Este estudo foi apoiado por subsídios SR1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 e P3013330 do National Institutes of Health. Gostaríamos de agradecer a Michele Houston, Elena Dhima e Dr. Anna Velcich por seus valiosos comentários no desenvolvimento do protocolo de isolamento cripta. Agradecemos também a Formação Diabetes e Centro do Albert Einstein College of Medicine apoiado pelo NIH P60DK20541 Research, e Dr. Michael Brownlee e Dr. Xue Liang-Du, que dirigem e operar as instalações do cavalo marinho, respectivamente.

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal do Albert Einstein College of Medicine. 1. Crypt Isolamento e Cultura <ol><li> O isolamento das criptas do intestino delgado: <ol><li> Isolar criptas intestinais de qualquer modelo de ratos de interesse. Euthanize os ratos com CO 2, seguida por deslocação cervical. </li><li> Abra o abdômen longitudinalmente e encher o intestino delgado (SI) com soro fisiológico frio gelo fosfato tamponada, PBS (-Ca 2+; Mg 2+) com 2x antibiótico-antimicótico (anti-anti). Rapidamente isolar intestino delgado. </li><li> Completamente dissecar livre de gordura mesentérica usando um bisturi. Tenha cuidado para não perfurar o tecido - em todos os momentos manter o tecido úmido com PBS gelado. Abra-se inteStine longitudinalmente e lavar cuidadosamente com PBS gelado. </li><li> Corte intestino delgado em duas seções e achatar usando uma ponta de algodão molhado, raspe fora as vilosidades usando uma lâmina pré-resfriada. Lave vigorosamente em PBS gelado várias vezes. </li><li> Incubar 3 min, em 20 ml de 1x PBS por 3 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) /0.5 mM de ditiotreitol (DTT) para a dissociação não-enzimática do tecido. </li><li> Corte o tecido em pedaços pequenos (2-4 mm), usando uma lâmina de barbear em uma lâmina pré-resfriada. Transferem-se as peças em um tubo de 50 ml contendo 20 ml de PBS gelado. </li><li> Pipeta cima e para baixo suavemente 10x utilizando uma pipeta de 10 ml descartável estéril. Vamos fragmentos de tecido sedimentar por gravidade. Retirar o sobrenadante com uma pipeta. Repita mais três vezes; certifique-se sobrenadante é clara. </li><li> Adicionar 20 ml de PBS por EDTA 2 mM. Redemoinho e incubar a 4 ° C durante 30 min com agitação suave. </li><li> Deixe sedimento de tecido e descartar o sobrenadante. Adicionar 15 ml de PBS gelado e pipetacima e para baixo de 5x com uma pipeta de 10 ml. Deixe os fragmentos de tecido de sedimentos e recolher o sobrenadante como Fração 1 (F1). Repetir recolha F2-F5, mantidas separadamente cada fracção. </li><li> Adicionar 15 ml de PBS gelado e desta vez agitar vigorosamente à mão por 15 segundos. Colete F6 e repita para F7, F8. Se pedaços de tecido começar a flutuar, toque para ajudá-los a resolver. </li><li> Inspeccionar uma aliquota de cada fracção sob o microscópio. Reunir as fracções contendo criptas. </li><li> Passar as fracções reunidas através de um filtro de células de 70 mm de nylon, recolhendo criptas em um tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml de PBS gelado com criptas anti-anti 2x e transferência para um tubo de 15 ml. Repetir a lavagem mais uma vez. </li><li> Lave as criptas uma vez com 10 ml gelada ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco &quot;s Modified Eagle Medium / Ham&quot; s F-12) - 2x anti-anti. </li><li> Lavam-se as criptas uma vez com 10 ml UmaDF - 1x anti-anti. </li><li> Conte as criptas utilizando um hemocitômetro. Ajustar o volume da solução cripta e transferir para um tubo de 1,5 ml, de modo que a concentração final quando cripta ressuspensas será 100-500 criptas por cada 50 uL de mistura de proteína gelatinosa (Matrigel). Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C e colocar a mistura em criptas proteína gelatinosa. </li><li> Placa 50 ul de suspensão cripta - mistura gelatinosa proteína por poço numa placa de 24 poços (área de crescimento: 2 cm2), colocando cuidadosamente gota a suspensão no centro de cada poço. Manter a placa numa CO 2, 37 ° C incubadora durante ~ 30 min, até que a suspensão se solidifica. </li><li> Adicionar 500 ul meios de gelo frio de cultura completo (Avançada DMEM / F12 com 1x anti - anti, 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES), GlutaMAX 1x, 1x suplemento B27, 1x suplemento N2, 1 mM N-acetil-L-cisteína (NAC), / ml de factor de crescimento epidérmico 50 ng (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml de R-espondina). <ol><li> Reconstituir factores de crescimento em 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS. </li></ol></li></ol></li><li> Crypt organóide Cultura e Passage: <ol><li> Passagem Organóides criptas 14-21 dias após sementeira (ou conforme necessário) como se segue: <ol><li> Alterar mídia toda sexta-feira e segunda-feira. Às quartas-feiras, substitua metade da media com meio fresco. </li></ol></li><li> Remover o meio de cultura. Lava-se a amostra duas vezes com 500 ul de PBS a intervalos de 5 min. </li><li> Remover PBS e quebrar delicadamente até a mistura gelatinosa de proteína usando um P1000 estéril micro ponteira. </li><li> Adicionar 1 ml de meio de cultura completo para um único poço e ressuspender as Organóides em 1 ml de meio. </li><li> Gentilmente interromper as Organóides usando um P1000 por pipetagem cima e para baixo 20-30x (verifique sob o microscópio para a dissociação organóide adequada com um bom rendimento cripta até uma técnica consistente é desenvolvido). </li><li> Transferem-se as criptas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml;centrifugar a 100 xg a 4 ° C, 5 min. </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com 1 ml de meio de cultura completo. </li><li> Dividir a uma razão de 1: 3 ou 1: 6, conforme necessário, ressuspensão criptas em 50 ul por poço de Matrigel. Proceda como descrito acima (seção 1.1.16-18). </li></ol></li><li> Crypt congelamento organóide: <ol><li> Remover o meio de cultura. Lavar a amostra em 500 mL de PBS. </li><li> Dispersa-se a mistura gelatinosa de proteína utilizando uma ponta de pipeta P1000. </li><li> Adicionar 1 ml de mídia para um único poço e voltar a suspender as Organóides em 1 ml de mídia. </li><li> Cuidadosamente, quebre os Organóides usando um P1000 por pipetagem cima e para baixo 20-30x. </li><li> Transfira os Organóides a um tubo de 1,5 ml. Centrifuga-se a 100 xg a 4 ° C, 5 min. </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com 1 ml de meio de cultura completo. </li><li> Criptas Ressuspender em 500 mL de mídia congelamento. </li><li> Criptas transferência para um tubo criogénico, colocar o tubo em um recipiente e loja de congelação de -80 ° C congelador overnight. </li><li> Transferir para criptas N2 líquido do tanque. <ol><li> Recuperar Organóides cripta congeladas pelo rápido degelo em um banho de água a 37 ° C. Lava-se com 500 ul meios de cultura completo uma vez, centrifugar a 100 xg, 5 min e ressuspender em mistura gelatinosa de proteína, e da cultura como descrito acima. Para uma melhor recuperação, adicione inibidor ROCHA (Y-27632) para a mídia congelamento. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Crypt organóide Metabolismo Ensaio <ol><li> 24 poços Preparação Plate: <ol><li> Isolar e contar criptas de acordo com o protocolo (ver secção 1.1 para isolamento cripta e 1.2 para a passagem cripta). </li><li> Criptas Ressuspender em mistura de proteína gelatinosa (100-200 criptas por 20 l). </li><li> Placa de suspensão mistura de proteínas cripta-gelatinoso numa placa de 24 poços de ensaio (certificar-se de que há pelo menos três repetições para cada amostra) e permitir que a suspensão para solidificar a 37 ° C num CO 2incubadora; em seguida, adicione 500 mL de meios de cultura completo. </li><li> Criptas Cultura (conforme descrito na seção 1.1) e observar ao microscópio até criptas crescer em Organóides totalmente desenvolvidos. </li></ol></li><li> Extracelular Flux Ensaio: <ol><li> Hidrato de cartucho durante a noite num não-CO 2 (0% de CO2), 37 ° C incubadora. </li><li> Remover o meio de cultura e lavar Organóides duas vezes com 500 ul de DMEM (sem: glucose, L-glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio; e com: vermelho de fenol). Espere 5 min. </li><li> Adicionar 675 ul por poço meio de ensaio (DMEM com 2 mM de L-glutamina e 5 mM de D-glicose) a cada poço. </li><li> Verificar cripta Organóides morfologia microscópica para garantir que Organóides e a mistura gelatinosa proteína estão intactos depois as lavagens. Incubar 1 hora em um não-CO 2, 37 ° C incubadora. </li><li> Preparar 10 uM compostos injectáveis ​​(oligomicina, carbonil-cianeto de p-trifluoro-metoxi-fenil-hidrazona (FCCP), rotenone) no meio de ensaio. </li><li> Set-up do cartucho através do carregamento de 75 mL de 10 mM compostos injetáveis ​​nas portas da sequencialmente cartucho: Port A - oligomicina; Porto B - FCCP; e Port C - rotenona (As concentrações finais no ensaio serão de 1? M). </li><li> Incubar cartucho 30 min - 1 hr a 37 ° C numa incubadora com CO 2 não. </li><li> Ao mesmo tempo, ligue o XF Analyzer e criar o modelo de protocolo de ensaio. </li><li> Coloque cartucho e placa utilidade em XF Analyzer e executar &quot;calibrar&quot; cartucho. </li><li> Verifique Organóides cripta microscopicamente para se certificar de que eles estão ligados à mistura de proteína gelatinosa. </li><li> Célula de carga em placa de cultura de protocolo do ensaio instrumento e correr. </li></ol></li></ol>

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Não há divulgações.

Testamos a taxa de consumo de oxigénio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de criptas isolados a partir de 8 meses de idade e ratinhos cultivadas em Organóides ex vivo. Após a medição da taxa basal, metabolismo cripta foi avaliada adicionando oligomicina, cianeto de carbonilo -p-Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) e rotenona, sequencialmente. Basal OCR e ECAR basal foram gravadas 0-29 min (Figura 2A e 2B). No dia 29 min, oligomicina (do canal A) foi injectada em cada poço (n = 3, para ambas as criptas e poços de controlo). A oligomicina é um inibidor da síntese de ATP. É usado para prevenir 3 (fosforilação) de respiração estado. Assim, oligomicina injecção resultou numa ligeira redução no OCR, devido ao bloqueio da síntese de ATP na mitocôndria, e as criptas comutada para a glicólise para satisfazer as suas necessidades de ATP, resultando num aumento em ECAR. No 64º minuto, FCCP (from porta B) foi injectado em cada poço. FCCP é um transportador de iões celular, o transporte de iões hidrogénio através da membrana mitocondrial, o que leva ao consumo de energia rápida sem a necessidade de produção de ATP. OCR aumentado devido ao desacoplamento e ECAR aumentado desde as criptas manteve seu balanço energético, empregando glicólise para gerar ATP, assim, sintetizar e segregar ácido láctico. No 99 ° minuto, rotenona (a partir de porta C) foi injectada em cada poço. Rotenona é um inibidor mitocondrial. Assim, a terceira injecção levou a uma diminuição no OCR, devido à função mitocondrial prejudicada e as criptas deslocado para um estado mais glicolítica mantendo os valores eCar elevados. Há duas conclusões principais: 1) Organóides cripta de ratos velhos oito meses foram cultivadas com sucesso através de múltiplas passagens; 2) Organóides que tinha sido passado em cultura durante 2 meses após derivação exibiram uma resposta metabólica a oligomicina, carbonil-cianeto de p-trifluoromethoxyphen<html> ylhydrazone e rotenona. Assim, a capacidade glicolítica de Organóides era estável após 2 meses em cultura, em consonância com o relatório que Organóides de ratos sob restrição calórica são relativamente permanentemente adaptada ao crescimento diferente e fenótipos metabólicos em cultura 12. Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo vai ser de grande importância nos estudos metabólicos de criptas intestinais. O protocolo para o isolamento cripta é adaptado de Sato et al. 10 O protocolo para estudar o metabolismo cripta em pequenas culturas organóide cripta intestinal, utilizando tecnologia de análise bioenergética não foi avaliado. Os estudos de metabolismo organï¿½de criptas pode ser alargado da introdução de mais variáveis ​​para os diferentes meios de cultura e condições de ensaio, tais como fontes de energia diferentes, inibidores e activadores de sinalização específicos e vias metabólicas, e condições hipóxicas que podem modular as vias metabólicas. ontent &quot;&gt; Existem problemas técnicos que requerem uma atenção especial quando se aplica estes protocolos. Crypt número e a eficiência de crescimento de culturas organï¿½de criptas pode variar dependendo da fonte da cripta, por exemplo, a partir de criptas geneticamente alterada versus ratinhos de tipo selvagem. Assim, a densidade de sementeira das criptas pode ser ajustado para experimentos, executando um julgamento. Além disso, criptas e organids têm uma forte tendência a aderir a superfícies. Para melhor rendimento, todos os tubos (1,5 ml, 15 ml e 50 ml tubos), pipetas e pontas de pipeta pode ser revestidos com 1% de soro fetal bovino em solução salina tamponada com fosfato a 4 ° C durante a noite. Os resultados podem ser normalizados para a concentração de proteína total utilizando o ácido bicinconínico (BCA) de ensaio. Após o ensaio metabólico, a placa de 24 poços é mantida em gelo até que o BCA ensaio. Para o ensaio de BCA, criptas são suavemente lavadas em 500 ul de PBS frio e lisadas por três vezes em 75 mL de NaOH 0,1 N em PBS seguido por agitação vigorosa durante 1 h à temperatura ambiente. Uma pipeta P1000 podeser usados ​​para quebrar a mistura gelatinosa e proteína de pipetagem para cima-para baixo promove a lise. Após a lise da cripta, o protocolo de ensaio BCA padrão para as células pode ser seguido. É importante ter apenas Matrigel &quot;&quot; poços de controlo em toda a análise bioenergética para medir a concentração de proteína no fundo destes poços e, portanto, para avaliar a concentração de proteína cripta com precisão pelo ensaio de BCA. Estudos de metabolismo organï¿½de da cripta apresentados podem ser aplicados a mini-tripas epiteliais normais e de pacientes derivada para explorar a utilidade para a avaliação precoce do risco de doença relativa e abordagens que podem modular o fenótipo metabólico e, assim, diminuir o risco. Os ensaios metabólicos descritos aqui introduzir novas estratégias para possível avaliação do risco relativo para o desenvolvimento da doença e para a detecção precoce do estado de doença, sua dissecção bioquímica e molecular e potencial modulação. Em resumo, descrevemos um protocolo detalhado para isolar pequena intestinal criptas e Organóides cultura cripta. Além disso, introduzimos um novo método de usar cripta organóide cultura para determinar as taxas de acidificação e de consumo de oxigênio extracelulares para estudar o metabolismo energético cripta organóide. Ex vivo cripta organóide cultura metabólica profiling estudos vão definir novas estratégias para a compreensão da biologia intestinal.

O câncer colorretal (CCR) é a terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. Câncer de cólon esporádico - ou seja, que resulta mais tarde na vida (&gt; 50 anos de idade) e sem fatores predisponentes genéticos claras - contas para ~ 80% de todos os casos, com incidência fortemente influenciada por padrões alimentares a longo prazo 1,2. Estes tumores exibem um desvio metabólico no sentido para a glicólise oxidativo, conhecido como o efeito de Warburg, que pode, em parte, tornar as concentrações mais elevadas de blocos de construção celulares e energia disponíveis (através glutaminolysis) para permitir a conduzir e, talvez, as altas taxas de proliferação de células tumorais 3-5 . Estudos de câncer de cólon, bem como outros cânceres gastrointestinais, incluindo cânceres do intestino delgado fornecer informação importante sobre a causa da formação de tumores. Investigando as diferenças metabólicas entre os estados normais, pró-tumorigênicos e tumorigênicos de sistemas de órgãos gastrointestinais podem ajudar determination de risco relativo para o desenvolvimento do tumor, bem como a detecção precoce de neoplasia. Além disso, a compreensão do metabolismo bioenergético envolvendo respiração mitocondrial e da glicólise irá fornecer informações fundamentais sobre a forma como a fisiologia celular, o envelhecimento e as doenças estado perturba a homeostase intestinal. A utilização da tecnologia de ensaio para análise bioenergética fluxo extracelular pode avaliar as taxas de respiração mitocondrial e, simultaneamente, a glicólise em células que crescem em cultura em tempo real, 6,7. Até recentemente, os estudos in vitro de intestino delgado foram limitadas a linhas celulares derivadas de tumores benignos ou malignos ou 8,9 e não representam a fisiologia do epitélio intestinal normal e a influência do microambiente em que residem. Em 2009, Sato et al. 10 introduziu um sistema de cultura ex vivo para crescer tridimensional do mouse (3D) Organóides intestinais epiteliais, ou epithElial &quot;mini-coragem&quot;, adequado para investigações experimentais, diagnósticos e terapêuticos 10,11. Além disso, criptas isolados de ratos sob restrição calórica manter suas propriedades de crescimento alterados como Organóides em tais culturas 12. Em comparação com linhas celulares transformadas, culturas organï¿½de criptas pode ser usado para gerar os dados fisiologicamente relevantes que apresentem um modelo muito melhor para compreender o estado in vivo. Nós adaptamos a tecnologia de análise bioenergética para ensaio de metabolismo energético de Organóides cripta intestinal. Rato cripta intestinal Organóides foram cultivadas ex vivo para desenvolver os estudos do metabolismo energético organóide cripta apresentados. A taxa de consumo de oxigénio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de Organóides criptas foram medidos na ausência e na presença de dois diferentes inibidores metabólicos (oligomicina, rotenona) e um transportador de iões (carbonil-cianeto de p-Trifluormetoxifenilidrazona). A cripta orgaresposta metabólica noid a estes compostos químicos foram refletidos com sucesso através da mudança ECAR e valores de OCR. Estudos bioenergéticos celulares irá elucidar as interações recíprocas entre o estado metabólico e risco de doença e fenótipo em câncer, obesidade, diabetes, distúrbios metabólicos e doenças mitocondriais e ajudar métodos de rastreio antecipadamente com implicações diretas para a medicina translacional. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para isolar pequenas criptas intestinais e Organóides cripta cultura. Além disso, introduzimos um novo método de usar culturas organóide cripta para ensaios metabólicos.

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;prime;s Modified Eagle&amp;prime;s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - &lt;strong&gt;step 2.2.2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Final concentration 1x or 2x</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin, liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; GlutaMAX&amp;trade; supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Final concentration 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetyl-L-cysteine, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Final concentration 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 supplement, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&amp;reg; supplement minus Vitamin A, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 &amp;mu;g</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Final concentration 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Murine EGF, 100 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Final concentration 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Murine Noggin, 20 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Final concentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; L-glutamine, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Final concentration 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; glucose powder</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Final concentration 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&amp;reg; 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Final concentration 3 mM for &lt;strong&gt;step 1.1.5&lt;/strong&gt;; 2 mM for &lt;strong&gt;step 1.1.8&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Final concentration 3 mM</td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0.1% in PBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% in PBS</td></tr><tr><td>Recovery&amp;trade; Cell Culture Freezing Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Final concentration 10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Final concentration 0.1 N in PBS</td></tr><tr><td>XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

A mucosa do intestino delgado apresenta uma arquitetura repetitivo organizado em duas estruturas fundamentais: vilosidades, projetando para o lúmen intestinal e composto por enterócitos maduros, células caliciformes e células enteroendócrinas; e criptas, residentes proximal para a submucosa e muscularis, abrigando estaminais adultas e nas células progenitoras e células de Paneth madura, bem como do estroma e as células imunes do microambiente cripta. Até aos últimos anos, estudos in vitro do intestino delgado foi limitado a linhas celulares derivadas de tumores benignos ou malignos, e não representam a fisiologia do epitélio intestinal normal e a influência do microambiente em que residem. Aqui, demonstramos um método adaptado de Sato et al. (2009) para a cultura de Organóides das criptas intestinais do rato primárias derivadas de ratinhos C57BL / 6. Além disso, apresentamos a utilização de culturas organóide cripta para analisar o perfil metabólico cripta em tempo real por medidamento do consumo basal de oxigênio, a taxa glicolítica, a produção de ATP e da capacidade respiratória. Organóides manter as propriedades definidas por sua origem e reter os aspectos de sua adaptação metabólica refletido pelo consumo de oxigênio e taxas de acidificação extracelular. Estudos metabólicos em tempo real no presente cripta organï¿½de sistema de cultura são uma ferramenta poderosa para estudar o metabolismo da energia organï¿½de cripta, e como ela pode ser modulado por factores nutricionais e farmacológicas.

Organóides da cripta foram estabelecidos a partir de oito meses de idade camundongos C57BL / 6 alimentados com dieta purificada roedor Instituto Americano de Nutrição 76A (AIN76A). Organóides criptas intestinais podem ser cultivadas em cultura durante longos períodos de tempo a partir de um único cripta (Figura 1A, única seta vermelha). Organóides crescer para fora da cripta estruturas semelhantes em 18-20 dias em cultura (Figura 1B, setas vermelhas). Criptas foram passadas a cada 3 semanas e Organóides eficientemente recuperados após cada passagem. Instrumentação bioenergética do cavalo marinho pode avaliar as taxas de respiração mitocondrial e, simultaneamente, a glicólise em células que crescem em cultura em tempo real. Nós adaptamos essa tecnologia para ensaio de metabolismo organóide cripta. Com Organóides derivadas de camundongos alimentados com dieta AIN76A purificado por 8 meses, medimos:. 1 taxa de consumo de oxigênio, OCR mostrado na Figura 2A - linha vermelha que representa a taxa de consumo de oxigênio (pmol / min) em Organóides cripta, o azul é thpoços e controle somente com Matrigel (a mistura gelatinosa de proteína); 2. taxa de acidificação extracelular (ECAR) mostrada na Figura 2B - linha vermelha que representa taxa de acidificação extracelular (mph / min) em Organóides cripta, o azul é poços de controlo apenas com a mistura de proteína gelatinosa. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52026/52026fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1:. Organóides da cripta derivados de 8 meses de idade C57BL / 6 As criptas são (a) 2-dias ou (B) de 18 dias em cultura. Escala: 100 um. <img alt="A Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52026/52026fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2: Ensaio de bioenergética usando Organóides derivados de 8 meses de idade C57BL / 6. (A) a taxa de consumo de oxigênio (OCR) é mostrado; <strong&gt; (B) taxa de acidificação extracelular (ECAR) é mostrado. Legenda: vermelho - criptas, azul - controle, apenas Matrigel. n = 3. Os reagentes injectados sequencialmente - indicado pelas barras verticais azuis - são como se segue: A, oligomicina; B, carbonil-cianeto de p-Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP); C, rotenona.

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Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Pequenas Organóides cripta intestinal cultivadas ex vivo, proporcionam um sistema de cultura de tecidos que recapitula o crescimento das criptas dependentes de células-tronco e seu nicho. Foi estabelecido um método para ensaiar o perfil metabólico em tempo real em Organóides das criptas do rato primária. Encontramos Organóides manter as propriedades fisiológicas definidas por sua origem.

Tempo real Análise do Perfil metabólico em<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas mouse Intestinal Crypt organóide

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

16.2K visualizações.  Albert Einstein College of Medicine.  Pequenas Organóides cripta intestinal cultivadas ex vivo, proporcionam um sistema de cultura de tecidos que recapitula o crescimento das criptas dependentes de células-tronco e seu nicho. Foi estabelecido um método para ensaiar o perfil metabólico em tempo real em Organóides das criptas do rato primária. Encontramos Organóides manter as propriedades fisiológicas definidas por sua origem. 

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Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Biologia do Desenvolvimento

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Pesquisa do câncer

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Imunologia e Infecção

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

Um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Biologia

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in response to infection or injury at the mucosal level as they are involved in antimicrobial responses and wound healing. They are also critical secondary messengers, regulating several pathways, including cell growth and differentiation. On the other hand, excessive ROS levels lead to oxidative stress, which can be deleterious for cells and favor intestinal diseases like chronic inflammation or cancer. This work provides a straightforward method to detect ROS in the intestinal murine organoids by live imaging and flow cytometry, using a commercially available fluorogenic probe. Here the protocol describes assaying the effect of compounds that modulate the redox balance in intestinal organoids and detect ROS levels in specific intestinal cell types, exemplified here by the analysis of the intestinal stem cells genetically labeled with GFP. This protocol may be used with other fluorescent probes.

The present protocol describes a method to detect reactive oxygen species (ROS) in the intestinal murine organoids using qualitative imaging and quantitative cytometry assays. This work can be potentially extended to other fluorescent probes to test the effect of selected compounds on ROS.

Analisando o estresse oxidativo em organoides intestinais murinos usando sonda fluorogênica sensível à espécie de oxigênio reativa

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e Célula-Tronco Única

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Autor em destaque: A cultura 3D de organoides de criptas intestinais murinas e uma única célula-tronco para pesquisa de organoides  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Tempo real Análise do Perfil metabólico em

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Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

o

Um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota

Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Analisando o estresse oxidativo em organoides intestinais murinos usando sonda fluorogênica sensível à espécie de oxigênio reativa

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides