Supported by APA to RJH, NHMRC program grant 400121 to SP, and NMHRC fellowship 1005050 to SP. CAR acknowledges the support of the ARC (FT0990628) and the DOWD fellowship scheme. The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health is supported by Victorian State Government infrastructure funds.

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal comitato etico animali Florey Institute. 1. Setup per il taglio Fette cervello <ol><li> Preparare una soluzione di taglio costituito da (mm) 125 colina-Cl, 2,5 KCl, CaCl 2 0.4, 6 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20 D-glucosio saturata con gas CarboGen (95% O 2 -5 % 2 CO) e un liquido cerebrospinale artificiale (soluzione aCSF) registrazione composto (mM) 125 NaCl, KCl 2,5, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 10 D-glucosio, saturata con CarboGen. Posizionare la soluzione di taglio su ghiaccio per mantenere il freddo. </li><li> Congelare circa 400 ml della soluzione di taglio e si fondono insieme con 100 ml di soluzione di taglio scongelato per creare una sospensione di ghiaccio. Bubble con CarboGen (95% O 2 -5% CO 2) ad una portata di circa 0,5 L / min attraverso piccoli ctubi Aliber o vetro sinterizzato per produrre un flusso costante ma gentile di bolle. </li><li> Preparare un becher da 250 ml con un inserto in maglia di nylon sollevata in cui verranno inseriti le fette di cervello. Riempire con aCSF per coprire la rete da circa 2 cm e bolla con CarboGen, assicurando che le bolle non disturbare direttamente l&#39;area della sezione possesso. E &#39;anche importante che non ci siano bolle d&#39;aria nel rete di nylon, così se presenti rimuoverli. Questo sarà camera di raccolta e si mantiene a RT (20 - 25 ° C). </li><li> Layout La strumenti sezionare tra cui un grosso paio di forbici, un piccolo paio di forbici, piccoli e grandi micro spatole, e grandi e piccole coppie di pinze e raffreddare su ghiaccio. Posizionare il blocco vibratome tessuto taglio sul ghiaccio su un quadrato di carta stagnola. Ottenere 2 pezzi di 6 cm carta filtro, una lama ad archetto, e un becher da 25 ml riempito con l&#39;impasto soluzione di taglio pure. </li><li> Riempire un secondo contenitore con ghiaccio, e c&#39;era un pezzo di tessuto paper sul ghiaccio e collocare un piatto di coltura di 12 cm da cima. Riempire il piatto cultura con taglio soluzione liquami ghiaccio e bolla con CarboGen. Questo è il contenitore in cui con essere eseguita la dissezione cerebrale. </li><li> Preparare il vibratome. Rimuovere un doppio lama di rasoio taglio fresco (usare una lama fresca ogni volta) dal suo involucro e spruzzare con l&#39;80% di etanolo acqua poi deionizzata. Tagliare a 3 ml pipetta di plastica al punto in cui inizia a cono. Questo verrà utilizzato per trasferire fettine cerebrali. Bend un ago G 27 alla base di circa 45 ° e legarsi a una siringa da 1 ml. Questo sarà usato per manipolare fette durante il taglio. </li></ol> 2. Taglio cervello Slices <ol><li> Anestetizzare un topo (P16 - P18) con il 2% isoflurano o un metodo approvato a livello locale. Dopo l&#39;induzione, decapitare il animale con un grosso paio di forbici e cadere la testa nel piatto cultura 12 centimetri che contiene bollito soluzione di taglio liquami. La sospensione deve immergere totalmente la testa perraffreddamento rapido. </li><li> Tenere la parte anteriore della testa con una mano peeling la pelle e il tessuto connettivo in avanti verso il naso. Utilizzando le piccole forbici tagliate il tessuto connettivo per rivelare il teschio sottostante. Quindi rimuovere i muscoli sovrastanti parte dorsale del cranio e del collo. </li><li> Rimuovere il cervello dal cranio dapprima fissare la parte anteriore del cranio con le pinze grandi e quindi fare due tagli laterali attraverso l&#39;osso entrambi i lati del foro occipitale utilizzando le forbici piccole (Figura 1, tagli etichettati A1 e A2). <ol><li> Fare un altro taglio tra gli occhi (solo anteriore del bregma) (Figura 1, taglio etichetta B) poi accuratamente tagliare lungo la sutura sagittale anteriormente e riflettere le sezioni di taglio del cranio per rivelare il cervello (Figura 1, taglio C marcato). </li><li> Utilizzare la piccola spatola per scavare il cervello e posto su un piatto di coltura. Siate consapevoli del crannervi IAL sulla faccia inferiore del cervello che dovranno essere tagliati, questo può essere fatto utilizzando la dimensione micro spatola più piccoli. Uso spatola il più grande trasferimento cervello al bicchiere da 25 ml riempito con il liquame soluzione di taglio. </li></ol></li><li> Preparare l&#39;emisfero cerebrale per affettare. <ol><li> Posizionare un pezzo di carta da filtro 6 cm sul fondo di un piatto di coltura fresco quindi riempire con soluzione di taglio fresco slurry e bolla. Utilizzare la spatola grande per posizionare il cervello, lato ventrale giù, sulla carta da filtro. Prendere un nuovo e pulito lama di rasoio singolo bordo e tagliare il cervello per rimuovere il cervelletto, poi fare un taglio lungo la linea di metà di separare il cervello in due emisferi. </li></ol></li><li> Preparazione del blocco dei tessuti vibratome. <ol><li> Prendete il blocco dei tessuti vibratome refrigerati, asciugare la superficie, e una goccia di colla cianoacrilato in mezzo e diffondere in modo uniforme la dimensione approssimativa del cervello. Utilizzare la piccola spatola per manipolare uno deiemisferi cerebrali sul grande micro spatola in modo che il lato mediale del cervello è giù. </li><li> Toccare il bordo della spatola all&#39;interfaccia del cervello sul secondo pezzo di carta da filtro per rimuovere la maggior quantità della soluzione possibile. Far scorrere il cervello al largo delle spatola di grosse dimensioni con la spatola più piccolo per guidarla sulla colla. </li><li> Fissare il blocco di taglio nella camera vibratome e riempire la camera con soluzione di taglio liquami e bolla, assicurando il cervello è completamente immersa. Ruotare il blocco di taglio in modo che il lato ventrale del cervello si trova ad affrontare la lama. </li></ol></li><li> Affettare il cervello. Nota: Ogni vibratome è unica in modo da seguire le istruzioni del produttore. <ol><li> Impostare lo spessore della fetta a 450 micron, e di garantire la lama vibra mentre si muove attraverso il cervello ad una velocità di circa 0,3 mm / s. Tagliare interamente attraverso il cervello dal lato ventrale di superficie corticale, questo produrrà intero cervello fette sagittali che possono Be utilizzato per le registrazioni elettrofisiologiche. Fette saranno prodotti lateralmente medialmente e tipicamente 3 - 4 fette possono essere tagliati da ciascun emisfero. </li><li> Se la base della fetta ascensori utilizzare il piegato 27 ago G di stampa dolce fetta indietro. Poiché ogni fetta viene tagliata, utilizzare la pipetta di trasferimento per spostarlo sulla piattaforma nella camera di tenuta dove sono vitali per un massimo di 8 ore. </li></ol></li></ol> 3. extracellulari Elettrofisiologia Recordings <ol><li> Montaggio fetta nella camera di registrazione. <ol><li> Usando la pipetta di trasferimento, posizionare una fetta cervello in una camera di registrazione sommerso perfuso con aCSF scorre a 1 - 2 ml / min e riscaldata a 32 ° C. Il aCSF utilizzato per le registrazioni differisce da quella nella camera di tenuta come la concentrazione di Mg 2+ è aumentato da 2 mM a 4 mM. </li><li> Fissare la fetta con un &quot;arpa&quot; (acciaio inox semi circolare con fili di nylon tesi attraverso a 2-3 mm di distanza). Luogol&#39;arpa in modo che i fili paralleli a CA1. Aumentare la velocità di perfusione a 8 - 10 ml / min a 32 ° C. </li></ol></li><li> Sotto un microscopio da dissezione posto un elettrodo stimolante e un elettrodo di registrazione (elettrodo di vetro riempita con la soluzione di registrazione aCSF) sulla superficie del radiatum strato della CA1 (Figura 2A). Posizionare l&#39;elettrodo stimolante prima poi posto l&#39;elettrodo di registrazione. </li><li> Stimolare la Schaffer dei collaterali con un 120 - 150 μA di ampiezza e 0,1 msec impulso di prova della durata e osservare il conseguente campo posta eccitatorio sinaptica potenziale (fEPSP) forma d&#39;onda per determinare la salute fetta (Figura 2B). Gli elettrodi stimolanti e di registrazione possono avere bisogno di essere spostato nella fetta di circa 50 - 100 micron dalla superficie fetta di ottenere la registrazione di un fEPSP con una piccola fibra volley e grande ampiezza. La garanzia Schaffer evocato fEPSPs sono stereotipati e di fornire un buon indicatore della salute fetta. HEalthy fette mostrano tipicamente una fibra volley per fEPSP rapporto di ampiezza inferiore a 0,3. </li><li> Riposizionamento gli elettrodi. <ol><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, spostare l&#39;elettrodo stimolante mezzo delle oriens falda e spostare l&#39;elettrodo di registrazione per lo strato di cellule piramidali più vicino all&#39;elettrodo di registrazione come possibile, come mostrato nella Figura 3A. Gli elettrodi stimolanti e registrazione possono dover essere spinto nella fetta di circa 50 - 100 micron in modo che la risposta di ampiezza fEPSP al 120 - 150 μA impulso di prova è di circa 1 mV. </li></ol></li><li> Generazione di oscillazioni γ. <ol><li> Per generare oscillazioni γ stimolano il tessuto con un treno di 20 x 0,1 impulsi msec erogati a 200 Hz. Questo stimolo tetanica può produrre risposte riproducibili al momento della consegna ogni 5 minuti. </li></ol></li><li> Utilizzare i seguenti parametri di registrazione. <ol><li> Scala il guadagno del segnale di uscita in modo che corrisponda alla tensione di ingressoil convertitore analogico-digitale. Assicurarsi che escursione segnale massimo previsto utilizza un minimo di 30% della tensione di ingresso. Fare attenzione quando si imposta guadagni per alta come segnali potrebbero tagliare. La larghezza di banda di riferimento necessario per le registrazioni sul campo è di 500 Hz con accoppiamento AC a 0,1 Hz per eliminare la deriva della linea di base. </li><li> Digitalizzare almeno 4 - 5 volte più veloce della frequenza di taglio del filtro passa basso per evitare segnale aliasing. </li></ol></li><li> Analisi dei dati. <ol><li> Dati filtro passa alto a 5 Hz a rimuovere eventuali spostamenti della linea di base. Identificare picchi utilizzando una soglia derivato, con una distanza minima evento di 10 msec, un tempo tipico evento di picco e l&#39;intervallo di regressione di 7 ms, una soglia di ~ 100 mV / msec, e una valle separazione del 100%. Calcolare la latenza come il tempo impiegato per il primo picco identificato si verifichi dopo la fine del manufatto stimolazione. Questa analisi consente per la caratterizzazione del numero di picchi, latenza intervallo inter-evento, e la durata calcolata comesegue: </li><li> Calcolare il numero di picchi come il numero totale di punte per oscillazione per ogni scansione è determinato. </li><li> Calcolare la latenza di oscillazione. Per ogni oscillazione, sottrarre il tempo del primo picco identificato dalla fine del manufatto stimolazione. </li><li> Calcola l&#39;intervallo di inter-evento media (ISI). Determinare il periodo di tempo tra più picchi rilevati e media. </li><li> Calcolare la durata di oscillazione. Misurare il tempo tra il primo e l&#39;ultimo picco rilevato all&#39;interno di ogni oscillazione. </li></ol></li></ol>

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Neurophysiol. 85 (5), 2063-2069 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un metodo robusto per generare CA1 oscillazioni γ in fettine di cervello acuto è descritto. Le oscillazioni generate nascono da un circuito locale consente una migliore opportunità per il controllo e la comprensione della basi neurofisiologiche delle oscillazioni di rete 12. Recettori AMPA, recettori GABA A, I h e T-tipo Ca 2+ canali sono tutti necessari per oscillazioni γ in questo modello. Mentre le oscillazioni locali CA1 qui descritte possono essere generati robusto questo dipende garantire che le sezioni di cervello sono sani. Un passo fondamentale è rapida rimozione del cervello dal cranio, avendo cura di non penetrare il cervello durante la rimozione e poi la rapida immersione in ghiaccio soluzione fredda. Idealmente il tempo tra decapitazione e la rimozione del cervello dal cranio dovrebbe essere non più di 30 - 60 a sec per preservare la salute fetta 21. Utilizzando stimolazione tetanica oscillazioni locali γ CA1 possono esseregenerato in soluzioni di registrazione fisiologiche standard senza dipendenza da agenti farmacologici. Questo è vantaggioso per la caratterizzazione delle patologie in modelli di malattie quali l&#39;aggiunta di agenti farmacologici può confondere l&#39;interpretazione. Ad esempio, utilizzando questo modello di attività CA1 locali e la sensibilità ai farmaci antiepilettici è stato rafforzato in un modello murino di epilessia genetica umana 22. L&#39;uso di questo modello per studiare l&#39;attività di rete non è limitata a epilessia e può essere facilmente applicato ad altre malattie come il morbo di Alzheimer, l&#39;autismo e la schizofrenia. Mentre agenti farmacologici non sono tenuti a generare oscillazioni locali CA1 sufficiente ossigenazione dei tessuti è, a causa della domanda metabolica della fetta cerebrale 23. Alti tassi di perfusione migliorare ossigeno e pH equilibrio all&#39;interno della fetta creare un ambiente più fisiologico per le fettine di cervello 24,25. Un ulteriore vantaggio di utilizzare stimolazione tetanica al generate oscillazioni di rete è che un disegno sperimentale episodica può essere utilizzato che consente a più pronta la quantificazione dei parametri di attività di rete, come il ritardo di numeri insorgenza, durata e picco, in modo ripetibile. Al contrario, l&#39;attività di rete indotto chimicamente è spontaneo 13,15,16,26-28 e più difficile da quantificare. Stimolazione tetanica, tuttavia, può causare cambiamenti nel recettore NMDA-dipendente plasticità sinaptica, che possono causare cambiamenti dell&#39;attività della rete nel corso del tempo. Per controllare per questo e per consentire la generazione di oscillazione stabile su più stimolazioni tetaniche cambiamenti plasticità può essere limitato da incremento dei livelli di Mg 2+. Sebbene questo protocollo migliora la riproducibilità è opaca a qualsiasi influenza della funzione del recettore NMDA. Camere di registrazione dell&#39;interfaccia possono migliorare la salute fetta, resa migliore rapporto segnale rumore e una stimolazione più focale minore intensità con l&#39;ulteriore vantaggio di artefatti di stimolazione più piccoli. Chambe perforatometodi di registrazione r sarebbe anche migliorare la salute fetta per esperimenti a lungo termine. Usando camere di registrazione matrice di elettrodi micro o la registrazione patch clamp consente ampio campo e la funzione singolo neurone per essere misurata durante le registrazioni di indagare meglio i meccanismi alla base delle oscillazioni γ e il loro impatto sulla funzione di rete più ampio. Incorporazione di sensori di tensione e di calcio, nonché i metodi optogenetic introdurrebbero maggiore flessibilità sperimentale in entrambi i paradigmi di registrazione e stimolanti. Protocolli simili sviluppate per altre regioni del cervello che possono essere più rilevanti per la patologia della malattia in fase di studio. Un uso finale per il protocollo descritto qui può essere per costruire e testare modelli di calcolo di oscillazioni, combinando registrazioni sul campo con gli studi singoli patch clamp neurone e di imaging.

Oscillazioni di rete del cervello si verificano all&#39;interno di bande di frequenza distinte che sono correlate a stati comportamentali. Nei roditori, le oscillazioni θ dell&#39;ippocampo (5-10 Hz) sono osservate durante comportamenti esplorativi 1,2, mentre le oscillazioni γ (20 - 80 Hz) associato con i vari processi cognitivi, tra cui la percezione e l&#39;attenzione 3,4. Attività di rete γ sincrona è anche implicato nella patologia di disturbi come l&#39;epilessia e la schizofrenia 5,6. Ad esempio, le oscillazioni γ si pensa che corrispondono alle aree di corticali focolai epilettici 5,7,8 e potrebbero essere utilizzati come marcatori di pharmacosensitivity o di resistenza, due importanti aree di indagine nel campo della ricerca epilessia 9. La fetta cerebrale dell&#39;ippocampo è un modello che è stato ampiamente utilizzato per studiare l&#39;attività di rete 10-12. Sono stati sviluppati vari protocolli di generare oscillazioni γ in fettine cerebrali che tipicamente involve modulazione farmacologica quali partire Mg 2+, 4 aminopiridina (4AP), bicucullina, e acido kainico 12-17. Carenze di oscillazioni farmacologicamente innescate sono che si verificano casualmente dopo l&#39;applicazione della droga e non sono affidabile generati o stabile nel tempo. Elettricamente attivati ​​oscillazioni γ superare molti di questi problemi e hanno anche il vantaggio di essere temporalmente bloccato all&#39;evento stimolante che consenta la registrazione e l&#39;analisi episodica. Qui un protocollo è descritto per la generazione di oscillazioni CA1 γ fornendo una stimolazione tetanica alle Oriens falda nella fetta dell&#39;ippocampo.

<table><tbody><tr><td>4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z3777</td><td></td></tr><tr><td>Biuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14340</td><td></td></tr><tr><td>6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C127</td><td></td></tr><tr><td>Nickel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266965</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Retigabine</td><td>ChemPacific</td><td>150812-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Choline-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1879-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;bull; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;bull; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Electrode glass</td><td>Harvard Apparatus&amp;nbsp;</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Concentric bipolar stimulating metal electrode&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>CBBPF75</td><td></td></tr><tr><td>Digital Isolator</td><td>Getting Instruments</td><td>Model BJN8-9V1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Model 1800 amplifier</td><td>A-M systems</td><td>Model 1800 amplifier</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Intruments</td><td>NI USB-6211</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of local ca1 &#947; oscillations by tetanic stimulation

Oscillazioni di rete neuronali sono caratteristiche importanti di attività cerebrale in salute e malattia e può essere modulata da una serie di farmaci usati clinicamente. Un protocollo è prevista per generare un modello per studiare oscillazioni CA1 γ (20 - 80 Hz). Queste oscillazioni γ sono stabili per almeno 30 minuti e dipendono attività sinaptica eccitatoria e inibitoria oltre all&#39;attivazione di correnti pacemaker. Oscillazioni Tetanically stimolati hanno una serie di caratteristiche riproducibili e facilmente quantificabili compresi conteggio picco, la durata di oscillazione, la latenza e la frequenza che riporta sullo stato della rete. I vantaggi delle oscillazioni stimolate elettricamente includono stabilità, riproducibilità e acquisizione episodica consentendo robusta caratterizzazione della funzione di rete. Questo modello di CA1 oscillazioni γ può essere usato per studiare i meccanismi cellulari e di indagare in modo sistematico come rete neuronale attività è alterata nella malattia e dalle droghe.Malattia stato farmacologia può essere facilmente integrato con l&#39;uso di sezioni di cervello di modelli animali geneticamente modificati o interventistiche per consentire la selezione di farmaci che colpiscono specificamente meccanismi di malattia.

Stimolazione tetanica dei Oriens falda generato robusti e riproducibili oscillazioni γ (35.4 ± 2.2 Hz), si veda la Figura 3B. Per dimostrare che le oscillazioni sono stati generati all&#39;interno della rete locale, CA1 fattori produttivi da CA3 furono recisi tagliando la fetta della regione CA2 con un&#39;inclinazione 32 ago G. Le proprietà di oscillazione nelle fette del taglio non differivano dalle fette tagliati (p = 0,85; tagliate a fette 6,16 ± 1,1 picchi, n = 6; fette tagliati 5,89 ± 0,8 picchi, n = 6), indicando che le oscillazioni sono generate localmente. Un importante vantaggio di questo metodo è la stabilità di registrazioni. Quando il tetano è stato consegnato a intervalli di 5 min oscillazioni erano stabili per almeno 30 minuti per un dato slice (p = 0,26 per il numero dei picchi a 15 min vs 30 min). Vi è la variabilità fra le fette nel numero totale dei picchi all&#39;interno un&#39;oscillazione e altri parametri. Per dstudi tappeto esperimenti accoppiati può essere fatto in modo che le differenze nelle proprietà di base sono fattori secondari. Per i confronti intra-fetta variabilità può essere un problema e può essere superato da paragoni sufficientemente alimentate. Successivamente, i canali ionici e recettori che sono necessari per la generazione di questi CA1 oscillazioni γ tetanically stimolati sono stati studiati. Blocco farmacologico di α-amino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic acido (AMPA) recettori con 20 mM 6-ciano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) (Figura 4A, B), GABA A recettori con 20 pM bicucullina (Figura 4C), I h corrente con 20 mM 4- (N-etil-N-fenilammino) -1,2-dimetil-6- (metilammino) cloruro pyrimidinium (ZD7288) (Figura 4D), e T-tipo Ca 2+ canali con 100 pM Ni 2+ (Figura 4E) erano ciascuno indipendentemente in grado di ridurre il numero di picchi generati(P &lt;0,05; CNQX n = 6; bicucullina n = 7; ZD7288 n = 6; Ni 2+ n = 6). Applicazione di (2R) -ammino-5-phosphonopentanoate (AP5, 20 micron) non ha modificato il numero di punte (p = 0,22; n = 5; AP5, 5.9 ± 3.1 picchi, il controllo, 8.3 ± 2.2 picchi), suggerendo che recettori NMDA non sono coinvolti nella generazione di oscillazione γ in questa preparazione. Questa preparazione è ideale per determinare l&#39;azione di scalatura rete di farmaci. Retigabina è un usato in clinica farmaco anti-epilettico che apre canali di potassio e riduce di membrana 18-20. Applicazione Bath di retigabina prodotto una riduzione dose-dipendente del numero di picchi e durata dell&#39;oscillazione (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52877/52877fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del cranio e la pelle sovrastante mostra l&#39;ubicazione di tagli di ri<html> vitello cervello. A1, A2, B e C segnano le posizioni dei tagli che devono essere fatti per aprire il cranio per la rimozione del cervello. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52877/52877fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52877/52877fig2.jpg" /> Figura 2. Posizionamento degli elettrodi stimolanti e la registrazione nel CA1 Schaffer dei collaterali per la salute fetta di prova. (A) mostra il posizionamento dell&#39;elettrodo di stimolazione (Stim) e l&#39;elettrodo di registrazione (Rec). (B) un esempio rappresentativo di un fEPSP evocato da 120 μA stimolazione (fibra volley contrassegnati con *). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52877/52877fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una più grande versione di questa figura.</a> jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52877/52877fig3.jpg" /> Figura 3. Configurazione di elettrodi di registrazione e stimolazione utilizzati per evocare l&#39;oscillazione. (A) Posizione degli elettrodi di stimolazione (Stim) nella Oriens di falda e di registrazione degli elettrodi (Rec) nella pyramidale strato della CA1. (B) Un esempio rappresentativo di le oscillazioni γ indotte da stimolazione tetanica (artefatto contrassegnati da &quot;Stim&quot;). Traccia Rappresentante mostrando uscite quantificabili. ISI intervallo inter-spike. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52877/52877fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52877/52877fig4.jpg" /> Figura 4. caratterizzazione farmacologica della gener tetanicallyoscillazioni ATED γ. (A) traccia Rappresentante dimostrare l&#39;effetto di CNQX. Grafici dimostrano l&#39;effetto di (B) CNQX (20 mM; n = 6), (C) bicucullina (20 mM; n = 7), (D) ZD7288 (20 mM; n = 6) e (E) Ni 2+ (100 mM; n = 6) sul numero di picchi. I dati sono presentati come confronti a coppie. * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01 e, *** p &lt;0.001. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52877/52877fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52877/52877fig5.jpg" /> Figura 5. effetti retigabina sulle proprietà di rete. Esempi rappresentativi che mostrano l&#39;attività di rete ridotta di oscillazioni indotte (A) in condizioni di controllo e (B) e &lt;strong&gt; (C) con la retigabina. Sintesi degli effetti apparsi in (D) numero di picco, (E) Durata oscillazione, (F) la latenza per l&#39;insorgenza di oscillazione, e (G) intervallo inter-spike (ISI). I dati sono presentati come confronti a coppie. * P &lt;0.05. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52877/52877fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Oscillazioni sono proprietà di rete fondamentali e sono modulati dalla malattia e la droga. Studiare le oscillazioni cerebrali slice permette la caratterizzazione di reti isolate in condizioni controllate. I protocolli sono forniti per la preparazione di fettine di cervello acuto per evocare CA1 oscillazioni γ.

Generazione di locali oscillazioni CA1 γ di Tetanic Stimolazione

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K Views.  University of Melbourne.  Oscillazioni sono proprietà di rete fondamentali e sono modulati dalla malattia e la droga. Studiare le oscillazioni cerebrali slice permette la caratterizzazione di reti isolate in condizioni controllate. I protocolli sono forniti per la preparazione di fettine di cervello acuto per evocare CA1 oscillazioni γ. 

Video: Generation of Local CA1 γ Oscillations by Tetanic Stimulation

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Ricerca

Neuroscienze

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the centrolateral/parafascicular; Cl/Pf nucleus). The activation of either the PPN or Cl/Pf nuclei in vivo has been described to induce the arousal of the animal and an increment in gamma band activity in the cortical electroencephalogram (EEG). The cellular mechanisms for the generation of gamma band oscillations in Reticular Activating System (RAS) neurons are the same as those found to generate gamma band oscillations in other brains nuclei. During current-clamp recordings of PPN neurons (from parasagittal slices from 9 - 25 day-old rats), the use of depolarizing square steps rapidly activated voltage-dependent potassium channels that prevented PPN neurons from being depolarized beyond -25 mV.
Injecting 1 - 2 sec long depolarizing current ramps gradually depolarized PPN membrane potential resting values towards 0 mV. However, injecting depolarizing square pulses generated gamma-band oscillations of membrane potential that showed to be smaller in amplitude compared to the oscillations generated by ramps. All experiments were performed in the presence of voltage-gated sodium channels and fast synaptic receptors blockers. It has been shown that the activation of high-threshold voltage-dependent calcium channels underlie gamma-band oscillatory activity in PPN neurons. Specific methodological and pharmacological interventions are described here, providing the necessary tools to induce and sustain PPN subthreshold gamma band oscillation in vitro.

The pedunculopontine nucleus (PPN) is located in the brainstem and its neurons are maximally activated during waking and rapid eye movement (REM) sleep brain states. This work describes the experimental approach to record in vitro gamma band subthreshold membrane oscillation in PPN neurons.

Registrazione Gamma banda oscillazioni Pedunculopontine Nucleo neuroni

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent improvements in methodologies and applications for the study of theta oscillations. A simple characterization of the isolated hippocampal preparation is presented whereby the relationship between internal hippocampal theta oscillators is examined together with the activity of pyramidal cells, and GABAergic interneurons, of the cornu ammonis-1 (CA1) and subiculum (SUB) areas. Overall, we show that the isolated hippocampus is capable of generating intrinsic theta oscillations in vitro and that rhythmicity generated within the hippocampus can be precisely manipulated by optogenetic stimulation of parvalbumin-positive (PV) interneurons. The in vitro isolated hippocampal preparation offers a unique opportunity to use simultaneous field and intracellular patch-clamp recordings from visually-identified neurons to better understand the mechanisms underlying theta rhythm generation.

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Here, we present a protocol for recording rhythmic neuronal network theta and gamma oscillations from an isolated whole hippocampal preparation. We describe the experimental steps from extraction of the hippocampus to details of field, unitary and whole-cell patch clamp recordings as well as optogenetic pacing of the theta rhythm.

Tuning nella Banda Theta Ippocampale<em&gt; In vitro</em&gt;: Metodologie per la registrazione dal circuito isolante di roditore Septohippocampal

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

Registrazione spazialmente limitate oscillazioni nell'ippocampo dei topi di comportarsi

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Inducing Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability in Neurons of the Dorsal Lateral Geniculate Nucleus

The dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) has long been held to act as a basic relay for visual information traveling from the retina to cortical areas, but recent findings suggest largely underestimated functional plasticity of dLGN principal cells. However, the cellular mechanisms supporting these changes have not been fully explored. Here, we report a protocol to induce long-term potentiation of intrinsic neuronal excitability (LTP-IE) in dorsal dLGN relay cells from acute brain slices of young rats. Intrinsic plasticity is generally induced in parallel with synaptic plasticity. However, in dLGN neurons, LTP-IE is reliably induced by spiking activity at a frequency of 40 Hz for 10 min. LTP-IE in dLGN relay neurons is long-lasting as it can be followed up to 40 min after the induction protocol. In conclusion, the results of this study provide the first evidence for the induction of intrinsic plasticity in dLGN relay cells, thus further pointing to the role of thalamic neurons in activity-dependent visual plasticity.

Here, we describe a protocol for inducing long-term plasticity of neuronal intrinsic excitability in relay neurons from the dorsal lateral geniculate nucleus maintained in ex vivo brain slices.

The dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) has long been held to act as a basic relay for visual information traveling from the retina to cortical ...

Generation of Spontaneous and On-Demand Ictal Events in Mouse Brain Cortical Slices

Source: Chang, M. et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57952">Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the induction of ictal events in coronal cortical slices from a transgenic mouse expressing light-activated cation channels in cortical excitatory pyramidal neurons. The slice is placed in a recording chamber, and a recording electrode is inserted into the superficial cortical layer. Upon perfusion with a seizure-inducing drug that blocks potassium channels, the neurons become hyperexcitable and generate spontaneous ictal events. To generate on-demand ictal events, a brief light pulse is used to activate the cation channels in pyramidal neurons, triggering the release of excitatory neurotransmitters, which induce the postsynaptic neurons to generate ictal events for a short duration.

Source: Chang, M. et al. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (2019)
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Generating Local Cornu Ammonis 1 (CA1) Gamma Oscillations Using Tetanic Stimulations in a Hippocampal Brain Slice

Source: Hatch, R. J., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52877">Generation of Local Ca1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the procedure of inducing local CA1 gamma oscillations in a CA1 hippocampal mouse brain slice using tetanic simulations. This method is important to understand the neuronal network activity.

Generazione di oscillazioni gamma locali di Cornu ammonis 1 (CA1) utilizzando stimolazioni tetaniche in una fetta di cervello ippocampale

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Setup ...

Neurophysiology

Stimulation and Modulation Techniques

Optogenetic Control of Hippocampal Network Dynamics

Source: Manseau, F., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55851">Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the method to use optogenetics to modulate hippocampal network dynamics by activating genetically modified light-sensitive interneurons in a mouse brain slice, enhancing theta oscillation synchronization and studying neural circuit behavior.

Controllo optogenetico della dinamica della rete ippocampale

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.

	Optogenetic control in the ...