliere il maggior numero di cellule possibile e trasferire tutti i lavaggi nello stesso 6-bene . </li><li> Se alcune colonie nel piatto 10 centimetri sono troppo piccoli per raccogliere, aggiungere 10 ml di mezzi freschi, lasciare che le colonie crescono per qualche giorno in più, e ripetere la procedura di clonazione anello. </li><li> Crescere colonie raccolte in 6 pozzetti fino a 80-100% confluenti, e il trasferimento di cellule a 3 pozzetti di una 6-pozzetti, prima di espandersi in un 10 centimetri piatto di coltura di tessuti. Raschiare le cellule contaminanti. Ripetereun altro giro di procedura anello clonazione (i passaggi 3,5-3,10) se necessario. Mantenere le cellule relativamente confluenti (~ 60 - 70%) durante l&#39;espansione. CE può smettere di crescere se placcato troppo scarsa. </li><li> Caratterizzare CE da FACS, la colorazione, la PCR, ecc Si noti che Dil-Ac-LDL è fluorescente e può interferire con PE o altri anticorpi fluorescenti per FACS. </li></ol>

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-angiogenesis:+new+concept+for+therapy+of+solid+tumors.">Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors.</a> Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).</li><li>Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instructive+role+of+the+vascular+niche+in+promoting+tumour+growth+and+tissue+repair+by+angiocrine+factors.">Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).</li><li>Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+endothelial+cells+directly+influence+cancer+progression.">Stromal endothelial cells directly influence cancer progression.</a> Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).</li><li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells.">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li><li>Beck, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vascular+niche+and+a+VEGF-Nrp1+loop+regulate+the+initiation+and+stemness+of+skin+tumours.">A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours.</a> Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (1), a006429 (2012).</li><li>Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells.">Tumor endothelial cells.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (3), a006536-a006536 (2012).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+heterogeneity+of+tumor+endothelium.">Molecular heterogeneity of tumor endothelium.</a> Cell Tissue Res. 335 (1), 271-281 (2009).</li><li>Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+endothelial+cells+based+on+their+increased+uptake+of+acetylated-low+density+lipoprotein.">Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein.</a> J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).</li><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells.">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li><li>Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).</li><li>Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stable+molecular+signature+in+mammary+tumor+endothelial+cells+that+persists+in+vitro.">Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro.</a> Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).</li><li>Beijnum, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+tumor+angiogenesis+dissected:+specific+targeting+of+colon+cancer+angiogenic+vasculature.">Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature.</a> Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).</li><li>McDonald, D. M., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+angiogenesis:+from+microscope+to+clinic.">Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic.</a> Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).</li><li>Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+abnormalities+of+blood+vessels+as+targets+in+cancer.">Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer.</a> Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).</li><li>Ghosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+endothelial+cells+exhibit+aberrant+Rho-mediated+mechanosensing+and+abnormal+angiogenesis+in+vitro.">Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).</li><li>Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells+express+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+but+not+ErbB3+and+are+responsive+to+EGF+and+to+EGFR+kinase+inhibitors.">Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors.</a> Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).</li><li>Hida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+endothelial+cells+with+cytogenetic+abnormalities.">Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities.</a> Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).</li><li>Dudley, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcification+of+multipotent+prostate+tumor+endothelium.">Calcification of multipotent prostate tumor endothelium.</a> Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).</li><li>Dunleavey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+channels+formed+by+subpopulations+of+PECAM1(+)+melanoma+cells.">Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells.</a> Nat. Comm. 5, 5200 (2014).</li><li>St Croix, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+human+tumor+endothelium.">Genes expressed in human tumor endothelium.</a> Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).</li><li>Bhati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+human+breast+tumor+vascular+cells.">Molecular characterization of human breast tumor vascular cells.</a> Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).</li><li>Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+CYP24+in+the+tumor+microenvironment.">Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+endothelial+cells+in+culture.+Growth+and+DNA+synthesis.">Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis.</a> J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).</li><li>Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+vascular+bed+origin+influence+differences+in+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries.">Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).</li><li>Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+differences+between+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries+revealed+by+microarray+analysis.">In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).</li><li>Paruchuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pulmonary+valve+progenitor+cells+exhibit+endothelial/mesenchymal+plasticity+in+response+to+vascular+endothelial+growth+factor-A+and+transforming+growth+factor-beta2.">Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2.</a> Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li><li>Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -. H., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+endothelial+cells+with+osteogenic+differentiation+potential.">Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).</li><li>Ginsberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+direct+reprogramming+of+mature+amniotic+cells+into+endothelial+cells+by+ETS+factors+and+TGF&#946;+suppression.">Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGF&#946; suppression.</a> Cell. 151 (3), 559-575 (2012).</li><li>Sapino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD31+by+cells+of+extensive+ductal+in+situ+and+invasive+carcinomas+of+the+breast.">Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast.</a> J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).</li><li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations.">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li><li>Cooley, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling+mediates+endothelial-to-mesenchymal+transition+(EndMT)+during+vein+graft+remodeling.">TGF-&#946; signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling.</a> Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).</li><li>Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie1+deficiency+induces+endothelial-mesenchymal+transition.">Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition.</a> EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+endothelial+cells+with+distinct+patterns+of+TGF&#946;-driven+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGF&#946;-driven endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li><li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone.">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+clonally+expanding+haematopoietic+compartment+in+bone+marrow.">Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow.</a> EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).</li><li>Sawamiphak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+regulates+VEGFR2+function+in+developmental+and+tumour+angiogenesis.">Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).</li><li>Chi, J. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+diversity+revealed+by+global+expression+profiling.">Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).</li><li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration.">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells.">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A causa delle difficoltà di ottenere colture TEC primaria pure, molti studi in vitro TCE sostituto con le linee disponibili in commercio CE o primaria CE, come vena ombelicale umano CE (HUVEC) 13. Tuttavia, queste popolazioni CE dai tessuti normali possono servire solo come un proxy per TEC che si differenziano nettamente dalle loro controparti normali. Ad esempio, TEC sono fenotipicamente e funzionalmente anormale in vivo e alcune di queste anomalie può essere trasmissibile in vitro 14-18. TEC ha aberranti crescita, migratori, e capacità di differenziazione e può fondersi con le cellule CD31 + tumorali di formare strutture di navi simili a 16,19,20. Gli studi che utilizzano sia TEC o catturare laser vasi tumorali micro-sezionato in coltura hanno dimostrato che la TEC si discostano dal normale CE espressione genica, citogenetica, e profili epigenetici 12,18,21-23. Nonostante approfondire la nostra comprensione di angiogenesi tumorale negli ultimipochi decenni, pochissimi studi funzionali e meccanicistici utilizzando colta TEC primaria sono disponibili. CE sono stati isolati dalle vene ombelicale umano nei primi anni del 1970 24. Isolamento e la successiva coltura di microvascolare CE da altri tessuti umani e di topo ha fornito un potente strumento per studiare le funzioni endoteliali sia in salute e malattia 25-28. La maggior parte dei protocolli di isolamento CE prevedono tre fasi principali: l&#39;ottenimento di una cella singola sospensione dopo dissociazione meccanica o digestione enzimatica, etichettatura CE con un anticorpo specifico per endoteliale che è coniugato, o un fluoroforo o magnetici microsfere, e arricchendo la popolazione CE mediante separazione delle cellule o colonne magnetiche. Tuttavia, l&#39;isolamento di topo CE, in particolare da tumori, è dimostrato difficile a causa della bassa resa di vitale CE e frequente contaminazione di altri tipi di cellule tumorali comprese le cellule e fibroblasti. Inoltre, in vitro fenotipica deriva della CE in mecellule senchymal-like (endotelio-a-mesenchimale transizione, EndMT) rappresenta una sfida aggiuntiva per la coltura a lungo termine della CE da tessuti normali, tumori, e precursori riprogrammate. La sfida maggiore durante l&#39;isolamento TEC è la contaminazione da parte delle cellule tumorali, che possono facilmente outcompete i più lenta crescita colonie CE che compaiono in genere dopo ~ 7 - 10 giorni in cultura. Inoltre, un marcatore di selezione comunemente usato per isolare CE è CD31 che è abbondantemente espresso nell&#39;endotelio ma segna anche cellule ematopoietiche e in alcuni casi sottopopolazioni di cellule tumorali 20,30. Inoltre, arricchendo per CE, selezione della colonna immunomagnetica CD31-mediata non può rimuovere ogni singola cellula contaminazione che può eventualmente assumere culture comunitarie, dopo alcuni passaggi. Con l&#39;aggiunta di un passo clonazione anello, uno è in grado di selezionare ed espandere popolazioni pure clonale derivati ​​CE che sono privi di questi tipi di cellule contaminanti. Una seconda sfida è il principale a lungo terminemanutenzione di puro CE senza promozione EndMT. EndMT verifica durante lo sviluppo, può essere riassunta durante disfunzione vascolare, ed è comune in coltura CE (soprattutto in presenza di TGFβ) 31-33. Per minimizzare EndMT, rimuovere le cellule contaminanti che possono agire come fonte TGFβ, tenere colture ad alte densità, e mantenere elevate concentrazioni di bFGF in media in ogni momento. Come abbiamo mostrato di recente, bFGF è essenziale per preservare le specifiche CE, in quanto espressione antagonizza TGFβ-driven di actina muscolo liscio (un marcatore EndMT) 34. Usando questa metodologia, l&#39;isolamento di EC da un topo giornalista &quot;destino mappato&quot; è stato anche mostrato. Questi topi sono particolarmente utili negli studi in cui l&#39;imaging intravitale è necessario 35. Anche se alcuni etichettatura delle cellule ematopoietiche si può verificare nel cre Cdh5: ZsGreen l / s / l topi utilizzati qui, questo modello offre un metodo relativamente rapido e facile per la generazione di influenzaorescent CE in vivo. Un modello alternativo lignaggio etichettatura CE è un mouse tamoxifene-inducibile (Cdh5 cre / ERT2) incrociata con un ceppo di topi giornalista floxed (ZsGreen l / s / l) che avrà CE fedelmente e irreversibilmente segnata 36,37 . Fluorescente CE dai topi CRE inducibile può anche essere purificato mediante FACS o utilizzando la metodologia che descriviamo qui. CE sono eterogenei attraverso diversi letti vascolari e &quot;intra-nave&quot; eterogeneità può anche esistere tra CE all&#39;interno della stessa nave 38,39. Inoltre, una gerarchia di CE con differente potenziale proliferativo è stato osservato nelle popolazioni CE isolati dalle vene, e una piccola frazione di clonale CE possono essere diversi passaggi oltre 40 popolazione raddoppi 40. Pertanto, le limitazioni del metodo descritto qui includono: 1) eventuale selezione di questi altamente proliferative CE residente nella parete del vaso; e 2) l&#39;arricchimento di una sola specific sottotipo vascolare derivato da arterie, vene, o capillari, che può produrre cloni che non rappresentano completamente la popolazione totale CE in vivo. Tuttavia, come più sottopopolazioni clonali possono essere ottenuti da una procedura di isolamento, questo metodo può essere utile per analisi funzionali e genetici di eterogeneità CE che esiste all&#39;interno tumori e altri tessuti 12. Nel loro insieme, qui descritto è un metodo di isolamento CE che produce colonie pure CE privi di contaminazione non CE. Le cellule isolate dovrebbero essere utili per gli studi in vitro funzionali, tutto il genoma profilo di espressione, e la caratterizzazione molecolare di nuovi percorsi che controllano l&#39;angiogenesi tumorale.

Le cellule endoteliali (EC) sono essenziali durante lo sviluppo di tumori solidi. Da inizio dello switch angiogenico nei tumori dormienti per la diffusione e la semina delle metastasi a siti distanti, CE formano i condotti che forniscono sangue, ossigeno e sostanze nutritive per sostenere la crescita del tumore 1. Come recentemente suggerito, CE hanno anche funzioni di perfusione indipendente e formano una nicchia che supporta la crescita delle cellule staminali del cancro e di altre cellule stromali del tumore 2-5. Così, altamente purificato CE (TCE) per la cultura in vitro tumore-specifica permette di studi funzionali di routine che faranno luce sui meccanismi molecolari che mediano l&#39;angiogenesi tumorale e diafonia con le cellule tumorali. CE sono altamente specializzata a seconda del tessuto di origine 6. A causa della natura eterogenea dei diversi tipi di tumore e il microambiente tumorale, TEC può anche visualizzare le caratteristiche uniche che riflettono un tumore-specifica specializzazione of il sistema vascolare. Ad esempio, vi è la variabilità sorprendente nelle firme di espressione genica nel TEC isolate da diversi tipi o categorie di tumori 7,8. Tuttavia, frequenti co-purificazione di non CE, in particolare fibroblasti associati al tumore e le cellule tumorali, con TEC può confondere le analisi di espressione su scala genomica. Questi tipi di cellule indesiderate sono particolarmente problematico in studi che si basano su a lungo termine in espansione in vitro di culture TEC. Descritto qui è un metodo ad alta fedeltà che produce costantemente le colture pure CE da tumori e di altri tessuti. A seguito di colonna immunomagnetica arricchimento delle frazioni e la rimozione di co-purificato non CE CE, un passo clonazione anello aggiuntivo per catturare colonie puri CE viene utilizzato 9. Ogni colonia può essere espansa in coltura per più passaggi, senza l&#39;emergere di contaminazione non CE. Questo metodo produce anche più cloni CE da una singola procedura di isolamento, che è ideale per lo studio di endoeterogeneità thelial. Inoltre, è dimostrato che Cdh5 cre: / l topi ZsGreen l / s giornalista sono uno strumento prezioso per la generazione EC &quot;destino-mapped&quot; e indelebilmente marcato che mantengono ZsGreen fluorescenza nella cultura 10. Con piccole modifiche al protocollo, questo metodo dovrebbe essere adattabile a diversi tipi di tumore o tessuti normali.

<table><tbody><tr><td>Antibiotic-Antimycotic&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Bullet Kit&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td>Not all components used</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (Hyclone)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Heat inactivated at 56 &amp;deg;C for 30 min</td></tr><tr><td>Nu-Serum IV</td><td>Corning</td><td>CB-51004</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBBS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 &amp;mu;m filter</td></tr><tr><td>75% v/v ethanol for disinfection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE microbeads&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%</td><td>Gibco</td><td>15260-37</td><td></td></tr><tr><td>Cell freezing media (Bambanker)</td><td>Wako Chemicals</td><td>302-14681</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td>Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002004</td><td>Make stock concentration 1 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Dil-Ac-LDL</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-902</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CL</td><td></td></tr><tr><td>Enzymatic cell detachment solution (Accutase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin, 2% in water, tissue culture grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100ML</td><td>Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution</td></tr><tr><td>Mouse FcR Blocking Reagent&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Neutral protease (Dispase)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS02104</td><td>Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS</td></tr><tr><td>PE-rat anti-mouse CD31 antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4 %&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10 mm tissue culture dishes</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes (sterile)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes (sterile)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture plates</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Cell Separator&amp;nbsp; (MidiMACS)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cloning rings (assorted sizes)</td><td>Bel-Art Products</td><td>378470000</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting board</td><td></td><td></td><td>Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissecting forceps and scissors</td><td></td><td></td><td>Sterilize before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissecting pins 2&quot;</td><td></td><td></td><td>Sterilize before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FACS tubes with 35 &amp;mu;m filter cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Filter cup (Stericup, 0.22 &amp;mu;m)</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Fine-tip marker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Multistand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Tissue adhesive (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation</td></tr><tr><td>Tissue culture hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue dissociator (gentleMACS)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Preset program &quot;m_impTumor_01&quot; used for tissue dissociation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate or rotary shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phase contrast light microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells

Appena isolate tumore-specifici cellule endoteliali (TEC) possono essere usati per esplorare i meccanismi molecolari di angiogenesi tumorale e servire come un modello in vitro per lo sviluppo di nuovi inibitori dell&#39;angiogenesi per il cancro. Tuttavia, a lungo termine in espansione in vitro di cellule endoteliali murine (EC) è difficile a causa di deriva fenotipica nella cultura (passaggio endoteliale-a-mesenchimale) e la contaminazione con i non-CE. Ciò è particolarmente vero per TEC, che sono prontamente outcompeted da fibroblasti co-purificate o cellule tumorali in coltura. Qui, un metodo di isolamento ad alta fedeltà che sfrutta arricchimento immunomagnetica accoppiato con selezione delle colonie e in espansione in vitro è descritto. Questo approccio genera frazioni pure CE che sono completamente libero di contaminare cellule stromali o tumorali. E &#39;inoltre dimostrato che lignaggio tracciato Cdh5 cre: / l topi reporter ZsGreen l / s, utilizzati con il protocollo qui descritto, sono un valido strumento per verificare cellularepurezza isolate colonie CE di questi topi mostrano durevole e brillante fluorescenza ZsGreen nella cultura.

CE rappresentano soltanto una frazione minore della popolazione cellulare totale nella maggior parte dei tessuti adulti 11. È quindi importante digerire completamente il tessuto raccolto in una cella singola sospensione che assicura il rilascio massimo CE da matrice extracellulare (ECM) e dei tessuti connettivi. Nella nostra esperienza, la selezione immunomagnetica CD31-mediata prevede solo arricchite, ma non puri frazioni CE; Pertanto, un altro passo fondamentale è la rimozione fisica di co-purificata non CE e selezione / espansione di colonie CE utilizzando anelli di clonazione (Figura 1). Ad esempio, quando CD31 arricchita CE sono state placcato senza ulteriore selezione colonia, non CE rapidamente moltiplicate e mescolate con CE, producendo culture CE impuri come rivelato da Dil-Ac-LDL + e DII-AC-LDL - popolazioni (Figura 2A) . Tuttavia, quando eluati colonna sono stati placcati a bassa densità, le colonie CE sono cresciuti con relativamente pochi circostante non CE, che sono stati rimossi da scviolentare con una punta di pipetta (Figura 2B). La crescita e la purezza delle colonie espansi possono essere ulteriormente controllati mediante aggiunta di Dil-Ac-LDL. Colonie piccole CE possono essere osservati a ~ sette giorni dopo CD31-mediata colonna arricchimento (Figura 2B, pannelli superiori). Dopo la selezione e l&#39;espansione delle colonie della CE, Dil-Ac-LDL - le cellule vengono eliminate, e la popolazione cellulare è altamente puro per Dil-Ac-LDL + CE, come indicato dal Dil-Ac-LDL assorbimento (Figura 2B, pannelli inferiori). Per verificare se il metodo di isolamento in grado di produrre risultati coerenti, più cloni derivati ​​da entrambi i tumori mammari asportati da C3-tag (FVB / N C3 1 -tag) topi o normali ghiandole mammarie di topi wild-type FVB pari età sono stati isolate ed espanse 12. La purezza di ogni TEC e normale (NEC) Popolazione CE è stata poi accuratamente caratterizzata per garantire la purezza. Citometria a flusso analisi di tre campioni indipendenti hanno mostrato un unico, UniforCD31 + med popolazione che era distinta dai controlli isotipici IgG (Figura 3A). L&#39;espressione di mRNA di marcatori CE, tra CD31, Cdh5 (VE-caderina), CD133, e VEGFR2 in tutte le quattro cloni CE testato era ~ 200 a 7000 volte superiore a quella di fibroblasti embrionali di topo (MEF) che è stato usato come controllo negativo (Figura 3B). Come previsto, tutti i cloni CE espressi livelli quasi non rilevabili di geni marcatori mesenchimali COL1A1 e Tagln rispetto al MEF. Immunofluorescenza hanno dimostrato che tutte le cellule di un clone TEC rappresentante erano CD31 + uniformemente (Figura 3C). Inoltre, questi cloni comunitari sono stati in grado di formare strutture vasi simili spontanee in vitro, indicando che mantengono le funzioni endoteliali dopo coltura (Figura 3D). Il metodo di isolamento è stato ulteriormente convalidato utilizzando Cdh5 cre: ZsGreen <sup&gt; l / s / l topi dove tutto CE sono indelebilmente etichettati con la proteina fluorescente verde, ZsGreen (4A, a). Il tessuto polmonare che contiene abbondante CE è stato utilizzato come prova di principio per la procedura di isolamento (Figura 4A b,). ZsGreen + cellule compresa ~ 30% della popolazione totale di cellule in omogenati di polmone, e sono stati parzialmente arricchiti dopo CD31-mediata selezione immunomagnetica colonna (Figura 4B). Come Cdh5 cre: / l topi ZsGreen l / s portano un gene cre costitutiva, una percentuale di cellule ematopoietiche sono anche etichettata con ZsGreen 10. Pertanto, la percentuale effettiva CE nei polmoni può essere inferiore rispetto alla ~ 30%. In particolare, circa il 20% delle cellule co-isolato con ZsGreen + / CD31 + CE erano ZsGreen - (Figura 4B). Poiché la contaminazione da questi non CE può persistere in coltura, la popolazione arricchita CE in questa fase non è adatto per studirichiedono ulteriori nelle cellule in coltura in vitro. Tuttavia, dopo l&#39;applicazione di anelli di clonazione di catturare colonie puri CE, un puro ZsGreen 100% + della popolazione è stato ottenuto che potrebbe essere ulteriormente ampliato in coltura (figure 4C e 4D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53072/53072fig1.jpg" /> Figura 1. Flow Chart e Panoramica sulla procedura di isolamento CE. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53072/53072fig2.jpg" /> Figura 2. Dil-Ac-LDL Distingue CE da contaminanti non CE in Culture Live. Contrasto (A) Fase e immagini fluorescenti mostrano CE e co-isolato non CE senza selezione clonazione-anello di colonie CE. (B) contrasto di fase e le immagini fluorescenti di colonie CE in diverse fasi di isolamento. Le linee tratteggiate segnano la boundaries di Dil-Ac-LDL + EC e cellule contaminanti circostanti. Frecce bianche indicano non CE fuori una colonia CE che deve essere rimosso con un puntale. Barre di scala rappresentano il 100 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53072/53072fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53072/53072fig3.jpg" /> Figura 3. clonazione Anelli e rimozione fisica di non CE Produce colture pure e funzionali a lungo termine della CE. (A) FACS Rappresentante punteggiano appezzamenti di CD31 colorazione di diversi cloni CE. Sono mostrati tre campioni rappresentativi. Il rettangolo nero aperto in ogni appezzamento delinea la popolazione CD31 +. Un isotipo IgG è usato come controllo negativo. (B) Misura dell&#39;espressione genica endoteliale selezionati NEC e TEC cloni. I livelli di mRNA di endothelgeni IAL CD31, CD133, Cdh5 e VEGFR2 sono espressi rispetto a quelli dei fibroblasti embrionali di topo (MEF), ed i livelli di mRNA dei geni mesenchimali COL1A1 e Tagln sono espressi rispetto a quelli di NEC-1. (C) Rappresentante immunofluorescenza di un clone TEC espanso. CD31 viene evidenziato in verde e nuclei sono macchiati blu con 4&#39;6&#39;-diamidino-2-phenylindole (DAPI). (D) Immagini rappresentative della formazione del tubo di diversi cloni CE placcato su Matrigel. Barre di scala rappresentano il 100 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53072/53072fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53072/53072fig4.jpg" /> Figura 4. CE Isolato da Cdh5 cre: ZsGreen <strong&gt; / l Mouse l / s Mantenere Brillante ZsGreen fluorescenza nella cultura (A) endoteliale di lineage tracing del mouse Cdh5 cre:. ZsGreen l / s / l porta un transgene ZsGreen floxed che è indotta da Cdh5 Cre espresso dalla CE. (a) Lung tessuto dal cre Cdh5: ZsGreen l / s / l topi sono state raccolte e digeriti per l&#39;isolamento CE. (b) Immagini rappresentative della Cdh5 cre: / l tessuto polmonare del mouse ZsGreen l / s. ZsGreen (verde) etichette l&#39;endotelio e nuclei sono colorati con DAPI (blu). (B) FACS dot blot che mostra le percentuali di + cellule ZsGreen prima (pannello centrale) e dopo (pannello di destra) il CD31-mediata colonna arricchimento del tessuto polmonare omogeneizzato di un Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l mouse. Senza macchia wild-type (WT) omogenato polmone (pannello di sinistra) è stato utilizzato come controllo negativo per gating. Le grandi rettangoli aperti indicano ZsGreen - cells ed i piccoli rettangoli aperti indicano cellule doppio positive per ZsGreen (canale FL1-H) e CD31 (FL2-H canale). (C) FACS istogramma trama mostrando che ZsGreen + CE (picco verde) rimangono puro al 100% dopo coltura in vitro. A ZsGreen - popolazione CE è stato utilizzato come controllo negativo (grigio picco). (D) contrasto di fase Rappresentante e immagini fluorescenti di un ZsGreen fase iniziale + colonia CE e un esteso colonia ZsGreen + CE. Barra della scala rappresenta il 100 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53072/53072fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td class="xl63"> Numero di cellulare </td><td class="xl64"> Tampone FACS (ml) </td><td class="xl64"> CD31-PE anticorpi (ml) </td></tr><tr><td class="xl65"> 1 x 10 7 </td><td class="xl66"> 100 </td><td class = &quot;xl66&quot;&gt; 5 </td></tr><tr><td class="xl65"> 2 x 10 7 </td><td class="xl66"> 200 </td><td class="xl66"> 6 </td></tr><tr><td class="xl65"> 3 x 10 7 </td><td class="xl66"> 300 </td><td class="xl66"> 7 </td></tr><tr><td class="xl65"> 4 x 10 7 </td><td class="xl66"> 400 </td><td class="xl66"> 8 </td></tr><tr><td class="xl65"> 5 x 10 7 </td><td class="xl66"> 500 </td><td class="xl66"> 9 </td></tr><tr><td class="xl65"> 6 x 10 7 </td><td class="xl66"> 600 </td><td class="xl66"> 10 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Volumi Anti-CD31 Anticorpo PE-coniugato necessarie nelle diverse numero di cellule. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td class="xl63"> Numero di cellulare </td><td class="xl64"> Tampone FACS (ml) </td><td class="xl64"> Anti-PE microsfere magnetiche (ml) </td></tr> &lt;tr&gt; <td class="xl65"> 1 x 10 7 </td><td class="xl66"> 80 </td><td class="xl66"> 20 </td></tr><tr><td class="xl65"> 2 x 10 7 </td><td class="xl66"> 160 </td><td class="xl66"> 40 </td></tr><tr><td class="xl65"> 3 x 10 7 </td><td class="xl66"> 240 </td><td class="xl66"> 60 </td></tr><tr><td class="xl65"> 4 x 10 7 </td><td class="xl66"> 320 </td><td class="xl66"> 80 </td></tr><tr><td class="xl65"> 5 x 10 7 </td><td class="xl66"> 400 </td><td class="xl66"> 100 </td></tr><tr><td class="xl65"> 6 x 10 7 </td><td class="xl66"> 480 </td><td class="xl66"> 120 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. I volumi di Anti-PE microperla necessarie nelle diverse numero di cellule.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

isolation-and-culture-expansion-of-tumor-specific-endothelial-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models. 

Video: Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide complete protection against the development or recurrence of breast cancer. To overcome this problem by increasing the frequency of tumor-reactive T cells, adoptive immunotherapy has been employed. A variety of protocols have been used for the expansion of tumor-specific T cells. These protocols, however, are restricted to the use of tumor antigens ex vivo for the activation of antigen-specific T cells. Very recently, common gamma chain cytokines such as IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21 have been used alone or in combination for the enhancement of anti-tumor immune responses3. However, it is not clear what formulation would work best for the expansion of tumor-reactive T cells. Here we present a protocol for the selective activation and expansion of tumor-reactive T cells from the FVBN202 transgenic mouse model of HER-2/neu positive breast carcinoma for use in adoptive T cell therapy of breast cancer. The protocol includes activation of T cells with bryostatin-1/ionomycin (B/I) and IL-2 in the absence of tumor antigens for 16 hours. B/I activation mimics intracellular signals that result in T cell activation by increasing protein kinase C activity and intracellular calcium, respectively4. This protocol specifically activates tumor-specific T cells while killing irrelevant T cells. The B/I-activated T cells are cultured with IL-7 and IL-15 for 24 hours and then pulsed with IL-2. After 24 hours, T cells are washed, split, and cultured with IL-7 + IL-15 for additional 4 days. Tumor-specificity and anti-tumor efficacy of the ex vivo expanded T cells is determined.

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

An efficient protocol for the ex vivo expansion of tumor-reactive T cells from tumor-draining lymph nodes or other secondary lymphoid tissues of tumor-bearing hosts is described. This protocol selectively expands tumor-specific T cells for use in adoptive immunotherapy of breast cancer.

Espansione ex vivo di tumore cellule T reattive per mezzo di 1/Ionomycin Bryostatin e il Comune catena gamma Citochine Formulazione

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

Isolamento di cellule endoteliali umane da Colon normale e Carcinoma colorettale - un protocollo migliorato

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Ricerca sul cancro

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Biologia dello sviluppo

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolamento di primarie cellule del colon tumorali umane dai tessuti chirurgici e Coltura direttamente su più elastica e flessibile substrati per trazione citometria

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Bioingegneria

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Biologia

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Neuroscienze

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional veins. The purpose of this article is to carefully describe the establishment of a murine xenograft model that mimics human VM and is able to reflect patient heterogeneity. Hyper-activating non-inherited (somatic) TEK (TIE2) and PIK3CA mutations in endothelial cells (EC) have been identified as the main drivers of pathological vessel enlargement in VM. The following protocol describes the isolation, purification and expansion of patient-derived EC expressing mutant TIE2 and/or PIK3CA. These EC are injected subcutaneously into the back of immunodeficient athymic mice to generate ectatic vascular channels. Lesions generated with TIE2 or PIK3CA-mutant EC are visibly vascularized within 7&#8210;9 days of injection and recapitulate histopathological features of VM patient tissue. This VM xenograft model provides a reliable platform to investigate the cellular and molecular mechanisms driving VM formation and expansion. In addition, this model will be instrumental for translational studies testing the efficacy of novel drug candidates in preventing the abnormal vessel enlargement seen in human VM.

We present a detailed protocol to generate a murine xenograft model of venous malformation. This model is based on the subcutaneous injection of patient-derived endothelial cells containing hyper-activating TIE2 and/or PIK3CA gene mutations. Xenograft lesions closely recapitulate the histopathological features of VM patient tissue.

Un modello Xenotranest derivato dal paziente per la malformazione Venosa

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Isolamento di cellule CD133 + staminali del fegato per l&#39;espansione clonale

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video