Name: real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 e P3013330 dal National Institutes of Health. Vorremmo ringraziare Michele Houston, Elena Dhima e Dott.ssa Anna Velcich per i loro preziosi commenti nello sviluppo del protocollo di isolamento cripta. Ringraziamo anche la formazione del diabete e Centro di Ricerca del Albert Einstein College of Medicine sostenuto da NIH P60DK20541, e il dottor Michael Brownlee e il dottor Xue Liang-Du, che dirigono e operano la struttura Seahorse, rispettivamente.

Questo studio è stato eseguito in conformità con le raccomandazioni nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla commissione etica della sperimentazione animale del Albert Einstein College of Medicine. 1. Isolamento Cripta e Cultura <ol><li> Isolamento delle Cripte dal piccolo intestino: <ol><li> Isolare cripte intestinali da qualsiasi modello di topi di interesse. Eutanasia i topi con CO 2 seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Aprire l&#39;addome longitudinalmente e riempire il piccolo intestino (SI) con soluzione fisiologica fredda ghiaccio fosfato tamponata, PBS (-Ca 2+; -Mg 2+) con 2x antibiotico-antimicotico (anti-anti). Rapidamente isolare piccolo intestino. </li><li> Sezionare completamente privo di grasso mesenterico con un bisturi. Fare attenzione a non forare il tessuto - in ogni momento mantenere il tessuto umido con ghiaccio PBS freddo. Aprite inteStine longitudinalmente e lavare accuratamente con ghiaccio freddo PBS. </li><li> Tagliare piccolo intestino in due sezioni e appiattire con una punta di cotone bagnato, delicatamente raschiare il villi con una diapositiva pre-raffreddata. Lavare vigorosamente in PBS freddo più volte. </li><li> Incubare 3 minuti in 20 ml di PBS 1x per 3 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) /0.5 mM ditiotreitolo (DTT) per la dissociazione non enzimatica del tessuto. </li><li> Tagliare il tessuto in piccoli pezzi (2-4 mm) usando una lama di rasoio su un vetrino pre-raffreddato. Trasferire i pezzi in un tubo da 50 ml contenente 20 ml di PBS freddo ghiaccio. </li><li> Pipettare su e giù delicatamente 10x con un 10 ml sterile, pipetta monouso. Lasciate che frammenti di tessuto sedimentano per gravità. Rimuovere il surnatante con una pipetta. Ripetere altre tre volte; assicurarsi che il surnatante è chiaro. </li><li> Aggiungere 20 ml di PBS per 2 mM EDTA. Turbinio e incubare a 4 ° C per 30 minuti con dolce dondolio. </li><li> Lasciate sedimenti tessuti ed eliminare il surnatante. Aggiungere 15 ml di PBS freddo ghiaccio e pipettasu e giù 5x con una pipetta 10 ml. Lasciate che i frammenti di tessuto sedimenti e raccogliere il surnatante come Frazione 1 (F1). Ripetere la raccolta di F2-F5, ogni frazione mantenuto separatamente. </li><li> Aggiungere 15 ml di ghiaccio PBS freddo e questa volta agitare vigorosamente a mano per 15 secondi. Raccogliere F6 e ripetere per F7, F8. Se i pezzi di tessuto cominciano a galleggiare, toccare per aiutarli a stabilirsi. </li><li> Controllare un&#39;aliquota di ciascuna frazione al microscopio. In comune le frazioni contenenti cripte. </li><li> Passare le frazioni aggregati attraverso un filtro 70 micron cellule di nylon, raccogliendo cripte in un tubo da 50 ml. </li><li> Centrifugare a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di PBS freddo ghiaccio con 2x cripte anti-anti e trasferirli in una provetta da 15 ml. Ripetere il lavaggio ancora una volta. </li><li> Lavare le cripte una volta con 10 ml ghiacciata ADF, avanzata DMEM / F-12 (Dulbecco &quot;s Modified Eagle Medium / Ham&quot; s F-12) - 2x anti-anti. </li><li> Lavare le cripte una volta con 10 ml ADF - 1x anti-anti. </li><li> Contare le cripte con un emocitometro. Regolare il volume della soluzione cripta e trasferire in una provetta da 1,5 ml in modo che la concentrazione finale quando cripta risospeso sarà 100-500 cripte per 50 ml di miscela proteica gelatinosa (Matrigel). Centrifugare a 100 xg per 5 min a 4 ° C e risospendere cripte nella miscela proteica gelatinosa. </li><li> Tavola 50 ml di sospensione gelatinosa cripta - miscela proteica per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti (area di crescita: 2 cm 2), ponendo attenzione la goccia di sospensione al centro di ciascun pozzetto. Mantenere la piastra in una di CO 2, 37 ° C incubatore per ~ 30 minuti fino a quando la sospensione si solidifica. </li><li> Aggiungere 500 supporti freddo ghiaccio cultura completa ml (ottimo DMEM / F12 con 1x contro - contro, 10 mM 4- (2-idrossietil) -1 acid-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1x Glutamax, 1x B27 supplemento, 1x N2 Supplement, 1 mM N-acetil-L-cisteina (NAC), 50 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF), 100 ng / mlZucca, 500 ng / ml R-spondina). <ol><li> Ricostituire fattori di crescita nello 0,1% albumina sierica bovina (BSA) in PBS. </li></ol></li></ol></li><li> Cripta organoide cultura e del passaggio: <ol><li> Passaggio organoidi cripta 14-21 giorni dopo la semina (o secondo necessità) come segue: <ol><li> Cambia i media ogni venerdì e lunedì. Il mercoledì, sostituire la metà della media con mezzi freschi. </li></ol></li><li> Rimuovere il terreno di coltura. Lavare il campione due volte con 500 microlitri di PBS a intervalli di 5 min. </li><li> Rimuovere PBS e rompere delicatamente la miscela proteica gelatinosa con un P1000 sterile punta micro pipetta. </li><li> Aggiungi terreni di coltura 1 ml completa di un singolo pozzo e risospendere le organoidi in 1 ml di media. </li><li> Interrompere delicatamente i organoidi con un P1000 pipettando su e giù 20-30x (controllare sotto il microscopio per una corretta dissociazione organoide con una buona resa cripta, fino a quando una tecnica consistente si sviluppa). </li><li> Trasferire le cripte in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml;centrifugare a 100 xg a 4 ° C, 5 min. </li><li> Lavare il pellet due volte con 1 ml di terreno di coltura completo. </li><li> Split a un rapporto di 1: 3 o 1: 6 come necessario, cripte risospeso in 50 microlitri Matrigel per pozzetto. Procedere come descritto in precedenza (sezione 1.1.16-18). </li></ol></li><li> Cripta di congelamento organoide: <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura. Lavare il campione in 500 l di PBS. </li><li> Disperdere la miscela proteica gelatinosa con una punta P1000 pipetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di media per un singolo pozzo e risospendere le organoidi in 1 ml di media. </li><li> Rompere delicatamente le organoidi con un P1000 pipettando su e giù 20-30x. </li><li> Trasferire i organoidi in una provetta da 1,5 ml. Centrifugare a 100 xga 4 ° C, 5 min. </li><li> Lavare il pellet due volte con 1 ml di terreno di coltura completo. </li><li> Cripte risospendere in 500 microlitri di congelamento media. </li><li> Trasferimento cripte ad un cryotube, posizionare il tubo in un contenitore di congelamento e conservare in freezer -80 ° C overnight. </li><li> Trasferimento cripte di liquido N 2 serbatoio. <ol><li> Recuperare organoidi cripta congelati rapidamente scongelamento in un bagno a 37 ° C Acque. Lavare con 500 microlitri mezzi di coltura completo una volta, centrifugare a 100 xg, 5 min e risospendere in miscela proteica gelatinosa e cultura come descritto sopra. Per una migliore ripresa, aggiungere inibitore ROCK (Y-27632) per il supporto di congelamento. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Cripta organoide Metabolismo Assay <ol><li> 24-ben Preparazione del piatto: <ol><li> Isolare e contare cripte secondo il protocollo (vedere la sezione 1.1 per l&#39;isolamento cripta e la sezione 1.2 per il passaggio cripta). </li><li> Cripte Risospendere in miscela proteica gelatinosa (100-200 cripte per 20 ml). </li><li> Piastra cripta-gelatinosa sospensione miscela proteica in una piastra a 24 pozzetti test (assicurarsi che non vi siano almeno triplicato per ogni campione) e permettono la sospensione a solidificare a 37 ° C in CO 2incubatore; quindi aggiungere 500 microlitri Terreni di coltura completo. </li><li> Cripte cultura (come descritto nella sezione 1.1) e osservare al microscopio fino cripte crescere in organoidi completamente sviluppati. </li></ol></li><li> Extracellulare Flux saggio: <ol><li> Cartuccia Hydrate durante la notte in un non-CO 2 (0% CO 2), 37 ° C incubatore. </li><li> Rimuovere il terreno di coltura e lavare organoidi due volte con 500 microlitri DMEM (senza: glucosio, L-glutamina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, e con: rosso fenolo). Attendere 5 min. </li><li> Aggiungere 675 ml per medie dimensioni, ben dosaggio (DMEM con 2 mM L-glutammina e 5 mm D-glucosio) in ciascun pozzetto. </li><li> Controllare cripta organoidi morfologia microscopica per garantire che organoidi e miscela proteica gelatinosa sono intatti dopo i lavaggi. Incubare 1 ora in un non-CO 2, 37 ° C incubatore. </li><li> Preparare 10 mM composti iniettabili (oligomicina, cianuro di carbonile-p-trifluoro-metossi-fenil-idrazone (FCCP), rotenone) nel terreno di coltura. </li><li> Set-up della cartuccia caricando 75 ml di 10 micron composti iniettabili nei porti della sequenza della cartuccia: Port A - oligomicina; Port B - FCCP; e Port C - rotenone (Le concentrazioni finali durante il test sarà di 1 micron). </li><li> Incubare cartuccia 30 min - 1 ora a 37 ° C in un non-CO 2 incubatore. </li><li> Allo stesso tempo, attivare la XF Analyzer e creare il modello di protocollo del test. </li><li> Posizionare la cartuccia e la piastra di utilità in XF Analyzer ed eseguire &quot;calibrare&quot; cartuccia. </li><li> Controllare organoidi cripta al microscopio per assicurarsi che essi sono attaccati alla miscela proteica gelatinosa. </li><li> Cella di carico piastra di coltura nel protocollo dello strumento ed eseguire test. </li></ol></li></ol>

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Abbiamo testato il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) delle cripte isolate da 8 mesi topi e cresciuti in organoidi ex vivo. Dopo la misurazione del tasso basale, il metabolismo cripta è stata valutata con l&#39;aggiunta di oligomicina, il cianuro di carbonile -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) e rotenone, in sequenza. Basale OCR e ECAR basale sono stati registrati 0-29 min (Figura 2A e 2B). Al 29 min, oligomicina (dalla porta A) è stato iniettato in ciascun pozzetto (n = 3, sia per cripte e pozzetti di controllo). Oligomicina è un inibitore della sintesi di ATP. E &#39;usato per prevenire stato 3 (fosforilante) la respirazione. Così, oligomicina iniezione determinato una lieve riduzione OCR, dovuta al blocco della sintesi di ATP nei mitocondri, e le cripte commutato glicolisi per soddisfare la loro richiesta di ATP con un conseguente aumento ECAR. Al 64 ° min, FCCP (from porta B) è stato iniettato in ciascun pozzetto. FCCP è un vettore ione mobile, trasporto di ioni idrogeno attraverso la membrana mitocondriale, con conseguente consumo di energia rapida senza necessità di produzione di ATP. OCR è aumentato a causa di disaccoppiamento e ECAR aumentate dopo le cripte hanno mantenuto la loro bilancio energetico con l&#39;impiego glicolisi per produrre ATP, in tal modo la sintesi e la secrezione di acido lattico. Al 99 ° min, rotenone (dal porto C) è stato iniettato in ciascun pozzetto. Rotenone è un inibitore mitocondriale. Pertanto, la terza iniezione portato ad una diminuzione OCR causa alterata funzione mitocondriale e spostato cripte ad uno stato più glicolitico mantenendo i valori ecar elevati. Ci sono due conclusioni principali: 1) organoidi cripta da 8 mesi i topi sono stati coltivati ​​con successo attraverso più passaggi; 2) organoidi che era stato posto in coltura per 2 mesi dopo la derivazione mostrato una risposta metabolica a oligomicina, cianuro di carbonile-p-trifluoromethoxyphen<html> ylhydrazone e rotenone. In questo modo, la capacità di glicolitico organoidi era stabile dopo 2 mesi in cultura, in linea con la relazione che organoidi da topi calorico limitati sono relativamente adattati in modo permanente alla crescita diverso e fenotipi metabolici nella cultura 12. Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo saranno di grande importanza per gli studi metabolici di cripte intestinali. Il protocollo per l&#39;isolamento cripta è adattato da Sato et al. 10 Il protocollo per lo studio del metabolismo cripta in piccoli intestinali culture organoide cripta utilizzando la tecnologia di analisi bioenergetica non e &#39;stato segnalato. Gli studi sul metabolismo organoide cripta può essere esteso ulteriormente l&#39;introduzione di diverse variabili ai terreni di coltura e condizioni di analisi, come ad esempio diverse fonti di energia, inibitori e attivatori di segnalazione specifica e vie metaboliche, e le condizioni di ipossia che possono modulare vie metaboliche. ONTENUTO &quot;&gt; Ci sono problemi tecnici che richiedono una particolare attenzione quando si applicano questi protocolli. numero Cripta e l&#39;efficienza crescita di colture organoide cripta possono variare a seconda della fonte cripta, ad esempio, cripte di geneticamente modificato contro topi wild type. Pertanto, densità di semina cripta può essere regolata per esperimenti di esecuzione di un processo. Inoltre, cripte e organids hanno una forte tendenza ad aderire alle superfici. Per i rendimenti migliori, tutte le provette (1.5 ml, 15 ml e 50 ml tubi), pipette e puntali per pipette possono essere rivestiti con siero fetale bovino 1% in tampone fosfato salino a 4 ° C per una notte. I risultati possono essere normalizzati alla concentrazione totale di proteine ​​usando l&#39;acido bicinconinico (BCA) Test. Dopo il test metabolico, la piastra a 24 pozzetti è mantenuto in ghiaccio fino al BCA dosaggio. Per il saggio BCA, cripte vengono dolcemente lavate in 500 ml PBS freddo tre volte e lisate in 75 ml di 0,1 N NaOH in PBS seguita da vigorosa agitazione per 1 ora a temperatura ambiente. Una pipetta P1000 possonoessere utilizzato per rompere la miscela proteica gelatinosa e pipettaggio su-giù promuove lisi. Dopo la lisi cripta, il protocollo del test BCA standard per le celle può essere seguito. E &#39;importante avere &quot;solo&quot; Matrigel pozzetti di controllo durante l&#39;analisi bioenergetica per misurare la concentrazione di proteine ​​di fondo in questi pozzetti e quindi di valutare la concentrazione proteica cripta con precisione mediante il saggio BCA. Cripta studi sul metabolismo organoide presentati possono essere applicati a mini-budella epiteliali normali e pazienti derivato di esplorare il programma di utilità per la valutazione precoce del rischio di malattia relativo e approcci che possono modulare il fenotipo metabolico e ridurre il rischio quindi. I saggi metabolici descritti introducono nuove strategie per l&#39;eventuale valutazione del rischio relativo per lo sviluppo della malattia e per la diagnosi precoce di stato di malattia, la sua dissezione biochimica e molecolare e il potenziale di modulazione. In sintesi, si descrive un protocollo dettagliato per isolare piccole intestinacripte e l organoidi cultura cripta. Inoltre, si introduce un nuovo metodo per utilizzare cripta organoide cultura per determinare i tassi di acidificazione e di consumo di ossigeno extracellulari di studiare il metabolismo energetico cripta organoide. Ex vivo cripta organoide cultura metabolica profiling studi definirà nuove strategie per la comprensione della biologia intestinale.

Cancro del colon-retto (CRC) è la terza causa di decessi per cancro correlati negli Stati Uniti. Cancro del colon sporadica - vale a dire che derivanti nel corso della vita (&gt; 50 anni di età) e senza fattori predisponenti genetici chiare - conti per ~ 80% di tutti i casi, con un&#39;incidenza fortemente influenzata da abitudini alimentari a lungo termine 1,2. Questi tumori presentano uno spostamento metabolico verso dipendenza glicolisi ossidativa, noto come effetto Warburg, che può in parte rendere concentrazioni elevate di particelle elementari cellulari e di energia disponibili (attraverso glutaminolysis) permettere e forse guidare alti tassi di proliferazione delle cellule tumorali 3-5 . Studi di tumore del colon e altri tumori gastrointestinali, inclusi piccoli tumori intestinali fornire informazioni importanti sulle cause della formazione di tumori. Indagare le differenze metaboliche tra gli stati normali, pro-tumorali e tumorali di sistemi di organi gastrointestinali possono aiutare detine di rischio relativo per lo sviluppo del tumore e la diagnosi precoce della neoplasia. Inoltre, la comprensione del metabolismo bioenergetico che coinvolge la respirazione mitocondriale e la glicolisi si forniscono informazioni fondamentali sul modo in cui la fisiologia delle cellule, l&#39;invecchiamento e la malattia lo stato perturba l&#39;omeostasi intestinale. L&#39;utilizzo della tecnologia bioenergetica test per l&#39;analisi del flusso extracellulare in grado di valutare i tassi di respirazione mitocondriale e glicolisi contemporaneamente in cellule in crescita in coltura in tempo reale 6,7. Fino a poco tempo, studi in vitro di tenue sono stati limitati a linee cellulari derivate da tumori benigni o maligni 8,9 e non rappresentano la fisiologia dei normali epiteli intestinali e l&#39;influenza del microambiente in cui risiedono. Nel 2009, Sato et al. 10 ha introdotto un sistema ex vivo della cultura a crescere tridimensionale (3D) del mouse intestinali organoidi epiteliali, o epithelial &quot;mini-coraggio&quot;, adatto a fini sperimentali, diagnostiche e terapeutiche indagini 10,11. Inoltre, cripte isolate da topi calorico limitati mantengono le loro proprietà di crescita alterati come organoidi in tali colture 12. Rispetto a linee cellulari trasformate, culture organoide cripta possono essere utilizzati per generare dati fisiologicamente rilevanti che presentano un modello molto meglio comprendere lo stato in vivo. Abbiamo adattato la tecnologia di analisi bioenergetica per saggiare il metabolismo energetico di organoidi cripta intestinale. Mouse organoidi cripta intestinale sono state coltivate ex vivo per lo sviluppo degli studi cripta metabolismo energetico organoide presentati. Il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) di organoidi cripta sono stati misurati in assenza e in presenza di due diversi inibitori metabolici (oligomicina, rotenone) e un vettore di ioni (Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone). L&#39;orga criptarisposta metabolica noid a questi composti chimici sono riflessi con successo attraverso la modifica ECAR e valori OCR. Studi bioenergetici cellulari potranno chiarire le reciproche interazioni tra stato metabolico e rischio di malattia e fenotipo nel cancro, obesità, diabete, malattie metaboliche e le malattie mitocondriali e contribuire a metodi di screening anticipo aventi implicazioni dirette per la medicina traslazionale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare piccole cripte intestinali e alla cultura organoidi cripta. Inoltre, si introduce un nuovo metodo per usare le culture organoide cripta per le analisi metaboliche.

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;prime;s Modified Eagle&amp;prime;s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - &lt;strong&gt;step 2.2.2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Final concentration 1x or 2x</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin, liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; GlutaMAX&amp;trade; supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Final concentration 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetyl-L-cysteine, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Final concentration 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 supplement, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&amp;reg; supplement minus Vitamin A, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 &amp;mu;g</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Final concentration 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Murine EGF, 100 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Final concentration 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Murine Noggin, 20 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Final concentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; L-glutamine, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Final concentration 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; glucose powder</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Final concentration 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&amp;reg; 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Final concentration 3 mM for &lt;strong&gt;step 1.1.5&lt;/strong&gt;; 2 mM for &lt;strong&gt;step 1.1.8&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Final concentration 3 mM</td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0.1% in PBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% in PBS</td></tr><tr><td>Recovery&amp;trade; Cell Culture Freezing Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Final concentration 10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Final concentration 0.1 N in PBS</td></tr><tr><td>XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

La mucosa dell&#39;intestino tenue presenta un&#39;architettura ripetitiva organizzata in due strutture fondamentali: villi, sporgenti nel lume intestinale e composti da enterociti maturi, cellule caliciformi e cellule enteroendocrine; e cripte, che risiedono in prossimità del sottomucosa e muscolare, l&#39;ospitare staminali adulte e cellule progenitrici e cellule mature Paneth, così come stromali e cellule del sistema immunitario del microambiente cripta. Fino agli ultimi anni, studi in vitro di piccolo intestino era limitato a linee cellulari derivate da tumori benigni o maligni, e non rappresentano la fisiologia dei normali epiteli intestinali e l&#39;influenza del microambiente in cui risiedono. Qui, dimostriamo un metodo adattato da Sato et al. (2009) per la coltura di organoidi cripta del mouse intestinali primarie derivate da topi C57BL / 6. Inoltre, vi presentiamo l&#39;uso di colture organoide cripta di saggiare il profilo metabolico cripta in tempo reale per misurazione del consumo basale di ossigeno, glicolisi, la produzione di ATP e la capacità respiratoria. Organoidi mantengono proprietà definite per la loro origine e conservano gli aspetti del loro adattamento metabolico riflessa dal consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare. In tempo reale studi metabolici in questo organoide sistema di coltura cripta sono un potente strumento per studiare il metabolismo energetico organoide cripta, e come possono essere modulati da fattori nutrizionali e farmacologici.

Organoidi cripta sono state stabilite da 8 mesi C57BL / 6 topi nutriti purificato roditore dieta American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Organoidi cripta intestinali possono essere coltivate in coltura per lunghi periodi da un unico crypt (Figura 1A, singola freccia rossa). Organoidi crescono strutture cripta-come in 18-20 giorni in coltura (Figura 1B, frecce rosse). Cripte sono stati diversi passaggi ogni 3 settimane e organoidi recuperati in modo efficiente dopo ogni passaggio. Seahorse strumentazione bioenergetica in grado di valutare i tassi di respirazione mitocondriale e glicolisi contemporaneamente in cellule in crescita in coltura in tempo reale. Abbiamo adattato questa tecnologia per eseguire il test del metabolismo organoide cripta. Con organoidi derivate da topi nutriti AIN76A dieta purificata per 8 mesi, abbiamo misurato:. 1 tasso di consumo di ossigeno, OCR mostrato nella Figura 2A - linea rossa che rappresenta il tasso di consumo di ossigeno (pmol / min) in organoidi cripta, il blu è thpozzi e di controllo solo con Matrigel (miscela proteica gelatinosa); 2. tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) mostrato in Figura 2B - linea rossa che rappresenta tasso di acidificazione extracellulare (mph / min) in organoidi cripta, il blu è pozzetti di controllo solo con la miscela proteica gelatinosa. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52026/52026fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1:. Organoidi Cripta derivati ​​da 8 mesi vecchi topi C57BL / 6 cripte sono (A) 2-giorni o (B) 18-giorni di coltura. Scala: 100 micron. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52026/52026fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2: bioenergetica dosaggio con organoidi derivati ​​da 8 mesi vecchi topi C57BL / 6. (A) tasso di consumo di ossigeno (OCR) è indicato; <strong&gt; viene mostrato (B) tasso di acidificazione extracellulare (ECAR). Legenda: rosso - cripte, blu - di controllo, solo Matrigel. n = 3. Reagenti iniettati sequenziale - indicato dalle barre verticali blu - sono i seguenti: A, oligomicina; B, Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone (FCCP); C, rotenone.

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Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Piccoli organoidi cripta intestinali in coltura ex vivo fornire un sistema di coltura tessuto che racchiude in sintesi la crescita delle cripte dipendenti sulle cellule staminali e la loro nicchia. Abbiamo stabilito un metodo per dosare il profilo metabolico in tempo reale in organoidi cripta del mouse primario. Abbiamo trovato organoidi mantengono le proprietà fisiologiche definite dalla loro fonte.

Real Time Analisi di profilo metabolico in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture del mouse intestinale Cripta organoide

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

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Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

16.2K Views.  Albert Einstein College of Medicine.  Piccoli organoidi cripta intestinali in coltura ex vivo fornire un sistema di coltura tessuto che racchiude in sintesi la crescita delle cripte dipendenti sulle cellule staminali e la loro nicchia. Abbiamo stabilito un metodo per dosare il profilo metabolico in tempo reale in organoidi cripta del mouse primario. Abbiamo trovato organoidi mantengono le proprietà fisiologiche definite dalla loro fonte. 

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Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

Coltura tridimensionale di cripte coloniche murine per studiare ex vivo la funzione delle cellule staminali intestinali

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Ricerca sul cancro

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Immunologia e infezioni

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

Un sistema di coltura di organi intestinali intestinali per l'analisi delle interazioni ospite-microbiota

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Biologia

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in response to infection or injury at the mucosal level as they are involved in antimicrobial responses and wound healing. They are also critical secondary messengers, regulating several pathways, including cell growth and differentiation. On the other hand, excessive ROS levels lead to oxidative stress, which can be deleterious for cells and favor intestinal diseases like chronic inflammation or cancer. This work provides a straightforward method to detect ROS in the intestinal murine organoids by live imaging and flow cytometry, using a commercially available fluorogenic probe. Here the protocol describes assaying the effect of compounds that modulate the redox balance in intestinal organoids and detect ROS levels in specific intestinal cell types, exemplified here by the analysis of the intestinal stem cells genetically labeled with GFP. This protocol may be used with other fluorescent probes.

The present protocol describes a method to detect reactive oxygen species (ROS) in the intestinal murine organoids using qualitative imaging and quantitative cytometry assays. This work can be potentially extended to other fluorescent probes to test the effect of selected compounds on ROS.

Analisi dello stress ossidativo negli organoidi intestinali murini utilizzando la sonda fluorogenica sensibile alle specie reattive dell'ossigeno

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Coltura 3D di Organoidi da Cripte Intestinali Murine e Singola Cellula Staminale

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Autore in primo piano: La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Real Time Analisi di profilo metabolico in

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Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

Coltura tridimensionale di cripte coloniche murine per studiare ex vivo la funzione delle cellule staminali intestinali

Il

Un sistema di coltura di organi intestinali intestinali per l'analisi delle interazioni ospite-microbiota

Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Analisi dello stress ossidativo negli organoidi intestinali murini utilizzando la sonda fluorogenica sensibile alle specie reattive dell'ossigeno

La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi

La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi

La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi