Name: generation of local ca1 γ oscillations by tetanic stimulation
Uploaded: 2015-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Local CA1 ÃŽÂ³ Oscillations by Tetanic Stimulation at JoVE.com

Supported by APA to RJH, NHMRC program grant 400121 to SP, and NMHRC fellowship 1005050 to SP. CAR acknowledges the support of the ARC (FT0990628) and the DOWD fellowship scheme. The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health is supported by Victorian State Government infrastructure funds.

Alle Experimente an Mäusen wurden durch die Florey Institute Tierethikkommission genehmigt. 1. Einrichtung zum Schneiden Hirnschnitten <ol><li> Vorbereitung einer von (mM) 125 Cholin-Cl, 2,5 KCl, 0,4 CaCl 2, 6 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 umfasst Schneidmittel, 20 D-Glucose mit Carbogen Gas (95% O 2 -5 gesättigten % CO 2) und ein künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) Aufnahmelösung (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 enthielt, 10 D-Glucose, mit gesättigter Carbogen. Legen Sie die Schnittlösung auf Eis, um sie kalt zu halten. </li><li> Frieren Sie ca. 400 ml des Schneid Lösung und Mischung zusammen mit 100 ml nicht gefrorenen Schneidelösung, um ein Eisbrei erstellen. Blase mit Carbogen (95% O 2 -5% CO 2) bei einem Fluss von etwa 0,5 L / min durch kleine cAliber Schlauch oder Sinterglas, um einen stetigen, aber sanfte Strömung von Luftblasen zu produzieren. </li><li> Bereiten ein 250 ml Becherglas mit einem erhöhten Nylongewebeeinlage, auf der die Gehirnscheiben platziert wird. Füllen Sie mit aCSF, um das Netz um etwa 2 cm und Blase mit Carbogen abdecken, um sicherzustellen, dass die Blasen nicht unmittelbar die Scheibe Haltebereich stören. Es ist auch wichtig, dass sich keine Luftblasen in der Nylon-Mesh, also, wenn irgendeine vorhanden entfernen. Dies wird die Haltekammer und bei RT gehalten (20 - 25 ° C). </li><li> Layout Das Sezieren Instrumente, darunter eine große Schere, eine kleine Schere, kleine und große Mikro Spatel, und große und kleine Paare von Zangen und entspannen sie auf Eis. Legen Sie die Vibratom Gewebeschneiden Block auf Eis auf einem quadratischen Aluminiumfolie. Erhalten 2 Stück 6 cm Filterpapier, eine einzige Rasierklinge und einem 25-ml-Becher mit dem Schneid Lösungsaufschlämmung gefüllt als auch. </li><li> Füllen Sie einen zweiten Behälter mit Eis, und legen ein Stück Gewebe paper auf dem Eis und legen Sie eine 12 cm Kulturschale an der Spitze. Füllen Sie die Kulturschale mit Schnittlösung Eisbrei und Blase mit Carbogen. Dies ist der Container, in dem das Gehirn Dissektion durchgeführt werden. </li><li> Bereiten Sie die Vibratom. Entfernen Sie einen neuen zweischneidiges Rasierklinge (verwenden Sie eine frische Klinge jedes Mal) aus der Verpackung und Spray mit 80% Ethanol dann deionisiertes Wasser. Schneiden Sie ein 3-ml-Plastiktransferpipette an dem Punkt, wo es beginnt zu verjüngen. Dies wird verwendet, um Gehirnscheiben zu übertragen. Biege einen 27 G-Nadel an der Basis etwa 45 ° und heften sich an einer 1 ml-Spritze. Dies wird verwendet, um Scheiben beim Schneiden zu manipulieren. </li></ol> 2. Schneiden Hirnschnitten <ol><li> Betäuben eine Maus (P16 - P18) mit 2% Isofluran oder einer lokal zugelassenen Methode. Nach der Induktion, enthaupten, das Tier mit einem großen Schere und Tropfen den Kopf in den 12 cm Kulturschale, die mit Bläschen Schneid Lösungsaufschlämmung enthält. Der Schlamm muss völlig den Kopf eintauchen fürschnelle Abkühlung. </li><li> Halten Sie die Vorderseite des Kopfes mit einer Hand Peeling die Haut und Bindegewebe nach vorn in Richtung der Nase. Mit den kleinen Schere das Bindegewebe die zugrunde liegende Schädel zu offenbaren. Dann entfernen Sie die Muskeln überlagert dorsalen Aspekt der Schädel und Hals. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel durch erste Sicherung der Vorderseite des Schädel mit den großen Zange und dann zwei seitliche Schnitte durch den Knochen auf beiden Seiten des Foramen magnum mit den kleinen Schere (Abbildung 1, Schnitte mit A1 und A2). <ol><li> Eine weitere Schnitt zwischen den Augen (nur Front des Bregma) (Abbildung 1, geschnitten mit B) vorsichtig entlang der Pfeilnaht geschnitten vorne und beziehen sich auf die Schnittschädelabschnitte, um das Gehirn (Abbildung 1, schneiden markierten C) zu offenbaren. </li><li> Verwenden Sie den kleinen Spatel, um auf einer Kulturschale schaufelt aus dem Gehirn und den Ort. Seien Sie sich der cranial Nerven auf dem Unterrand des Gehirns die müssen getrennt werden, kann dies unter Verwendung der kleineren Mikro Spachtel erfolgen. Mit den größeren Spachtel übertragen das Gehirn, um die 25-ml-Becher mit dem Schneid Lösungsaufschlämmung gefüllt. </li></ol></li><li> Vorbereiten des Gehirnhälfte zum Schneiden. <ol><li> Legen Sie ein Stück der 6 cm Filterpapier in den Boden einer frischen Kulturschale dann mit frischen Schnitt Lösungsaufschlämmung und Blase zu füllen. Verwenden Sie den größeren Spachtel, um das Gehirn, Bauchseite nach unten zu positionieren, auf das Filterpapier. Nehmen Sie eine neue und gereinigt einzigen Rasierklinge und schneiden Sie das Gehirn, um das Kleinhirn zu entfernen, dann ein Schnitt entlang der Mittellinie, um das Gehirn in zwei Hemisphären zu trennen. </li></ol></li><li> Vorbereiten des Vibratom Gewebeblock. <ol><li> Nehmen Sie die gekühlte Vibratom Gewebeblock, trocknen Sie die Oberfläche, und einen Tropfen Sekundenkleber in der Mitte und gleichmäßig verteilt auf die ungefähre Größe des Gehirns. Verwenden Sie den kleinen Spatel zu einem der ManipulationGehirnhälften auf die große Mikro Spatel so dass die mediale Seite des Gehirns ab. </li><li> Berührt die Kante der Spatel an der Grenzfläche des Gehirns auf dem zweiten Stück Filterpapier, um so viel von der Lösung, wie möglich zu entfernen. Schieben des Gehirns abseits grosser Spatel unter Verwendung der kleineren Spatel, um es auf den Leim zu führen. </li><li> Sichern Sie den Schneideblock in die Vibratom Kammer und füllen Sie die Kammer mit Schneid Lösungsaufschlämmung und Blase, wodurch das Gehirn vollständig eingetaucht ist. Drehen Sie den Schneideblock, so dass die Bauchseite des Gehirns wird die Klinge gegenüber. </li></ol></li><li> Schneiden des Gehirns. Hinweis: Jeder Vibratom ist einzigartig, so folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Stellen Sie die Scheibendicke zu 450 &amp; mgr; m, und sicherzustellen, dass die Klinge schwingt, wie es durch das Gehirn bewegt sich mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,3 mm / s. Vollständig durch das Gehirn von der Bauchseite zu der kortikalen Oberfläche schneiden, wird diese ganze Gehirn sagittal, die B produzierene für elektrophysiologischen Ableitungen verwendet. Slices werden seitlich an medial produziert werden und in der Regel 3-4 Scheiben können aus jeder Hemisphäre abgeschnitten werden. </li><li> Wenn die Basis der Scheibe Aufzüge benutzen Sie den gebogenen 27 G Nadel sanft drücken Sie die Scheibe wieder nach unten. Da jede Scheibe geschnitten wird, verwenden Sie die Transferpipette, um es auf die Plattform in der Haltekammer, wo sie lebensfähig für bis zu 8 Stunden sind zu bewegen. </li></ol></li></ol> 3. Extrazelluläre Elektrophysiologie Recordings <ol><li> Montage der Scheibe in der Aufnahme Kammer. <ol><li> Unter Verwendung der Transferpipette, legen Sie einen Hirnschnitt in einem untergetauchten Aufnahme Kammer mit aCSF in 1 fließt perfundiert - 2 ml / min und 32 ° C erhitzt. Das für Aufzeichnungen verwendet aCSF unterscheidet sich von der in der Haltekammer wie der Mg 2+ -Konzentration von 2 bis 4 mm vergrößert. </li><li> Befestigen Sie die Scheibe mit einem &quot;Harfe&quot; (halbkreisförmige Edelstahl mit Nylon-Stränge an erstreckte sich über 2 - 3 mm Abstand). Platzdie Harfe so dass die Stränge parallel laufen zu CA1. Erhöhen die Geschwindigkeit der Perfusion zum 8 - 10 ml / min bei 32 ° C. </li></ol></li><li> Unter einem Präpariermikroskop Ort eine Stimulationselektrode und eine Aufzeichnungselektrode (Glaselektrode mit der Aufzeichnungslösung gefüllte aCSF) auf der Oberfläche des Stratum radiatum von CA1 (2A). Setzen Sie den ersten Stimulationselektrode dann die Aufzeichnungselektrode. </li><li> Stimulieren die Schaffer-Kollateralen mit 120-150 &amp; mgr; A Amplitude und 0,1 ms Dauer Testimpuls und beobachten Sie die resultierende Feld exzitatorischen postsynaptischen Potentials (fEPSP) Wellenform zu bestimmen, slice Gesundheit (2B). Die anregenden und Aufzeichnungselektroden müssen möglicherweise in die Scheibe bewegt werden etwa 50 bis 100 &amp; mgr; m von der Scheibenoberfläche ein fEPSP Aufnahme mit einer kleinen Faser volley und großer Amplitude zu erhalten. Der Schaffer Sicherheiten evozierte fEPSPs sind stereotype und ein guter Indikator für die Gesundheit Scheibe. HEalthy Scheiben zeigen typischerweise einen Faser volley zum Amplitudenverhältnis von weniger als 0,3 fEPSP. </li><li> Neupositionierung der Elektroden. <ol><li> Verwendung eines Seziermikroskops Bewegen der Stimulationselektrode zu der Mitte der Schicht oriens und bewegen die Aufzeichnungselektrode auf den pyramidalen Zellschicht so nahe an die Aufzeichnungselektrode wie möglich, wie in 3A gezeigt. Die anregenden und Aufzeichnungselektroden müssen möglicherweise in die Scheibe gedrückt werden etwa 50 bis 100 &amp; mgr; m, so dass die fEPSP Antwortamplitude in die 120-150 uA Testimpuls ist ungefähr 1 mV. </li></ol></li><li> Erzeugen γ Schwingungen. <ol><li> So generieren γ Schwingungen stimulieren das Gewebe mit einem Zug von 20 x 0,1 bei 200 Hz geliefert msec Pulse. Diese tetanischen Stimulus können reproduzierbare Reaktionen ergeben bei Auslieferung alle 5 min. </li></ol></li><li> Verwenden Sie die folgenden Aufnahmeparameter. <ol><li> Skalieren Sie die Verstärkung des Ausgangssignals, um den Eingangsspannungsbereich entsprechenDer Analog-Digital-Wandler. Sicherzustellen, dass die maximale erwartete Signal Exkursion wird ein Minimum von 30% der Eingangsspannungsbereich. Seien Sie vorsichtig bei der Einstellung Gewinne zu hoch wie Signale könnten Clip. Die typische Bandbreite für Feldaufnahmen gebraucht wird, ist 500 Hz bei AC-Kopplung bei 0,1 Hz, um Basisliniendrift zu entfernen. </li><li> Digitalisieren mindestens 4-5 mal schneller als die Eckfrequenz des Tiefpassfilters, um Signal Aliasing zu vermeiden. </li></ol></li><li> Datenanalyse. <ol><li> Hochpassfilter Daten bei 5 Hz, alle Grundlinie verschiebt sich zu entfernen. Identifizieren Spikes mit einem Derivat Schwelle mit einer Mindest Ereignis Trennung von 10 ms, ein typisches Ereigniszeit zu Spitze und Regressions Intervall von 7 ms ein Schwellenwert von ~ 100 mV / msec und einer Trenn Tal von 100%. Berechnen Latenz die Zeit für den ersten identifizierten Spike ergriffen werden, um nach dem Ende des Stimulationsartefakt auf. Diese Analyse ermöglicht die Charakterisierung der Anzahl von Spikes, Latenz, inter-Ereignisintervall und die Dauer berechnet alsfolgt: </li><li> Berechnung der Anzahl der Spitzen als die Gesamtzahl der Spitzen pro Schwingung für jeden Durchlauf bestimmt. </li><li> Berechnen Sie die Schwingungs Latenz. Für jede Schwingung, subtrahieren die Zeit des ersten identifizierten Spitze vom Ende des Stimulationsartefakt. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche inter-Ereignis-Intervall (ISI). Bestimmen Sie die Zeitdauer zwischen mehreren erfassten Spitzen und Durchschnitt. </li><li> Berechnen Sie die Schwingungsdauer. Messen Sie die Zeit zwischen dem ersten und letzten erkannten Spitze innerhalb jeder Schwingung. </li></ol></li></ol>

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Neurophysiol. 85 (5), 2063-2069 (2001).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Eine robuste Methode, um CA1 γ Schwingungen in akuten Hirnschnitten zu erzeugen, beschrieben. Die erzeugten Schwingungen ergeben sich aus einer lokalen Schaltung ermöglicht eine bessere Gelegenheit für die Steuerung und das Verständnis der neurophysiologischen Grundlagen der Netzwerkschwingungen 12. AMPA-Rezeptoren, GABA A -Rezeptoren, I h und T-Typ Ca2 + -Kanäle sind alle für γ Schwingungen in diesem Modell erforderlich. Während die lokalen hier beschriebenen CA1 Schwingungen robust generiert dies ist zu gewährleisten, dass die Hirnschnitten sind gesund. Ein entscheidender Schritt ist eine schnelle Entfernung des Gehirns aus dem Schädel, kümmert sich um das Gehirn während der Entfernung und dann schnelle Eintauchen in eiskalten Lösung nicht durchdringen. 60 Sek 21 Stück Gesundheit zu erhalten - im Idealfall die Zeit zwischen Enthauptung und Entfernung des Gehirns aus dem Schädel sollte nicht mehr als 30 sein. Durch die Verwendung von tetanischen Stimulation lokale CA1 γ Schwingungen seinin physiologischen Standardaufzeichnungslösungen, ohne die Abhängigkeit von pharmakologischen Mitteln erzeugt. Dies ist zur Charakterisierung von Pathologien in Krankheitsmodellen, wo Zugabe von pharmakologischen Mitteln kann Auslegung verwechseln vorteilhaft. Zum Beispiel mit diesem Modell lokalen CA1 Aktivität und Empfindlichkeit gegenüber Antiepileptika wurde in einem Mausmodell der humangenetischen Epilepsie 22 verbessert. Die Verwendung dieses Modells, um die Netzwerkaktivität zu untersuchen, ist nicht beschränkt, um Epilepsie und kann leicht auf andere Krankheiten, wie Alzheimer-Krankheit, Autismus und Schizophrenie eingesetzt werden. Während pharmakologische Mittel sind nicht erforderlich, um die lokalen CA1 Schwingungen ausreichende Sauerstoffversorgung des Gewebes ist, erzeugen aufgrund der Stoffwechselbedarf des Gehirns Scheibe 23. Hohe Perfusionsraten verbessern Sauerstoff und pH-Balance innerhalb der Scheibe Schaffung einer physiologischen Umgebung für die Hirnschnitten 24,25. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von tetanischen Stimulation Generate Netzwerk-Oszillationen ist, dass eine episodische experimentellen Design verwendet werden, die mehr bereit Quantifizierung von Netzwerkaktivität Parameter wie Verzögerungs zu Beginn, Dauer und Spike-Nummern ermöglicht, in einer wiederholbaren Weise. Im Gegensatz dazu ist chemisch induzierte Netzaktivität spontane 13,15,16,26-28 und schwieriger zu quantifizieren. Tetanische Stimulation, jedoch können Änderungen der NMDA-Rezeptor-abhängige synaptischen Plastizität, die Veränderungen in der Netzwerkaktivität über der Zeit verursachen kann. Um dies zu kontrollieren und ermöglichen stabile Schwingung Generation über mehrere tetanische Stimulationen Plastizitätsänderungen können durch Erhöhung Mg 2+ Ebenen beschränkt. Obwohl dieses Protokoll verbessert die Reproduzierbarkeit ist es undurchsichtig zu jeder Einfluss von NMDA-Rezeptorfunktion. Interface Aufnahmekammern slice Gesundheit zu verbessern, zu besseren Signal-Rausch-Verhältnis und mehr Brenn geringere Intensität der Stimulation mit dem zusätzlichen Vorteil der kleineren Stimulationsartefakten. Perforierte chamber Aufzeichnungsverfahren würde auch zur Verbesserung der Gesundheit Scheibe für Langzeitexperimente. Verwendung von Mikroelektrodenarrays Aufnahmekammern oder Patch-Clamp-Aufzeichnung ermöglicht weites Feld und einziges Neuron-Funktion, um während der Aufnahmen gemessen werden, um besser zu untersuchen Mechanismen, die γ Schwingungen und deren Auswirkungen auf breitere Netzwerkfunktion werden. Einbau von Spannung und Calciumsensoren sowie optogenetischen Methoden würden zusätzliche experimentelle Flexibilität bei Aufnahme und Stimulierung Paradigmen einzuführen. Ähnliche Protokolle für andere Hirnregionen, die mehr relevant für die Krankheitspathologie untersucht werden können entwickelt. Eine endgültige Verwendung für das Protokoll zu beschreiben hier kann zum Erstellen und Testen Berechnungsmodelle von Schwingungen durch die Kombination von Feldaufnahmen mit einzelnen Neurons Patch-Clamp-und Imaging-Studien.

Gehirn-Netzwerk-Oszillationen treten in unterschiedlichen Frequenzbändern, die zu Verhaltenszustände zu korrelieren. Bei Nagetieren Hippocampus θ Schwingungen - werden (5 10 Hz) während der Sondierungs Verhaltensweisen 1,2 beobachtet, während γ Schwingungen (20 - 80 Hz) assoziieren mit verschiedenen kognitiven Prozesse, einschließlich der Wahrnehmung und Aufmerksamkeit 3,4. Synchron γ Netzwerkaktivität wird auch in der Pathologie von Erkrankungen wie Epilepsie und Schizophrenie 5,6 gebracht. Beispielsweise sind γ Schwingungen gedacht, um Bereiche der kortikalen Epilepsieherden 5,7,8 entsprechen und könnte als Marker der pharmacosensitivity oder Widerstands zwei wichtige Untersuchungsbereiche in Epilepsieforschung 9 verwendet werden. Der Hippocampus Hirnschnitt ist ein Modell, das in großem Umfang verwendet wurde, um die Netzwerkaktivität 10-12 zu untersuchen. Verschiedene Protokolle wurden entwickelt, um γ Schwingungen in Hirnschnitten, die typischerweise erzeugen involve pharmakologischen Modulation, wie niedrige Mg 2+, 4-Aminopyridin (4AP) Bicucullin und Kainsäure 12-17. Mängel der pharmakologisch ausgelöst Schwingungen sind, dass sie nach dem Zufallsprinzip nach der Arzneimittelanwendung auftreten und werden nicht zuverlässig erzeugt oder über die Zeit stabil. Elektrisch ausgelöst γ Schwingungen zu überwinden viele dieser Probleme und haben auch den Vorteil, zeitlich auf die anregende Veranstaltung so dass für episodische Aufzeichnung und Analyse gesperrt. Hier ein Protokoll zur Erzeugung von CA1 γ Schwingungen durch die Bereitstellung einer tetanischen Stimulation, um das Stratum oriens im Hippocampus Scheibe beschrieben.

<table><tbody><tr><td>4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z3777</td><td></td></tr><tr><td>Biuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14340</td><td></td></tr><tr><td>6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C127</td><td></td></tr><tr><td>Nickel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266965</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Retigabine</td><td>ChemPacific</td><td>150812-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Choline-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1879-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;bull; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;bull; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Electrode glass</td><td>Harvard Apparatus&amp;nbsp;</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Concentric bipolar stimulating metal electrode&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>CBBPF75</td><td></td></tr><tr><td>Digital Isolator</td><td>Getting Instruments</td><td>Model BJN8-9V1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Model 1800 amplifier</td><td>A-M systems</td><td>Model 1800 amplifier</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Intruments</td><td>NI USB-6211</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of local ca1 &#947; oscillations by tetanic stimulation

Neuronale Netzwerk-Oszillationen sind wichtige Merkmale der Hirnaktivität in Gesundheit und Krankheit und kann durch eine Reihe von klinisch verwendeten Medikamente moduliert werden. Ein Protokoll ist vorgesehen, um ein Modell zur Untersuchung von CA1 γ Schwingungserzeugung (20 - 80 Hz). Diese γ Schwingungen sind stabil für mindestens 30 min und hängen von exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Aktivität zusätzlich zur Aktivierung des Schrittmacherströme. Tetanically stimuliert Oszillationen haben eine Anzahl von reproduzierbaren und leicht quantifizierbar Eigenschaften einschließlich Spikezahl, Schwingungsdauer, Latenz und Frequenz, die von der Netzwerkstatus zu melden. Die Vorteile der elektrisch stimuliert Schwingungen zählen Stabilität, Reproduzierbarkeit und episodischen Akquisition ermöglicht robuste Charakterisierung der Netzwerkfunktion. Dieses Modell der CA1 γ Schwingungen verwendet werden, um zelluläre Mechanismen zu studieren und systematisch zu untersuchen, wie die neuronale Netzwerkaktivität in Krankheit und durch Medikamente verändert werden.Krankheitszustand Pharmakologie kann leicht durch den Einsatz von Gehirnschnitten, die aus genetisch veränderten oder interventionelle Tiermodellen eingebaut werden, um die Auswahl von Wirkstoffen, die spezifisch auf Krankheitsmechanismen zu aktivieren.

Tetanische Stimulation der Stratum oriens erzeugt robuste und reproduzierbare γ Schwingungen (35,4 ± 2,2 Hz), siehe Abbildung 3B. Um zu demonstrieren, dass die Schwingungen wurden innerhalb des lokalen Netzwerks CA1 die Eingänge von CA3 wurden, indem die Scheibe in der CA2 Region mit einem gebogenen 32 G Nadel getrennt erzeugt. Die Schwingungseigenschaften in den geschnittenen Scheiben nicht von den unbeschnittenen Scheiben unterscheiden (p = 0,85; geschnittenen Scheiben 6,16 ± 1,1 Spitzen, n = 6; uncut Scheiben 5,89 ± 0,8 Spikes, n = 6), was darauf hinweist, dass die Schwingungen werden vor Ort erzeugt. Ein wichtiger Vorteil dieses Verfahrens ist die Stabilität der Aufnahmen. Wenn das Tetanus wurde bei 5-Minuten-Intervallen zuge die Schwingungen wurden für mindestens 30 min für eine gegebene Scheibe (p = 0,26 für die Anzahl der Spikes bei 15 min gegenüber 30 min) stabil. Besteht Variabilität zwischen den Schnitten in der Gesamtzahl der Spitzen in einem Schwingungs und andere Parameter. Für dTeppich Studien gepaart Experimente durchgeführt werden kann, so dass Unterschiede in der Baseline-Objekte sind kleinere Faktoren. Für den inner Scheibe Vergleiche Variabilität kann ein Anliegen sein und kann durch ausreichend Speisung Vergleiche überwunden werden. Als nächstes wurden die Ionenkanälen und Rezeptoren, die für die Erzeugung dieser tetanically stimuliert CA1 γ Schwingungen benötigt werden untersucht. Pharmakologische Blockade von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) -Rezeptoren mit 20 uM 6-Cyano-7-nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX) (4A, B), GABA A-Rezeptoren mit 20 uM Bicucullin (4C), I h Strom mit 20 uM 4- (N-Ethyl-N-phenylamino) -1,2-Dimethyl-6- (methylamino) pyrimidinium Chlorid (ZD7288) (4D), und T-Typ-Ca 2+ -Kanälen mit 100 &amp; mgr; M Ni 2+ (4E) jeweils unabhängig in der Lage, die Anzahl von Spitzen erzeugt reduzieren(P &lt;0,05; n = 6 CNQX; Bicucullin n = 7; ZD7288 n = 6; Ni 2+ n = 6). Anwendung von (2R) -Amino-5-phosphonopentanoate (AP5, 20 uM) hatte keinen Einfluss auf die Zahl der Spitzen (p = 0,22; n = 5; AP5, 5,9 ± 3,1 Spikes, Kontrolle, 8,3 ± 2,2 Spitzen), was darauf hindeutet, dass NMDA-Rezeptoren sind nicht γ Schwingungserzeugung in dieser Zubereitung beteiligt. Dieses Präparat ist ideal für die Bestimmung der Netzwerk Skala Wirkung von Drogen. Retigabin ist ein klinisch genutzt Antiepileptikum, die Kaliumkanäle öffnet und reduziert Membran Erregbarkeit 18-20. Badanwendung Retigabin eine dosisabhängige Reduzierung der Anzahl von Spikes in und der Dauer der Oszillation (Abbildung 5). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52877/52877fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische des Schädels und die darüber liegenden Haut, die Lage der Schnitte neu<html> Kalbfleisch das Gehirn. A1, A2, B und C kennzeichnen die Positionen der Schnitte, die vorgenommen werden, um die Öffnung des Schädels für die Entfernung des Gehirns müssen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52877/52877fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52877/52877fig2.jpg" /> Abbildung 2. Platzierung der anregenden und Aufzeichnungselektroden in der CA1 Schaffer-Kollateralen zu Testscheibe Gesundheit. (A) zeigt die Platzierung der Stimulationselektrode (Stim) und der Aufzeichnungselektrode (Rec). (B) Ein repräsentatives Beispiel eines fEPSP durch ein 120 &amp; mgr; A-Stimulation (Faser volley mit * gekennzeichneten) hervorgerufen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52877/52877fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern Version dieser Figur.</a> jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52877/52877fig3.jpg" /> Abbildung 3. Konfiguration der Aufzeichnung und Stimulationselektroden verwendet werden, um Schwingung hervorzurufen. (A) Lage der Stimulationselektrode (Stim) im Stratum oriens und Aufzeichnungselektrode (Rec) im Stratum pyramidale der CA1. (B) Ein repräsentatives Beispiel γ die Schwingungen durch tetanische Stimulation induziert (Artefakt &quot;Stim&quot; markiert). Repräsentative Spuren zeigen quantifizierbare Ausgänge. ISI Inter-Spike-Intervall. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52877/52877fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52877/52877fig4.jpg" /> Abbildung 4. Pharmakologische Charakterisierung tetanically generated γ Schwingungen. (A) Repräsentative Spuren, die die Wirkung von CNQX. Diagramme, die die Wirkung von (B) CNQX (20 &amp; mgr; M; n = 6), (C) Bicucullin (20 uM; n = 7), (D) ZD7288 (20 &amp; mgr; M; n = 6) und (E) Ni 2+ (100 &amp; mgr; M; n = 6) von der Anzahl der Spikes. Die Daten sind als Paarvergleiche dargestellt. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01 und, *** p &lt;0.001. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52877/52877fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52877/52877fig5.jpg" /> Abbildung 5. Retigabin Auswirkungen auf Netzwerkeigenschaften. Repräsentative Beispiele, die die reduzierten Netzwerkaktivität der induzierten Schwingungen (A) in Kontrollbedingungen und (B) und &lt;strong&gt; (C) mit Retigabin. Zusammenfassung der in (D) Spike Zahl, (E) Schwingungsdauer, (F), um Latenzschwingungs Beginn, und (G) Inter-Spike-Intervall (ISI) gezeigt Wirkungen. Die Daten sind als Paarvergleiche dargestellt. * P &lt;0.05. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52877/52877fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Schwingungen sind grundlegende Netzeigenschaften und sind von Krankheiten und Arzneimittel moduliert. Studieren Gehirn-slice Schwingungen ermöglicht Charakterisierung der isolierten Netze unter kontrollierten Bedingungen. Protokolle sind für die Herstellung von akuten Gehirnscheiben zum Hervorrufen CA1 γ Schwingungen vorgesehen.

Generation of Local CA1 γ Schwingungen durch tetanische Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K Aufrufe.  University of Melbourne.  Schwingungen sind grundlegende Netzeigenschaften und sind von Krankheiten und Arzneimittel moduliert. Studieren Gehirn-slice Schwingungen ermöglicht Charakterisierung der isolierten Netze unter kontrollierten Bedingungen. Protokolle sind für die Herstellung von akuten Gehirnscheiben zum Hervorrufen CA1 γ Schwingungen vorgesehen. 

Serie: Generation of Local CA1 γ Oscillations by Tetanic Stimulation

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Forschung

Neurowissenschaften

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the centrolateral/parafascicular; Cl/Pf nucleus). The activation of either the PPN or Cl/Pf nuclei in vivo has been described to induce the arousal of the animal and an increment in gamma band activity in the cortical electroencephalogram (EEG). The cellular mechanisms for the generation of gamma band oscillations in Reticular Activating System (RAS) neurons are the same as those found to generate gamma band oscillations in other brains nuclei. During current-clamp recordings of PPN neurons (from parasagittal slices from 9 - 25 day-old rats), the use of depolarizing square steps rapidly activated voltage-dependent potassium channels that prevented PPN neurons from being depolarized beyond -25 mV.
Injecting 1 - 2 sec long depolarizing current ramps gradually depolarized PPN membrane potential resting values towards 0 mV. However, injecting depolarizing square pulses generated gamma-band oscillations of membrane potential that showed to be smaller in amplitude compared to the oscillations generated by ramps. All experiments were performed in the presence of voltage-gated sodium channels and fast synaptic receptors blockers. It has been shown that the activation of high-threshold voltage-dependent calcium channels underlie gamma-band oscillatory activity in PPN neurons. Specific methodological and pharmacological interventions are described here, providing the necessary tools to induce and sustain PPN subthreshold gamma band oscillation in vitro.

The pedunculopontine nucleus (PPN) is located in the brainstem and its neurons are maximally activated during waking and rapid eye movement (REM) sleep brain states. This work describes the experimental approach to record in vitro gamma band subthreshold membrane oscillation in PPN neurons.

Recording Gamma-Band-Oszillationen in Nucleus pedunculopontinus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent improvements in methodologies and applications for the study of theta oscillations. A simple characterization of the isolated hippocampal preparation is presented whereby the relationship between internal hippocampal theta oscillators is examined together with the activity of pyramidal cells, and GABAergic interneurons, of the cornu ammonis-1 (CA1) and subiculum (SUB) areas. Overall, we show that the isolated hippocampus is capable of generating intrinsic theta oscillations in vitro and that rhythmicity generated within the hippocampus can be precisely manipulated by optogenetic stimulation of parvalbumin-positive (PV) interneurons. The in vitro isolated hippocampal preparation offers a unique opportunity to use simultaneous field and intracellular patch-clamp recordings from visually-identified neurons to better understand the mechanisms underlying theta rhythm generation.

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Here, we present a protocol for recording rhythmic neuronal network theta and gamma oscillations from an isolated whole hippocampal preparation. We describe the experimental steps from extraction of the hippocampus to details of field, unitary and whole-cell patch clamp recordings as well as optogenetic pacing of the theta rhythm.

Tuning in der Hippocampal Theta Band<em&gt; In vitro</em&gt;: Methoden für die Aufnahme aus dem isolierten Nagetier Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

Aufzeichnung von räumlich eingeschränkt Schwingungen im Hippocampus Verhalten der Mäuse

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Inducing Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability in Neurons of the Dorsal Lateral Geniculate Nucleus

The dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) has long been held to act as a basic relay for visual information traveling from the retina to cortical areas, but recent findings suggest largely underestimated functional plasticity of dLGN principal cells. However, the cellular mechanisms supporting these changes have not been fully explored. Here, we report a protocol to induce long-term potentiation of intrinsic neuronal excitability (LTP-IE) in dorsal dLGN relay cells from acute brain slices of young rats. Intrinsic plasticity is generally induced in parallel with synaptic plasticity. However, in dLGN neurons, LTP-IE is reliably induced by spiking activity at a frequency of 40 Hz for 10 min. LTP-IE in dLGN relay neurons is long-lasting as it can be followed up to 40 min after the induction protocol. In conclusion, the results of this study provide the first evidence for the induction of intrinsic plasticity in dLGN relay cells, thus further pointing to the role of thalamic neurons in activity-dependent visual plasticity.

Here, we describe a protocol for inducing long-term plasticity of neuronal intrinsic excitability in relay neurons from the dorsal lateral geniculate nucleus maintained in ex vivo brain slices.

The dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) has long been held to act as a basic relay for visual information traveling from the retina to cortical ...

Generation of Spontaneous and On-Demand Ictal Events in Mouse Brain Cortical Slices

Source: Chang, M. et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57952">Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the induction of ictal events in coronal cortical slices from a transgenic mouse expressing light-activated cation channels in cortical excitatory pyramidal neurons. The slice is placed in a recording chamber, and a recording electrode is inserted into the superficial cortical layer. Upon perfusion with a seizure-inducing drug that blocks potassium channels, the neurons become hyperexcitable and generate spontaneous ictal events. To generate on-demand ictal events, a brief light pulse is used to activate the cation channels in pyramidal neurons, triggering the release of excitatory neurotransmitters, which induce the postsynaptic neurons to generate ictal events for a short duration.

Source: Chang, M. et al. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (2019)
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Generating Local Cornu Ammonis 1 (CA1) Gamma Oscillations Using Tetanic Stimulations in a Hippocampal Brain Slice

Source: Hatch, R. J., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52877">Generation of Local Ca1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the procedure of inducing local CA1 gamma oscillations in a CA1 hippocampal mouse brain slice using tetanic simulations. This method is important to understand the neuronal network activity.

Erzeugung lokaler Cornu Ammonis 1 (CA1) Gamma-Oszillationen mit Hilfe tetanischer Stimulationen in einem hippokampalen Hirnschnitt

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Setup ...

Neurophysiology

Stimulation and Modulation Techniques

Optogenetic Control of Hippocampal Network Dynamics

Source: Manseau, F., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55851">Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the method to use optogenetics to modulate hippocampal network dynamics by activating genetically modified light-sensitive interneurons in a mouse brain slice, enhancing theta oscillation synchronization and studying neural circuit behavior.

Optogenetische Kontrolle der Netzwerkdynamik im Hippocampus

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.

	Optogenetic control in the ...