Name: physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti
Uploaded: 2014-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti at JoVE.com

The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

1. allevamento Ae. adulti aegypti <ol><li> Le uova si schiudono in circa ¾ di pollice in acque poco profonde cassetto. Sovraffollamento ridurrà la dimensione degli adulti. </li><li> Larve posteriore a 25 ° C (12-HL: 12-HD) ed alimentare con cibo per pesci a terra. NOTA: sovralimentazione può ridurre i tassi di sopravvivenza. </li><li> Rimuovere pupe individualmente da pipetta Pasteur quotidiano e trasferimento in piatti di plastica (9 centimetri × 5,5 centimetri) all&#39;interno secchielli di contenimento con fini coperchi maglia, stabilendo così 24 gruppi di età hr. </li><li> Mangimi zanzare adulte soluzione al 10% di saccarosio dal batuffolo di cotone collocato sulle pareti schermo di un contenitore gabbia le zanzare in una camera climatica a 27 ° C e 70% di umidità relativa sotto la stessa fotoperiodo come larve. </li><li> Per elettrofisiologia, utilizzare 5-10 giorno animali vecchi. In generale, gli animali più grandi produrranno risultati migliori. Per l&#39;isolamento di RNA, usare gli animali che si trovano all&#39;interno di un unico 24 ore raggruppamento età nel vecchio campo di 5-10 giorni. </li></ol><ol><li> Determinare una concentrazione adeguata di elettroliti (ad esempio 1-10 mm) suscita l&#39;attività minima da neuroni sensoriali selezionati. 10 mM NaCl o 1mm KCl sono elettroliti ragionevoli per testare l&#39;attività di base quando si inizia un esperimento. </li><li> Sciogliere ogni chimica sperimentale nel solvente appropriato (se non l&#39;acqua, usare etanolo o DMSO) che ha poco o nessun effetto sulla attività picco rispetto all&#39;elettrolito sola. Le concentrazioni finali di 10% etanolo o 1% DMSO sono concentrazioni iniziali ragionevoli. </li><li> Selezionare appropriata (ad esempio il chinino per amaro o di saccarosio per dolci) i prodotti chimici di controllo che sono ben descritti, deterrenti alimentazione o stimolanti negli insetti. </li></ol> 3. Elettrofisiologia (registrazione punta 8; Figura 1) <ol><li> Elettrodi di vetro Form tirando meccanicamente capillari di vetro. Ottimizzare il calore e tirare le impostazioni di tirare vetro per formare recordi opportunamente sagomataElettrodi ng. Rompere con cautela fine del elettrodo di vetro con pinze sotto un microscopio da dissezione per creare elettrodo punta apertura che è sufficientemente ampia per busta bersaglio sensillum, ma abbastanza piccolo per evitare il contatto con le strutture vicine. </li><li> Al microscopio, identificare visivamente dalla morfologia e posizionare il target sensilla / sensillum per garantire la ripetibilità della registrazione punta. Animali Prep per consentire l&#39;accesso gratuito al sensilla dall&#39;angolo di entrata dell&#39;elettrodo. </li><li> Freddo insetti anestetizzare adulti in freezer a -20 ° C. Evitare danni ai neuroni periferici da sovraesposizione a temperature fredde. Tagliare sottili strisce di nastro adesivo con lama di rasoio sul vetrino. Immobilizzare intero insetto su un vetrino con strisce strette. </li><li> Inserire un filo di tungsteno affilata chimicamente nel torace dorsale o occhio per servire come indifferente (terra) dell&#39;elettrodo. </li><li> Riempire elettrodo vetro fatto a passo 3,1 con una soluzione stimolante di interesse. Utilizzando una siringa inserita, compilare capIllary dalla fine tirato a Blunt fine. Rovesciare tutte le bolle d&#39;aria, tenendo fine abbattuto. Inserire un filo d&#39;argento (chloriding opzionale) nell&#39;elettrodo di vetro fatto a passo 3.1 per servire come elettrodo di registrazione e stimolante. </li><li> Collegare gli elettrodi ad un preamplificatore che è stato progettato per registrazioni da contatto chemoreceptive sensilli negli insetti. Questo preamplificatore (300 Hz-3 kHz filtro passa-banda) ridurrà il tempo di assestamento di catturare l&#39;attività neuronale più vicino allo stimolo introduzione possibile. Raccogliere, archiviare e analizzare i segnali elettrici con un microcomputer dotato di software di registrazione picco. NOTA: Messa a terra del sistema di registrazione correttamente può migliorare drasticamente il rapporto segnale-rumore. </li><li> Stimolare sensilla con una soluzione di controllo (solo elettrolita) per garantire la funzionalità. Conte picchi a partire 200 msec seguito l&#39;artefatto stimolo per tutte le preparazioni. </li><li> Casuale l&#39;ordine di sostanze chimiche di prova per tutti gli esperimenti, tranne studi dose-risposta,per eliminare pregiudizi. Per gli studi dose-risposta, esporre sensilla ad aumentare concentrazioni della sostanza chimica sperimentale. Lasciare un minimo di 3 minuti tra stimoli al fine di garantire un adeguato recupero. NOTA: Questo requisito può variare a seconda degli insetti e sensilli. Soglia è definita come quella concentrazione per cui errore standard non si sovrappone con l&#39;errore standard per la concentrazione più bassa testata. </li></ol> 4. RNA Isolamento e Sequencing (Figura 2) <ol><li> Preparare i pestelli RNasi-free ermetici da loro raffreddamento in ghiaccio secco prima di tessuto disruption.Prepare accompagnano pestelli RNasi-free che si adattano provette con tappo a scatto saldamente. Tenere tubi di raccolta chiusi a meno dissezione attivamente per evitare eccessiva formazione di condensa. </li><li> Utilizzando aspiratore filtrato, mettere da 30 a 40 le zanzare-anestetizzato freddo (15 sec in -20 ° C freezer) sul palco freddo e mostra per il sesso. Luogo animali dorsale lato negativo, afferrare le ali per non danneggiare appendici gusto.</li><li> Utilizzando due coppie di pinza sottile, sezionare Paired Labella o tarsi da maschi o femmine sotto un microscopio da dissezione e limitare l&#39;inserimento di tessuti adiacenti. NOTA: 500 Labella accoppiato produce circa 800-1000 nanogrammi di mRNA totale. 400 tarsi individuale (5 segmenti ciascuno) produrranno 1,200-1,800 nanogrammi di mRNA totale. </li><li> Con un paio di Ansimare-pinze, leggermente cogliere proboscide zanzara solo prossimali di Labella esporre mandrini interni. Utilizzando altra coppia di raccolta-pinze, rimuovere Labella e aggiungere tessuto lato del tubo di raccolta a freddo. </li><li> Con un paio di pinze, leggermente cogliere gamba zanzare allo svincolo di tibia e primo segmento tarsale. Utilizzando altra coppia di pinze, rimuovere tarsi e aggiungere tessuto lato del tubo di raccolta a freddo. NOTA: Prendere in considerazione i tipi di cellule a livello di interfaccia del tessuto desiderato e indesiderati. Mentre è importante limitare l&#39;inclusione di tessuto limitrofo, è altrettanto importante non omettere porzioni di tessuto desiderato. Il ficampione finale deve rappresentare accuratamente l&#39;intero organo di interesse. Creare un confine preciso con le pinze di presa in modo tale che una pinza di raccolta possono liberare proprio raschiando o afferrare solo il tessuto desiderato. </li><li> Periodicamente, spin down tubo di raccolta brevemente 0 ° C centrifugare a 9.000 xg per mantenere il tessuto sul fondo della provetta. Se l&#39;umidità si accumula nei tubi di raccolta durante la dissezione, aggiungere 50ul di freddo reagente Trizol per coprire il tessuto raccolti. </li><li> Utilizzando anti-macchia marcatore laboratorio, etichetta chiaramente uno senza RNase 1,5 ml schiocco provetta con tappo per ogni tipo di tessuto per la raccolta. Usando 1,5 ml provetta rack e azoto liquido, congelare poi macinare tessuto in polvere fine (pezzi pregiati se in Trizol). Ripetere una volta. Portare il volume totale di Trizol a 1 ml e sospendere nuovamente il tessuto terra nel vortex. </li><li> Aggiungere 200 ul di cloroformio e mescolare accuratamente. Dopo 5 min a temperatura ambiente, centrifugare a centrifugare a 4 ° C e 11.000 xg per 15 min. Attentamenteaggiungere strato acquoso direttamente ad una colonna filtro DNA genomico. Spin down a 11.000 x g per 5 min. Aggiungere uguale volume di RNase-free etanolo al 70% a flusso continuo e mescolare pipetta. Trasferire il liquido a una colonna collezione RNA e continuare l&#39;estrazione di RNA secondo le istruzioni fornite. </li><li> Quantificare e valutare la purezza di RNA totale su uno spettrofotometro di precisione e procedere con qualsiasi metodo di sequenziamento RNA standard. </li></ol> 5. quantitativa RT-PCR convalida di RNA Sequencing (Figura 3) <ol><li> Selezionare come molti geni come possibile confrontare i livelli di espressione genica relativi su una gamma dinamica, sia in previsto abbondanza sequenza e la funzione del gene chemosensory presunta. </li><li> Coppie di progettazione di primer per ogni gene target per amplificare uno specifico prodotto della PCR 100-180 paio di basi. Escludi non specifico di amplificazione gDNA garantendo almeno un fondo per set estende un confine introne. In alternativa, utilizzare il trattamento DNasi per ridurre la contaminazione genomico. </li><li> Raccoglieretessuto insetto come descritto nel paragrafo precedente. Calcolare la quantità di tessuto è necessario per fornire abbastanza RNA per completare tutte le reazioni qRT-PCR. NOTA: triplice copia biologica e reazioni triplicate tecnici forniranno la massima fiducia nei risultati. </li><li> Calcola relativa quantificazione gene come X bersaglio - (Ct [destinazione] -Ct [riferimento]) per ogni gene target e media per ogni replica, sia biologico e tecnico. Utilizzare gene housekeeping (s) per normalizzare valori Ct tra i replicati biologici e di sradicare la scala Y in confronto di espressione relativa. </li><li> Valutare la somiglianza di RNA-Seq e dataset qRT-PCR usando la procedura di equivalenza bootstrap basato regressione-9, in modo iterativo applicato, per i dati di ogni tessuto. NOTA: Questa procedura identifica la più piccola &quot;regione di somiglianza&quot; che può essere costruito intorno alla dati RNA-Seq e qRT-PCR osservata, e consentire l&#39;espressione genica relativa come misurato da qRT-PCR da considerare statisticamente equivalente alla misurazione dell&#39;espressione genica relativa da RNA-seq. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

L&#39;aspetto più impegnativo di potenziali d&#39;azione di registrazione da sensilla gustativa è decidere quali risposte sono &quot;normali&quot;. Quando impiegando singolo sensillum gustativa punta registrando la prima volta per una determinata specie di insetti, il numero totale e sensibilità dei neuroni recettori gustativi (GRN) sono probabilmente sconosciuta. Molte registrazioni preliminari vengono prima tenuti a decidere la gamma e le concentrazioni di sostanze chimiche da testare. In questo caso, abbiamo cominciato con l&#39;osservazione che un singolo GRN risposto a basse concentrazioni di DEET (Figura 1). Successivamente, abbiamo esaminato risposte all&#39;interno dello stesso sensillum a un intervallo di concentrazioni di sostanze chimiche notoriamente amaro o repulsivo ad altri insetti e osservato un picco di forma simile e ampiezza (Figura 1). Queste osservazioni hanno suggerito che un unico sottotipo GRN risponde a questi composti avversi. Per confronto, abbiamo testato composti zuccherati noti per stimolare l&#39;alimentazione in mosquitoes per vedere se si è verificato un picco simile. Abbiamo osservato un diverso, picco più grande in questo caso. Allo stesso modo, abbiamo osservato un terzo, picco intermedio di dimensioni in risposta alla stimolazione sale, portando il totale conteggio GRN sottotipo a tre. Preparazioni di registrazione elettrofisiologici in insetti sono intrinsecamente variabile. Obiettivo sensilli gustativi sono in genere molto piccoli e deve essere posizionato ad angolo adeguato per accedere con l&#39;elettrodo di registrazione senza toccare il vetro per la cuticola. Per stabilire un ponte conduttivo neuroni gustative, il poro terminale del sensillum deve essere aperta per la linfa contenuta di stabilire un contatto diretto con elettrolita dell&#39;elettrodo di registrazione. Abbiamo osservato il blocco delle aperture sensilli sia da corpi estranei o escreti e materiale essiccato all&#39;interno del sensillum bersaglio. Per evitare questi ostacoli, la cura deve essere presa quando l&#39;allevamento e la manipolazione insetti per evitare il contatto con il sensilli bersaglio. Oltre alla scelta finalecantare intatti, insetti prova sane, fattori biologici come l&#39;età, lo stato di alimentazione, accoppiamento stato e zeitgeber tempo dovrebbe essere considerato al momento di stabilire i controlli per ridurre la variabilità nelle registrazioni. Può essere difficile ottenere una preparazione reattivo coerente. Molti studi può essere necessario per migliorare il rapporto abbastanza segnale-rumore per risolvere singoli picchi. Variazioni sperimentali sulle preparazioni summenzionate possono portare a risultati migliori. Si consiglia di stabilire una risposta forte sul vostro apparecchio di registrazione per la vostra specie di test utilizzando un comune picco elicitore insetto, come saccarosio o chinino. Una volta che un sensillum gustativa risponde, queste risposte dovrebbero essere riproducibile. La lunghezza minima di tempo tra stimoli deve essere determinato in via sperimentale l&#39;esame dinamiche picco sotto diversi vincoli temporali. Stimolazione eccessiva dovrebbe essere evitato per preservare GRN salute e prevenire sensillum degrado linfa. Nel caso thasensibilità di risposta t diminuisce rapidamente dopo la prima stimolazione, un maggior numero di preparazioni deve essere ottenuto per fornire fiducia che queste risposte sono fisiologicamente tipico per specie esaminate. La solubilità di alcune sostanze chimiche di prova può creare difficoltà a fare elettrodi stimolanti, come alcuni solventi possono influenzare l&#39;attività GRN, anche a basse concentrazioni finali. Queste considerazioni possono essere affrontate attraverso prove ed errori e con controlli appropriati. Qualsiasi solvente utilizzato deve essere aggiunto l&#39;elettrolita di controllo e altre soluzioni di test per garantire la coerenza delle risposte. Piccoli insetti immobilizzante, fornendo così un accesso diretto al bersaglio sensilla senza danneggiare i tessuti fragili, possono richiedere prove ed errori. Il limite principale di elettrofisiologia è sfortunata separazione delle risposte neuronali osservati e potenziali risposte comportamentali a valle. Pertanto, è vantaggioso testare risposte a sostanze chimiche che hanno Been dimostrato di suscitare risposte comportamentali specifici, al fine di discutere il significato dei risultati in un contesto ecologico. Registrazioni Tip consentono la rilevazione molto accurata di attività cellulare, rendendo questa tecnica ideale per valutare gli animali transgenici o che manifestano differenze fenotipiche nel comportamento. Queste registrazioni offrono anche ulteriori informazioni sulle risposte neuronali, come la dinamica temporale e ampiezza, rispetto ai sistemi basandosi su giornalisti visive di attività neuronale. In alcuni casi, le risposte neurali possono essere quantificati più facilmente di dati comportamentali 12. Collezione Tissue per RNA-Seq e qRT-PCR è semplice, ma richiede concentrazione continua e l&#39;attenzione a preservare il materiale cellulare tramite celle frigorifere e di evitare l&#39;umidità in eccesso. Attività RNasi può influenzare la qualità RNA; quindi il tessuto dovrà rivolgersi unicamente superfici pulite in tutta la raccolta e l&#39;estrazione di RNA. Anche se la risoluzione dei problemi necessario per qRT-PCR is ben documentata, le più probabili insidie ​​si verificano nelle prime fasi del processo durante la progettazione primer e la selezione di destinazione e di pulizia geni. I geni che rappresentano prevedibilmente punti uniformemente distanziati lungo una linea di livello di espressione relativa sono utili per confrontare RNA-seq e set di dati qRT-PCR (Figura 3). Ad esempio, selezionando geni per qPCR che mostrano valori RPKM di 0, 10, 20, 30, ecc, rispettivamente, offrono un ordine prevedibile di abbondanza da testare. RNA-Seq è riuscito a mettere in luce umile espressione di geni nel nostro sondaggio dei tessuti gustative (Figura 2). La build gene affidabile per Ae. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) e gene prima chemorecezione identificazione 14 fatto segnando genica relativamente facile. A tal fine, gli insetti con annotazioni gene disponibili e famiglie di geni identificati interesse sistemi modello di valore. Determinare una soglia precisaper l&#39;espressione genica contro il rumore di fondo è speculativa, ma i metodi per determinare tagli ragionevoli sono disponibili 15-17. Qui abbiamo determinato un livello RPKM di totale fiducia e di un livello più basso di RPKM diminuita fiducia sulla base di un precedente 9 con cui incorniciato nostra discussione dei risultati. In futuro speriamo di sezionare altri tessuti chemosensoriali sia la zanzara e altri insetti economicamente importanti per ampliare la nostra conoscenza dei geni che mediano insetto repellenza. Abbiamo stabilito diversi geni candidati gustative che sono molto probabilmente mediare le risposte a composti avversi confrontando sequenze di geni di specie con i dati funzionali disponibili 13. Stiamo generando linee transgeniche di zanzare mancanti questi singoli geni chemosensoriali. Useremo registrazioni punta per valutare il ruolo di questi geni sulla capacità degli animali di rilevare repellenti conosciute e valutare le risposte comportamentali di questi mutanti a REPEllents. Nel caso che questi geni non influenzano significativamente repellenza, più risoluzione può essere necessario determinare più precisamente espressione genica o la presenza della proteina in una singola sensillum o cella. Lowly recettori espressi possono essere bersagli critici per lo screening di nuovi repellenti, insieme ai co-recettori ubiquitariamente espresso. Purtroppo, ibridazione in situ e immunolocalizzazione è dimostrato incredibilmente difficile in insetto tessuto gustativa 18. Una volta che abbiamo stabilito quali geni mediare queste risposte e comportamenti fisiologici, possiamo esprimere questi geni in sistemi cellulari che sono suscettibili di high-throughput screening repellenti candidati. In approcci in silico che usano la modellazione strutturale 7 maggio anche essere utile nel predire quali tipi di composti saranno suscitare forti risposte da specifici recettori.

Composti come DEET, Picaridin, Citronellale e IR3535 hanno dimostrato di respingere in modo efficace le zanzare, comprese le importanti vettori della malattia Aedes aegypti 1,2. Registriamo potenziali d&#39;azione dei neuroni sensoriali associati a specifici sensilla gustativa per determinare le cellule coinvolte con repellenza zanzare. Accoppiato con sequenziamento valle di geni espressi in questi tessuti, possiamo identificare i geni più probabile che mediano le risposte di queste cellule per lo screening di nuovi composti per le capacità repellenza migliorate. RNA-Seq è uno strumento potente, diventando rapidamente standard per il rilevamento delle modifiche temporali e spaziali in espressione genica. RNA-Seq analisi di appendici chemosensoriali insetti e gli organi sono stati utilizzati per scoprire recettori molecolari in diverse specie di insetti 3-5, migliorando notevolmente il convenzionale PCR-ricerche gene per gene 6. Gli insetti rappresentano la classe degli animali più diversi, presentano molte opportunità di studiare la connessione tra geni e fenotipi unici. Tecnologia RNA-seq può essere impiegato su qualsiasi tessuto vivente insetto. Allo stesso modo, la registrazione elettrofisiologica da cellule sensoriali all&#39;interno uniporous sensilli gustativi può essere raggiunto in molte diverse specie di insetti. L&#39;abbinamento di queste due tecniche permette ai ricercatori di restringere i geni coinvolti set in un fenotipo chemosensory osservato. Diverse specie presenteranno sfide specifiche, ma possono informare il collegamento tra i geni dei recettori chemosensoriali e un adattamento chemosensory. Le dimensioni e la morfologia dei chemosensory sensilli è variabile e rendere necessario l&#39;risoluzione dei problemi durante la registrazione di potenziali di azione per ridurre il rumore e identificare segnali ripetibili. Dissezioni di organi chemiosensoriali possono essere banale o delicati e richiede tempo, a seconda della morfologia e dimensioni dell&#39;insetto. Recupero di RNA di alta qualità può richiedere un po &#39;di risoluzione dei problemi e, come ad esempio evitare alcuni pigmenti durantecollezione tessuti. Mentre dimostrare gli effetti dei composti repellenti attraverso studi comportamentali è diretta e informativo, questo approccio è tempo intenso e largo rispetto al meccanismo d&#39;azione. Elettrofisiologia accoppiato con RNA-Seq consente analisi più specifiche su ciò che spinge a comportamenti di evitamento insetti. Una volta che il &quot;toolkit&quot; della discriminazione chimico è stato identificato in una specie di insetti, i tentativi più specifiche per migliorare il repellenti conosciute sono possibili. Recettori e proteine ​​associate a cellule sensoriali responsabili di questi comportamenti possono essere espressi heterologously per lo screening chimico diretta. Inoltre, modellistica molecolare in grado di prevedere quali sostanze chimiche si suscitare reazioni forti da questi recettori 7. L&#39;istantanea di tutti i geni attivi in ​​una serie limitata di tessuti chemosensoriali può anche essere utile per identificare geni simili in altre specie. Utilizzando omologia di sequenza e di espressione similarities, i ricercatori possono formare gruppi di recettori molecolari più probabile che mediano le risposte a repellenti che sono ampiamente efficaci sugli insetti. Vi presentiamo il seguente protocollo per aiutare i ricercatori a decostruire percorsi chemosensoriali insetti e di convincere di più per approfondire la neuroetologia di non-modello e insetti economicamente importanti.

<table><tbody><tr><td>Glass capillary</td><td>A-M Systems</td><td>628000</td><td>Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4&quot;</td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>A-M Systems</td><td>7875</td><td>.015&quot; bare</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>Alfa Products</td><td>369</td><td>0.127 mm diameter</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252</td><td>#5SF Inox</td></tr><tr><td>Refridgerated stage</td><td>BioQuip Products</td><td>1429</td><td>Chill Table</td></tr><tr><td>Preamplifier</td><td>Syntech</td><td>Taste Probe</td><td>preamplifier</td></tr><tr><td>Software for electrophysiology</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td>software for electrophysiology</td></tr><tr><td>TetraMin fish food</td><td>Tetra</td><td>Tropical fish food granules</td><td>fish food ground to fine powder</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA isolation reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Nano Drop Products</td><td>ND-1000</td><td>tabletop spectrometer</td></tr><tr><td>R statistics</td><td>freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)</td><td>www.r-project.org</td><td>Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.</td></tr><tr><td>1.5 ml tube rack</td><td>Evergreen</td><td>240-6388-030</td><td>Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.</td></tr><tr><td>1.5 ml collection tubes with pestle</td><td>Grainger</td><td>6HAX6</td><td>RNase free</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>11178160</td><td>Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST Primer Designing tool</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Le registrazioni in tracce di potenziali d&#39;azione da Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) dimostrare l&#39;efficacia della stimolazione diretta con una gamma di prodotti chimici. Questa tecnica può essere usata per quantificare risposte a qualsiasi sostanza chimica stimolante contando punte di una data ampiezza e durata in un intervallo di tempo ragionevole (generalmente inferiore a 500 ms). Registrazioni Trace devono essere facilmente riproducibili sotto un dato insieme di condizioni sperimentali. In caso contrario, le risposte fisiologiche osservate possono rappresentare fenotipi comuni tra gli individui della specie in esame. Dati RNA-Seq Raw richiede filtrazione e la mappatura precisa, prima di essere presentato come RPKM arrotondato (il numero di mappato legge per lunghezza kilobase di trascrizione per milione letture mappati) o FPKM (il numero di frammenti di lettura per lunghezza kilobase di trascrizione per milione letture mappate) valori numerici (Figura 2). La distinzione traquesti due metodi di normalizzazione RNA-seq è stata descritta in due opere seminali 10,11. Un vantaggio di sequenziamento mRNA totale è la capacità di rilevare l&#39;espressione di grandi famiglie di geni simultaneamente. La presentazione visiva dell&#39;espressione di molti geni permette contemporaneamente per una comprensione unica del set di strumenti molecolare per un dato tessuto. Il confronto tra i sessi, stadi di sviluppo o tipi di tessuto possono essere fatte rapidamente. Replicati biologici per dataset RNA-Seq possono essere limitate dal costo o la difficoltà di raccolta dei tessuti. qRT-PCR offre la possibilità di validare i piccoli sottoinsiemi di espressione genica globale a costi minori e richiede meno RNA fonte. Side by confronto dei dati collaterali (Figura 3A) consentire una maggiore fiducia nei risultati di RNA-Seq, come i due metodi si basano su differenti chimiche per la stima gene abbondanza. Funzioni di equivalenza statistica (Figura 3B) dimostrano i limiti di certezza in ogni caso. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig1highres.jpg" /> Figura 1: Le registrazioni elettrofisiologiche da un sensillum di medie dimensioni sul labello di Ae. femmine aegypti, modificati dal lavoro citato 12. Le tracce mostrano risposte NaCl 100 mM, di saccarosio 100 mm, 1 chinina mM, 0,8% DEET, 0,8% Picaridin, 0,8% e 0,8% Citronellale IR3535. Le tre punte con ampiezze e forme diverse sono etichettati a, b o c. Questi tre picchi corrispondono ai tre sottotipi di neuroni sensoriali con sensibilità diverse: sale, zucchero, e amaro, rispettivamente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Tabella dell&#39;espressione genica del recettore gustativo, come determinato da RNA-Seq per 8 campioni di tessuto, modificato dal lavoro citato 13 celle singole segnalare valori RPKM perciascuna annotazione gene gustativa, tessuti maschili (a sinistra) e tessuti femminili (a destra). I valori numerici sono arrotondati al decimo. Heat-map intensità del colore è limitato a massimo RPKM e il punto medio viene scalato per ogni famiglia di geni singolarmente. C&#39;è solo un gene di famiglia mostrato in questo caso. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52088/52088fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Confronto dei dati qRT-PCR e dati RNA-seq, modificati dal lavoro citato 13 (A) Ogni gene chemorecezione dell&#39;asse orizzontale è rappresentato da due colonne di dati. La colonna di sinistra rappresenta l&#39;espressione relativa come determinato da RNA-Seq; Valori RPKM di geni chemorecezione sono stati divisi da quella gene housekeeping Aaeg LASP generare proporzioni numeriche in questo tessuto. Il dirittocolonna rappresenta espressione relativa come determinato da qRT-PCR. In primo luogo, repliche biologico valori Ct per i geni Labella sono stati normalizzati utilizzando Aaeg LASP come standard. In secondo luogo, replicare valori Ct per ogni gene sono stati utilizzati per calcolare i valori di espressione relativa (bersaglio E - (Ct [destinazione] -Ct [riferimento])). Le barre di errore indicano la deviazione standard dei valori relativi di espressione calcolati singolarmente. (B) RNA-Seq e qRT-PCR set di dati sono stati confrontati in un&#39;analisi separata. Gli assi verticali rappresentano relativa abbondanza gene come dimostrato dai dati RNA-seq, con un valore di 1 è attribuito al gene housekeeping Aaeg LASP e tutti gli altri genica stati segnalati relativi a questo valore. Gli assi orizzontali rappresentano relativa abbondanza gene come previsto da qRT-PCR, con un valore di 1 è attribuito al gene housekeeping Aaeg LASP e tutti gli altri genica stati segnalati relativi a questo valore. Le linee rosse rappresentano l&#39;equivalenza esatta. Le linee tratteggiate rappresentano confini della &#39;zona di somiglianza&#39; per slope, calcolato l&#39;algoritmo di equivalenza statistica 9. Linee nere continue rappresentano la minimi quadrati di regressione di qRT-PCR equivalenza RNA-Seq quantificazione dei 12 geni bersaglio e Aaeg LASP gene housekeeping, ognuno rappresentato da punto dati cerchio. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52088/52088fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Utilizzando due metodi per stimare l&#39;espressione genica nei principali appendici gustative di Aedes aegypti, abbiamo individuato il set di geni putativamente sottostanti le risposte neuronali di composti amari e ripugnanti, come determinato da un esame elettrofisiologico.

Fisiologici Registrazioni e RNA sequenziamento delle appendici gustative del Mosquito febbre gialla<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

8.0K Views.  United States Department of Agriculture.  Utilizzando due metodi per stimare l'espressione genica nei principali appendici gustative di Aedes aegypti, abbiamo individuato il set di geni putativamente sottostanti le risposte neuronali di composti amari e ripugnanti, come determinato da un esame elettrofisiologico. 

Video: Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Ricerca

Neuroscienze

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissezione delle ghiandole salivari e midgut da Ae. aegypti zanzare

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Biologia

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' lines that express the yeast transcription factor GAL4 in a tissue specific manner, with transgenic 'responder' lines carrying a candidate gene/RNA interference construct whose expression is controlled by Upstream Activation Sequences (UAS) that bind GAL4. In the ensuing progeny, the gene or silencing construct is thus expressed in a prescribed spatiotemporal manner, enabling the resultant phenotypes to be assayed and gene function inferred. The binary system enables flexibility in experimental approaches to screen phenotypes generated by transgene expression in multiple tissue-specific patterns, even if severe fitness costs are induced. We have adapted this system for Anopheles gambiae, the principal malaria vector in Africa.
In this article, we provide some of the common procedures used during GAL4-UAS analysis. We describe the An. gambiae GAL4-UAS lines already generated, as well as the cloning of new responder constructs for upregulation and RNAi knockdown. We specify a step by step guide for sexing of mosquito pupae to establish genetic crosses, that also includes screening progeny to follow inheritance of fluorescent gene markers that tag the driver and responder insertions. We also present a protocol for clearing An. gambiae embryos to study embryonic development. Finally, we introduce potential adaptions of the method to generate driver lines through CRISPR/Cas9 insertion of GAL4 downstream of target genes.

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile tool for modification of gene expression in a controlled spatiotemporal manner which permits functional genetic analysis in Anopheles gambiae. The procedures described for using this system are a semi-standardized cloning strategy, sexing and screening of pupae for fluorescent protein markers and embryo fixation.

Utilizzo del sistema GAL4-UAS per la genetica funzionale in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

Genetica

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Elettrofisiologici Registrazione da<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

Nuovi metodi per studiare la codifica gustativa

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Alimentazione e quantificazione del sangue di origine animale e dei pasti artificiali nelle zanzare Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Immunologia e infezioni

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong preference for human hosts over other warm-blooded animals for blood meals. Olfactory cues play a critical role for mosquitoes as they explore their environment and seek a human host to obtain blood meals, thus transmitting human diseases. Odorant receptors (ORs) expressed in the olfactory sensory neurons are known to be responsible for the interaction of mosquito vectors with human odors. To gain deeper insights into Ae. aegypti&#8217;s olfactory physiology and investigate their interactions with humans at the molecular level, we used an optimized protocol of Xenopus Oocytes heterologous expression to functionally analyze Ae. aegypti odorant receptors in response to human odors. Three example experiments are presented: 1) Cloning and synthesizing cRNAs of ORs and odorant receptor co-receptor&#160;(Orco) from four to six days old Ae. aegypti antennae; 2) Microinjection and expression of ORs and Orco in Xenopus oocytes; and 3) Whole-cell current recording from Xenopus oocytes expressing mosquito ORs/Orco with a two-electrode voltage-clamp. These optimized procedures provide a new way for researchers to investigate human odor reception in Aedes mosquitoes and reveal the underlying mechanisms governing their host-seeking activity at a molecular level.

<meta charset="utf8"></head><body>Espressione eterologa e analisi funzionale dei recettori odorosi di Aedes aegypti per gli odori umani negli ovociti di Xenopus

A protocol is presented that functionally characterizes mosquito ORs in response to human odors using a Xenopus oocyte expression system coupled with a two-electrode voltage clamp, providing a powerful new technique for exploring the responses of mosquitoes ORs to exposure to human odors.

Espressione eterologa e analisi funzionale dei recettori odorosi di Aedes aegypti per gli odori umani negli ovociti di Xenopus

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when acquiring a blood-meal. To locate a host to feed on, mosquitoes rely on a wide range of sensory cues, including visual, mechanical, thermal, and olfactory. The study details a technique, electroantennography (EAG), that allows researchers to assess whether the mosquitoes can detect individual chemicals and blends of chemicals in a concentration-dependent manner. When coupled with gas-chromatography (GC-EAG), this technique allows to expose the antennae to a full headspace/complex mixture and determines which chemicals present in the sample of interest, the mosquito can detect. This is applicable to host body odors as well as plant floral bouquets or other ecologically relevant odors (e.g., oviposition sites odorants). Here, we described a protocol that permits long durations of preparation responsiveness time and is applicable to both female and male mosquitoes from multiple genera, including Aedes, Culex, Anopheles, and Toxorhynchites mosquitoes. As olfaction plays a major part in mosquito-host interactions and mosquito biology in general, EAGs and GC-EAG can reveal compounds of interest for the development of new disease vector control strategies (e.g., baits). Complemented with behavioral assays, the valence (e.g., attractant, repellent) of each chemical can be determined.

The present article details a step-by-step protocol for successful and low noise electroantennograms in several genera of mosquitoes, including both females and males.

Una guida passo-passo all'elettroantennography delle zanzare

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Fisiologici Registrazioni e RNA sequenziamento delle appendici gustative del Mosquito febbre gialla

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae

Dissezione delle ghiandole salivari e midgut da Ae. aegypti zanzare

Utilizzo del sistema GAL4-UAS per la genetica funzionale in Anopheles gambiae

Elettrofisiologici Registrazione da

Nuovi metodi per studiare la codifica gustativa

Alimentazione e quantificazione del sangue di origine animale e dei pasti artificiali nelle zanzare Aedes aegypti

Espressione eterologa e analisi funzionale dei recettori odorosi di Aedes aegypti per gli odori umani negli ovociti di Xenopus

Espressione eterologa e analisi funzionale dei recettori odorosi di Aedes aegypti per gli odori umani negli ovociti di Xenopus

Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre,

Una guida passo-passo all'elettroantennography delle zanzare