Name: evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay
Uploaded: 2015-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
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L&#39;assistenza tecnica fornita da Jaipreet Bharj. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal EU-FP7 (SYSCILIA -241.955) e The Kidney Foundation olandese (CP11.18).

Etica Dichiarazione: animali di manutenzione, allevamento, e le procedure sono definiti e controllati dagli Animali (procedure scientifiche) Act 1986. Tutti sperimentazione animale è stata effettuata sotto licenze concesse dallo Home Secretary (PIL No. 70/7892) in conformità con Biologica Servizi Management Group e il Comitato Etico Servizi biologica, SGUL, Londra, UK. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre il numero di animali utilizzati e di affinare sia le procedure e allevamento, al fine di ridurre al minimo le sofferenze e migliorare il benessere. 1. Preparazione degli strumenti, anestetici, e fluorescente Dye <ol><li> Utilizzando un estrattore micropipetta e capillari standard di borosilicato parete (senza fili) tirare aghi di lunghezza appropriata per microiniezione (Figura 1A). </li><li> Fare uno stampo agarosio per l&#39;orientamento di embrioni per l&#39;iniezione facile nel pericardio (Figura 1B). Colla circa dieci vetro microscopio slidi insieme per formare una &#39;scala&#39; di diapositive offset. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare una goccia di rapida messa resina epossidica colla nel centro di ciascuna diapositiva. </li><li> Tagliare una sezione di circa 78 mm di lunghezza a metà due pipette 10 ml in plastica con un becco Bunsen bisturi riscaldata, rimuovere pipetta finisce a seconda dei casi. Attaccare e sezioni colla (resina epossidica) pipette ai vetrini impilati per fornire stabilità per consentire lo stampo di immergere in una capsula di Petri 90 mm. Fare ogni sforzo per garantire angoli di scorrimento allineano perpendicolare al pavimento piatto Petri. Lasciare il tempo colla per impostare. </li><li> Cast lo stampo in una soluzione di agarosio 2% made in acqua pesci (ottenuto dall&#39;acquario). Versare agarosio in un piatto 90 millimetri Petri e posizionare lo stampo sulla parte superiore del piatto Petri aperta, permettendo la diapositiva impilati bordi per immergere un angolo sotto la superficie agarosio. Lasciare impostata sul banco di laboratorio per 30 min. </li><li> Rimuovere il cast vetrino e coprire il agarosio slide-impresso con acqua il pesce frescocontenente Tricaine anestetico (vedi punto 1.9) con un rapporto di 01:25. </li><li> Fare soluzioni di rodamina destrano (RD) dye. Risospendere rodamina B 10.000 MW etichettato destrano in acqua ultrapura autoclavato a fare una scorta di concentrazione di 50 mg / ml. Per microiniezione, diluire ulteriormente il titolo ad una concentrazione finale di 5 mg / ml in acqua ultrapura autoclave. NOTA: Pigmento cellule iniziano a differenziarsi in zebrafish da 24 ore dopo la fecondazione (HPF); questi possono oscurare marcatori fluorescenti durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. </li><li> Inibire la formazione melanocita utilizzando N -Phenylthiourea (PTU), che blocca la melanogenesi attraverso l&#39;inibizione della tirosinasi. Fare una soluzione madre 0,003% di PTU sciogliendo polvere PTU in acquario, soluzione di calore a 60 ° C per solubilizzare completamente. </li><li> Incubare embrioni di zebrafish in soluzione di blu di metilene, un fungicida lieve, per evitare fioriture fungine e aumentare la sopravvivenza. Aggiungere 2 ml di blu di metilene soluzione madre, contenente 0,1% blu di metilene in uacqua ltrapure, a 1 l di acqua e l&#39;uso come mezzo embrione standard. </li><li> Portare a 15 mM concentrazione magazzino di Tricaine sale methanesulfonate / etil-3 amminobenzoato come indicato in &#39;The Zebrafish libro&#39; 23. Anestetizzare gli embrioni e di conseguenza li immobilizzato per eseguire la procedura di microiniezione. </li><li> Dopo anestetizzante gli embrioni, orientarli, per l&#39;imaging utilizzando le proprietà non-tossici e viscosi di metilcellulosa. Per fare un 200 ml preparazione di 3% metilcellulosa, chill 130 ml di acqua a -20 ° C per 30 min e posto su ghiaccio. Riscaldare 70 ml di acqua a 80 ° C in un bicchiere di vetro, aggiungere 6 g di metilcellulosa, ed agitare con una bacchetta di vetro fino a che tutte le particelle sono bagnate ed uniformemente dispersi. Aggiungere l&#39;acqua ghiacciata, mescolare, e consentire la preparazione raffreddare a 4 ° C per 30 minuti prima di aliquotando in 50 ml provette. NOTA: L&#39;abbassamento della temperatura permette la metilcellulosa di diventare solubile. La soluzione diventerà più spessacome gli idrati polvere. 3% di metilcellulosa può essere conservato senza crescita batterica per brevi periodi di una settimana a 4 ° C o più a -20 ° C. Assicurarsi che la metilcellulosa ha raggiunto RT prima dell&#39;uso. </li><li> Per eseguire iniezioni di colorante fluorescente nel zebrafish utilizzare un microiniezione set-up standard (Figura 1C). Questo consiste in un compressore d&#39;aria collegato ad un sistema regolatore di pressione che alimenta un supporto pipetta diritta per l&#39;uso con 1.0 capillari diametro esterno. Il titolare pipetta deve essere ricavato da un compatto micromanipolatore di controllo a 3 assi MM33 fissato ad una piastra di base in acciaio da un supporto magnetico. Gli embrioni possono essere visualizzati, manipolato e iniettato utilizzando un microscopio da dissezione stereo. </li></ol> 2. Zebrafish Husbandry e trattamento pre-iniezione <ol><li> Mantenere zebrafish come descritto in precedenza 23. Utilizzare un acquario set-up che fornisce l&#39;acqua di ricircolo fornita ad una temperatura costante di 28,5 ° C, Condizionati a pH 6,8-7,2 e conducibilità 450-550 mS con bicarbonato di sodio e Instant Ocean Sea Salt, rispettivamente. Utilizzare tipo selvatico o linee di zebrafish transgenici come appropriato per l&#39;esperimento, il mantenimento di una densità di 15 maschi 15 femmine per 8 L serbatoio. Impostare il fotociclo impianto pesce a 14 ore di luce del giorno tra le 09:00-23:00. </li><li> Deposizione Zebrafish comincia all&#39;inizio della fotociclo, quando le luci accendono al mattino. Per garantire il massimo delle uova possono essere raccolti senza disturbare il pesce, immergere (inserti in rete contenenti, disponibili da specialisti zebrafish) vasche di allevamento in magazzino serbatoi di tipo selvatico la sera prima della raccolta. </li><li> Il giorno della raccolta, permette 30 - 40 minuti per i pesci a deporre le uova, dopo di che raccogliere e lavare le uova con un colino da tè e acqua dell&#39;acquario fresca. Depositare le uova pulite in un terreno contenente embrione 90 millimetri piastra di Petri e incubare a 28,5 ° C. </li><li> Trattare gli embrioni con PTU inibisce melanogenesi. Alle 8 HPF, trasferire embrioni vitali in liquido minimo per piatti freschi Petri contenenti 1: 100 PTU medio embrione e l&#39;ulteriore incubare a 28,5 ° C fino 72 HPF. NOTA: PTU può causare difetti di sviluppo, se utilizzato nelle fasi precedenti così dovrebbe essere limitato a postare 8 tappe HPF, ma può essere trattata più tardi 24 HPF. Tardo aggiunta di PTU non blocca completamente la pigmentazione degli occhi, ma è generalmente efficace e inibendo la formazione del tronco melanociti. </li></ol> 3. Microiniezione NOTA: Il pericardio avvolge il cuore, ma è separato per la protezione e la facilità di movimento cardiaco fluido nella cavità pericardico. Lo scopo di questa procedura è di iniettare RD nella cavità pericardio, questo permette un rapido assorbimento del colorante al sistema vascolare. <ol><li> Aghi di carico con 6 ml - diluito RD, con punte microloader e sicuro nel supporto ago della micromanipolatore. Rompere la fine dell&#39;ago utilizzando tipp benepinza Ed (Figura 1A). Spostare la soluzione RD alla punta dell&#39;ago massimizzando durata dell&#39;impulso per l&#39;impostazione dei minuti, tornare alla msec una volta completato. </li><li> Utilizzare un micrometro, il regolatore di pressione, ed i parametri di lunghezza della punta dell&#39;ago (usando pinze) per regolare la dimensione della gocciolina espulsa a 100 micron di diametro, ciò equivale a un volume di 0,5 nl (Figura 2A). NOTA: Quando si spezza l&#39;ago, fare attenzione a non rompere troppo fuori altrimenti farà calibrare il volume di iniezione difficile. Se necessario, rompere ulteriormente la punta dell&#39;ago per aumentare la dimensione della goccia tuttavia mantenere uno spessore ago che permette l&#39;ingresso nel pericardio senza eccessiva flessione o danni al tessuto. </li><li> Prima dell&#39;iniezione anestetizzare gli embrioni in media embrione contenente Tricaine. Impostare 2 x 35 millimetri piastre Petri contenenti 5 ml di mezzo embrione, un&#39;etichetta di &#39;Tricaine&#39; e l&#39;altro &#39;Recovery&#39;. </li><li> Aggiungere 200ml di magazzino Tricaine al piatto adeguatamente etichettati. Una volta pronto per iniettare, selezionare un singolo embrione a 72 HPF e trasferire in un liquido minimo al piatto Tricaine. Monitorare l&#39;attività dell&#39;embrione, testare l&#39;embrione è anestetizzato e immobilizzato da agitazione con una punta microloader troncato. </li><li> Trasferire l&#39;embrione anestetizzato allo stampo di iniezione e orientare l&#39;embrione in un trogolo agarosio modo che il lato sinistro è rivolto verso l&#39;alto, posizionando il cuore a sinistra del campo di vista. </li><li> Per iniettare il RD nel cuore, perforare il pericardio con l&#39;ago e iniettare 1 nl del RD nella cavità pericardico dell&#39;embrione anestetizzato (Figura 2B, pannello di destra). Estrarre l&#39;ago dopo l&#39;iniezione. Trasferire l&#39;embrione iniettato nel liquido minimo per il &#39;piatto Recovery&#39; e monitor per 1 min. Trasferire l&#39;embrione individuo a un 24-pozzetti contenenti 1 ml di mezzo embrione fresco (contenente PTU) e l&#39;etichetta in modo appropriato. NOTA: Il pericardio è dura, tuttavia c&#39;è un notevole punto debole all&#39;incrocio dove il pericardio incontra gli archi faringei ventro-caudale e dorso-rostrale sacco vitellino (Figura 2B freccia). L&#39;ago deve essere diretto a questo solco. Quando l&#39;ago è in posizione, un rubinetto di un dito ferma sulla sommità del micromanipolatore faciliterà ingresso nella cavità pericardico. </li><li> Ripetere i passaggi 3,2-3,6 per almeno 10 embrioni per gruppo sperimentale, mettere ogni pesce in un pozzo separato ed unicamente labelto permesso singoli esperimenti di follow-up. Incubare a 28.5 ° C per 3 ore. </li></ol> 4. Imaging Acquisition <ol><li> A 3 ore dopo l&#39;iniezione (HPI) anestetizzare gli embrioni come precedentemente descritto e versare in un piatto 35 millimetri Petri contenente 3% metilcellulosa. Spingere delicatamente embrioni in metilcellulosa e orientare così la parte laterale può essere ripreso. </li><li> Acquisire un&#39;immagine dell&#39;embrione sotto UV, utilizzando un filtro per la visualizzazione of emessa luce a 570 nm (Figura 2C). Dopo l&#39;acquisizione delle immagini, permettono l&#39;embrione di recuperare prima di sostituire ben designato. Acquisire le immagini per tutti gli embrioni iniettati e in seguito incubare a 28,5 ° C. NOTA: In questo protocollo abbiamo utilizzato uno stereomicroscopio a fluorescenza con un set di filtri TXR, una macchina fotografica DFC300FX e relativo software applicativo. Annotare le impostazioni di acquisizione esatte per la successiva acquisizione delle immagini. </li><li> Al 24 hpi, acquisire una seconda tornata di immagini, come descritto sopra. Una volta che tutte le immagini sono state acquisite, sia a 3 e 24 HPI HPI, umanamente disporre degli embrioni o utilizzare altri mezzi sperimentali per esempio, immunoistochimica. </li></ol> Elaborazione 5. Immagine <ol><li> Quantificare intensità fluorescenza di ogni embrione iniettato, a 3 e 24 HPI HPI, analizzando le immagini utilizzando il software ImageJ del NIH. Per misurare l&#39;intensità fluorescente, aprire un&#39;immagine in ImageJ e specificare una regione di interesse (ROI) a 100 px 2 (Modifica → selezione → specificare). </li><li> Posizionare il cuore nel centro del roi (Figura 2C), impostare misure di includere media scala dei grigi e la zona (Analizza → misure set), eseguire la misurazione (Analyze → misura). Completare per ogni set di immagini, alle 3 e 24 HPI HPI, per embrioni e trasferire valori medi scala di grigi di un foglio di calcolo per ulteriori elaborazioni. NOTA: Abbiamo scelto una dimensione roi fisso pari a 100 px 2 come questo comprende cuori individuali tra embrioni. Il cuore è stato selezionato per effettuare misurazioni a causa delle dimensioni che consente una posizione comoda per misurare il contenuto di fluorescenza del sangue prima di entrare nel rene. </li><li> Eseguire l&#39;analisi statistica utilizzando appropriati software statistico. Confronta i gruppi per la significatività statistica con t-test di uno studente. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Zebrafish offrire un prezioso strumento per modellare malattia genetica umana, il loro impiego come strumento scientifico per la ricerca in vivo hanno consentito studi dettagliati sulla composizione genetica di molti sistemi biologici, tra cui il rene. Ora molto è capito su come si sviluppa il rene zebrafish e funzioni. Le somiglianze sorprendenti per nefrogenesi umana e omologia con i geni che causano malattie 21 ha illustrato come zebrafish sono diventati fondamentali per capire come difetti di funzione del gene portano alla patologia della malattia renale. In effetti, la manipolazione genetica può essere raggiunto senza sforzo in zebrafish utilizzando antisenso morfolino tecnologia atterramento o più avanzati genoma mirati strumenti di editing, come TALENS o CRISPR. Creazione di modelli atterramento o mutanti per sospetta malattia renale geni che causano è il primo passo per capire il loro coinvolgimento nella manifestazione della malattia. Per fare questo è richiesto un test affidabile per la funzione renaleper indicare se un gene candidato è probabilmente responsabile per la patologia osservata nei pazienti. Test di funzionalità renale sono semplici e relativamente poco costoso per eseguire sugli esseri umani, in genere guardando i livelli di soluti presenti nel sangue o nelle urine. Tuttavia, questi metodi sono applicabili in zebrafish grazie alle sue piccole dimensioni e l&#39;habitat acquatico. Il dosaggio destrano rodamina qui descritto utilizza la capacità di tubuli pronephric filtrare componenti a basso peso molecolare dal sangue. I podociti posizionati all&#39;interno della capsula di Bowman del rene, che avvolge i capillari del glomerulo, consentono il passaggio libero di piccole molecole come l&#39;acqua, sali ionici e glucosio attraverso un diaframma a fessura 27. Le fessure di filtrazione funzionano ulteriormente per prevenire la perdita di proteine ​​macro dal sangue. Filtrazione è limitato per le molecole di cui sopra 5 kDa e quasi completamente bloccato la dimensione di albumina sierica 28 (circa0; 65 kDa). Iniettando un colorante fluorescente destrano di circa 10 kDa, ad una concentrazione nota nella cavità pericardio, siamo in grado di misurare l&#39;intensità fluorescente del sangue nel tempo. In condizioni normali di circa l&#39;85% della fluorescenza iniziale è persa dal sangue, in un periodo di 24 ore, attraverso la secrezione via renale. Si deve notare che l&#39;iniezione nello spazio pericardico è possibile solo con destrano basso MW che passa liberamente nel sistema vascolare. Così, questo saggio dà solo una lettura-out per il tasso di passaggio per i componenti a basso peso molecolare e non fornisce alcuna informazione circa l&#39;efficacia di filtrazione glomerulare. Quest&#39;ultima può essere valutata più direttamente usando alti coloranti peso molecolare oltre 70 kDa, richiedendo iniezione nel sistema vascolare e non nello spazio pericardico. Infatti, destrani di varie MW possono essere utilizzati per sezionare ulteriormente la funzione renale 28. I tubuli pronephric zebrafish sono altamente ciliato con mocilia piastrelle che facilitano il movimento del filtrato verso la cloaca 3,4. Difetti di macchinari ciliare sono stati implicati in malattie renali. BBS è un geneticamente eterogenea, autosomica recessiva malattia caratterizzata da degenerazione retinica ad esordio infantile, obesità precoce insorgenza, deficit cognitivo, polidattilia e malformazione renale 24. Ad oggi, sono stati identificati 20 geni BBS (BBS1-20). Turbativa di bbs porta alla formazione di cisti renale e la funzione pronephric difettoso in zebrafish 9. BBS9 interagisce con altre proteine ​​BBS per formare il BBSome responsabile del caso ciliogenesis, mutazioni di cui rappresentano il 6% dei casi BBS 24. Mentre un modello bbs9 atterramento zebrafish è stato segnalato, una descrizione del fenotipo renale era carente 26. Abbattendo bbs9 in zebrafish, utilizzando l&#39;approccio morfolino, dimostriamo l&#39;uso del saggio clearance renale come metodo per determinarefunzione renale in un modello di malattia renale. Qui, dimostriamo che gli embrioni bbs9 morphant visualizzare spazio fluorescente ostacolato dal flusso sanguigno, che indica che il rene non è riuscito a rimuovere soluti a basso MW. Così, a causa del coinvolgimento di bbs9 in ciliogenesis, e il ruolo delle ciglia pronephric nel facilitare il movimento filtrato, la clearance renale osservato in morphants è probabilmente dovuto alla funzione di cilia aberrante. Questo metodo rappresenta un valido strumento per la valutazione della funzione renale in modelli di malattia di zebrafish.

Il rene umano gioca un ruolo cruciale nel filtraggio rifiuti metabolici dal sangue e il recupero soluti necessarie per sostenere l&#39;omeostasi cellulare. Ci sono un certo numero di malattie genetiche umane che causano disfunzioni renali. La malattia renale ereditaria più comune è autosomica dominante malattia del rene policistico (ADPKD) caratterizzato dallo sviluppo di fluidi riempita sacs all&#39;interno tubuli pochechnykh; i danni provocati da cystogenesis è dannoso per la funzione renale 10. ADPKD ha una occorrenza di 1: 800 - 1: 1.000 e rappresenta il 8-10% dei pazienti con insufficienza renale allo stadio terminale (ESRF) 11. Diversi geni sono stati implicati a causare ADPKD compreso policistina-1 (PKD1) e -2 (PKD2), che rappresentano circa l&#39;85% e, rispettivamente, 12,13 15% dei casi. Inoltre, i prodotti genici per PKD1 e -2 localizzano al ciglio e sono fondamentali per ciliogenesis 14,15. Vi è ora una famiglia riconosciuta di malattie genetiche umane, dettile ciliopatie, che influenzano la funzione delle ciglia e si traducono in CKD 16. Il crescente numero di malattie genetiche umane che influenzano lo sviluppo e la funzione ciliare sta disegnando interesse globale in questo organello vestigial tempo considerato. Il cilium, una sporgenza cellulare a ciglia, è arricchito con recettori e canali necessari per la trasduzione di eventi di segnalazione cellulare chiave ioni. Il cilium consiste di un axoneme basata microtubuli, tipicamente strutturato in nove doppietti microtubuli disposte radialmente con o senza una coppia centrale di microtubuli singoletto. La struttura axonemal definisce il tipo e la modalità di azione ciliare. La disposizione 9 + 2 microtubuli conferisce alla motilità cilium dove viene utilizzato nel movimento dei fluidi attraverso superfici epiteliali. La configurazione 9 + 0 non è mobili, ma si crede che soprattutto in funzione di eventi di segnalazione cellulare 17. Oltre CKD, le conseguenze della disfunzione ciliare sono un insieme di caratteristichecaratteristiche ciliopathy che comprendono, l&#39;obesità, la degenerazione della retina, polidattilia, e deterioramento cognitivo 16. Tuttavia, CKD è tra i più dannosi per la qualità della vita del paziente e quindi una forza trainante dietro lo sviluppo di adeguati modelli in vivo per ciliare correlati CKD. Il pesce zebra è un ottimo modello per comprendere l&#39;eziologia della malattia genetica umana. Il loro rapido sviluppo, la produzione di un gran numero di uova, il tessuto trasparente, e la crescita ex utero permette processi di sviluppo di zebrafish per essere visualizzati e gli eventi biologici manipolati con notevole facilità. I geni possono essere geneticamente modificati con il recente successo di strumenti di editing genoma (CRISPR 18 e Talens 19), abbattuto con antisenso tecnologia morfolino 20, o farmacologicamente regolati con l&#39;aggiunta di composti al loro ambiente acquatico. Infatti, zebrafish offrire una piattaforma di intraprendere experiments che non sono permissive in altri modelli animali. Mentre zebrafish sono vertebrati relativamente semplici (rispetto per gli esseri umani) hanno in comune molti organi funzionalmente conservati, geni e processi di segnalazione in comune con gli esseri umani. Ad esempio, il rene zebrafish è notevolmente simile in struttura e funzione rispetto agli esseri umani 21,22. Tuttavia, a differenza del rene mammiferi che si sviluppa attraverso una serie di fasi, ciascuna contrassegnata da un rene più sviluppata (Pronefro, mesonefro e metanefro), il pesce zebra embrionale si sviluppa solo pronephros, la forma più immatura di un rene. Mentre milioni di nefroni si trovano formare i mattoni del rene mammiferi, l&#39;embrione zebrafish solo possiede due. Il glomeruli, che consentono il filtrato del sangue iniziale, si fondono sulla linea mediana appena ventrale all&#39;aorta. I filtri di sangue attraverso il glomeruli nei tubuli pronephric che corrono caudalmente lungo l&#39;asse, fusione prima di uscire attraverso la cloaca. Il pronephric tubules sono fortemente ciliato con cilia motilità che sono permissive al flusso del filtrato verso l&#39;uscita caudale 3,4. Questa struttura semplice pronephric mantiene l&#39;omeostasi zebrafish attraverso diverse settimane di crescita delle larve dove alla fine si sviluppano in una più complessa struttura mesonefro 21. Tuttavia, il pesce zebra non sviluppa una metanefro 21. Nonostante le idiosincrasie zebrafish, nefrone zebrafish è segmentato con profili di espressione genica pari a quello osservato nei mammiferi e offre così un impareggiabile nel modello in vivo per nefrogenesi 3,22. Ordinariamente i pazienti sono testati per la funzione renale, attraverso una serie di esami del sangue e delle vie urinarie. Tipicamente il sangue viene analizzato per disciolto sali, urea e creatinina. Alti livelli di urea, creatinina e concentrazioni saline anomale sono indicativi di problemi con la funzione renale. L&#39;analisi delle urine utilizzando un asta colorimetrico rileva i livelli anormali di proteine, Blood, pus, batteri e zucchero in campioni di urina presente. Tali prove normalmente richiedono circa 30 ml di urina o di 5-10 ml di sangue. È stato difficile tradurre questi tipi di saggi di piccole organismi modello in vivo, come il pesce zebra, dovuta principalmente alla natura impossibile della raccolta di sangue o di urina sufficiente per eseguire il test. Qui, ci rivolgiamo la mancanza di adeguati test di funzionalità renale zebrafish e descriviamo una tecnica innovativa per il suo studio. Iniettando un colorante fluorescente nel flusso sanguigno siamo in grado di monitorare e quantificare singolarmente nel tempo la filtrazione e l&#39;escrezione di attività fluorescente dal sangue attraverso i reni. Questo metodo può essere usato per studiare il danno renale causato da malattia, cui forniamo un esempio di.

<table><tbody><tr><td>P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td><td>Intracel</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>borosilicate standard wall capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides</td><td>VWR International</td><td>631-0109</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Resin Glue</td><td>Evo-Stik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>D-1824</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>air compressor&amp;nbsp;</td><td>Jun-Air</td><td>OF302-15</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III&amp;nbsp;</td><td>Parker Instruments&amp;nbsp;</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>compact 3-axis control micromanipulator&amp;nbsp;</td><td>Marzhauser</td><td>MM33&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting stereo microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>stage micrometer&amp;nbsp;</td><td>Pyser- SGI</td><td>02A00404</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

L&#39;embrione zebrafish offre un modello per lo studio trattabili organogenesi e modello di malattia genetica umana. Nonostante la sua relativa semplicità, il rene zebrafish sviluppa e funzioni quasi nello stesso modo come gli esseri umani. Una differenza importante nella costruzione del rene umano è la presenza di milioni di nefroni rispetto al zebrafish che ha solo due. Tuttavia, semplificando un sistema così complesso in unità funzionali di base ha aiutato la nostra comprensione di come si sviluppa il rene e gestisce. In zebrafish, la linea mediana trova glomerulo è responsabile per la filtrazione del sangue iniziale in due tubuli pronephric che divergono per eseguire bilateralmente lungo l&#39;asse embrionale prima di fondersi tra loro a cloaca. I tubuli pronephric sono fortemente popolate da cilia motili che facilitano il movimento di filtrato lungo il tubulo segmentato, permettendo lo scambio di vari soluti prima infine di uscire attraverso la cloaca 2-4. Molti geni responsabili di CKD, incLuding quelli relativi alla ciliogenesis, sono stati studiati in zebrafish 5. Tuttavia, un grande inconveniente è stata la difficoltà di valutare la funzione renale zebrafish dopo manipolazione genetica. Saggi tradizionali per misurare disfunzioni renali nell&#39;uomo hanno dimostrato non traslazionale per zebrafish, dovuto principalmente al loro ambiente acquatico e le dimensioni ridotte. Ad esempio, non è materialmente possibile estrarre sangue da embrionale scena pesci per l&#39;analisi del contenuto di urea e creatinina, in quanto sono troppo piccole. Inoltre, zebrafish non produce abbastanza urine per il test su un semplice proteinuria &#39;astina&#39;, che viene spesso eseguita durante gli esami iniziali paziente. Descriviamo un test di fluorescenza che utilizza la trasparenza ottica della zebrafish per monitorare quantitativamente il passaggio di un colorante fluorescente, nel tempo, dal sistema vascolare e fuori attraverso il rene, per dare una lettura fuori della funzione renale 1,6-9.

Sindrome di Bardet-Biedl (BBS) è una ciliopathy eterogeneo rara che colpisce circa 1: 160.000 persone in tutto il mondo 16. I pazienti presentano una serie di problemi connessi compresi reni policistici, successivamente i pazienti spesso richiedono dialisi o il trapianto 24. ESRF è la causa più comune di morte in BBS, con circa il 30% dei pazienti che sviluppano CKD 16. Attualmente, 20 geni non correlati sono stati implicati in BBS senza pubblicato associazione genotipo-fenotipo. Le proteine ​​BBS condividono domini localizzazione proteica comuni in seno agli organi Ciglio e basali che, insieme con i tratti caratteristici dei pazienti, deducono una diagnosi ciliopathy. BBS9 codifica B1 Parathyoid Hormone-reattiva (PTHB1) proteina che insieme ad altri BBS (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) proteine ​​formano il nucleo BBSome complesso responsabile della formazione del ciglio primario 24. Mutazioni in conto BBS9 per il 6% dei BBS cAses 24. Inoltre, PTH è stato implicato in formazione di cisti renali attraverso la promozione di renale proliferazione delle cellule epiteliali, suggerendo che la perdita di funzione bbs9 in zebrafish potrebbero mostrare difetti renali 25. I rapporti precedenti con un bbs9 atterramento modello di zebrafish escludono una descrizione del rene, che presenta la possibilità di dimostrare il rene descritto funzione test 26. Knockdown della funzione bbs9 è stato raggiunto in zebrafish iniettando, nella fase 1 a 4 celle, un morfolino antisenso per bloccare gene traduzione bbs9 specifico e in parallelo un morfolino controllo negativo normale contro una mutazione in intronico umana beta-globina (4 ng bbs9 MO, sequenza: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA e controllo 4 ng MO, sequenza: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). Abbiamo scoperto che la perdita della funzione bbs9 portato nel 40% degli embrioni che mostrano cisti pronephric da 5 dpf, suggerendo che questo era un modello adeguato per analizzarela funzione renale utilizzando il test rodamina destrano gioco. Abbiamo osservato che i pesci morphant hanno una significativa riduzione della loro capacità di eliminare il colorante fluorescente dopo 24 hpi rispetto ai controlli (Figura 3) - con: 14.8 ± 1.2 SEM, n = 9; MO bbs9: 61,0 ± 10,3 SEM, n = 10 ; spaiato valore P t-test: 0.002). Per escludere la possibilità che ha ridotto la clearance potrebbe essere a causa della ridotta circolazione del sangue, gli embrioni sono stati valutati per le cellule del battito cardiaco e del sangue di ricircolo, sia il controllo e pesce morphant avevano frequenza cardiaca comparabili e il flusso di sangue. Questi dati indicano che la funzione renale è compromessa in morphants bbs9. In effetti, gli embrioni bbs9 morphant sviluppano tubuli pronephric cistica in concomitanza con quello osservato in pazienti BBS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52540/52540fig1highres.jpg" width="700" /> Figura preparazione 1. apparecchiaturee set-up. Capillari (A) borosilicato dovrebbero essere tirato per la microiniezione utilizzando un apposito estrattore ago. L&#39;ago, occorre eliminare con una pinza (linea tratteggiata) per consentire la RD per uscire l&#39;ago, si deve prestare attenzione a non rompere l&#39;ago troppo rendering di un ago che non può essere calibrato. Scala bar:. 200 micron (B) uno stampo agarosio per la manipolazione degli embrioni e l&#39;orientamento può essere modellato incollando insieme vetrini e pipette di plastica (C) La norma microiniezione set-up.. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52540/52540fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura .</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52540/52540fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Microiniezione di rodamina destrano nel sacco pericardico. (A) Calibrare la dimensione della goccia di 10 increments (100 micron), su un reticolo stadio 1 mm. (B) Il corretto posizionamento dell&#39;ago (frecce nere) nella marcatura l&#39;intersezione tra la caudale arco faringeo, sacco vitellino e cuore faciliterà penetrante del tessuto (freccia) crepaccio. Scala bar:. 200 micron (C) rodamina destrano può essere visto rapidamente ripreso da tutta la vascolarizzazione (frecce bianche). 100 px 2 regioni d&#39;interesse, che coprono un cuore centrale (quadrato giallo) deve essere utilizzato per prendere le misure del valore di grigio medio e di conseguenza l&#39;intensità pixel / fluorescenza. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52540/52540fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52540/52540fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Knockdown di bbs9 provoca func rene difettosozione in zebrafish. (A) Gli embrioni iniettato pericardio con rodamina destrano alle 3 e 24 HPI HPI, superiore e inferiore di due pannelli, rispettivamente, sia il controllo o embrioni bbs9 morphant. Frecce indicano il cuore; freccia indica la formazione di una cisti pronephric. intensità fluorescente (B) Percentuale rimanente dopo 24 hpi controllo rispetto embrioni bbs9 MO. Le barre di errore indicano l&#39;errore standard della media (SEM), ** P ≤ 0,01. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52540/52540fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Il pesce zebra è uno strumento popolare per modellare la malattia renale cronica (CKD). Tuttavia, la loro piccola dimensione rende impossibile valutare la funzione renale con metodi tradizionali. Descriviamo un colorante fluorescente rene liquidazione test 1 che permette l&#39;analisi quantitativa della funzione renale zebrafish in CKD.

Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Views.  University College London.  Il pesce zebra è uno strumento popolare per modellare la malattia renale cronica (CKD). Tuttavia, la loro piccola dimensione rende impossibile valutare la funzione renale con metodi tradizionali. Descriviamo un colorante fluorescente rene liquidazione test 1 che permette l'analisi quantitativa della funzione renale zebrafish in CKD. 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biologia

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Modello di lesione renale acuta indotto dal cisplatino nel pesce zebra adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...