Un modello di trasferimento adottivo dell'artrite reumatoide nei topi

Qui, riportiamo un protocollo che stabilisce un modello murino di artrite reumatoide (RA) attraverso il trasferimento adottivo di cellule T CD4⁺ da topi SKG, fornendo uno strumento sperimentale rapido e affidabile per studiare i meccanismi immunologici, la progressione patologica e lo sviluppo di nuovi trattamenti per l'artrite reumatoide.

L'artrite reumatoide (AR) è una malattia infiammatoria autoimmune cronica e sistemica che può provocare danni articolari, deformità, disabilità e persino la morte. A causa della sua complessa eziologia e della presentazione clinica eterogenea, le attuali strategie terapeutiche rimangono inadeguate nel controllare efficacemente la progressione della malattia, in particolare nel raggiungimento di una diagnosi precoce e nella fornitura di terapie personalizzate. Pertanto, lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici è fondamentale. Per raggiungere questo obiettivo, modelli animali affidabili sono essenziali per studiare la patogenesi dell'artrite reumatoide. Attualmente, vengono utilizzati diversi modelli animali di AR, tra cui il modello di artrite indotta da collagene (CIA), il modello K/BxN e il topo SKG. Sebbene questi modelli possano imitare con successo i meccanismi immunitari e le manifestazioni cliniche dell'artrite reumatoide, ognuno di essi presenta notevoli limitazioni.

In questo protocollo, descriviamo il processo di creazione di un modello murino di AR attraverso il trasferimento adottivo di cellule T CD4⁺ da topi SKG. Rispetto ai modelli convenzionali, questo modello offre un tempo di insediamento più breve e un tasso di incidenza più elevato (100%) nei topi C57BL/6. È relativamente conveniente, comporta procedure semplici e replica in modo affidabile le risposte immunitarie mediate dalle cellule T, garantendo un controllo sperimentale e una riproducibilità superiori. Abbiamo condotto una valutazione completa del modello, valutando il fenotipo clinico come i sintomi articolari. Attraverso la valutazione del fenotipo clinico, abbiamo osservato un significativo gonfiore articolare e risposte infiammatorie. Inoltre, utilizzando la tecnologia PCR per misurare i livelli di espressione dei fattori di trascrizione chiave, abbiamo scoperto che questo modello simula efficacemente le risposte immunitarie mediate dalle cellule T e le principali caratteristiche patologiche dell'artrite reumatoide. Con questo modello, i ricercatori possono simulare meglio la risposta immunitaria mediata dalle cellule T e le principali caratteristiche patologiche dell'artrite reumatoide, fornendo così uno strumento sperimentale affidabile ed efficace per lo studio dei meccanismi immunitari e della progressione patologica e lo sviluppo di nuove terapie per l'artrite reumatoide.

L'artrite reumatoide è una malattia infiammatoria autoimmune sistemica cronica che colpisce circa l'1% della popolazione globale, causando un'elevata morbilità e un pesante onere socioeconomico ^1,2. La malattia è caratterizzata da infiammazione sinoviale persistente, distruzione della cartilagine ed erosione ossea, che alla fine porta a deformità articolari, disabilità e, nei casi più gravi, morte prematura ^3,4,5. La patogenesi dell'artrite reumatoide coinvolge l'interazione di fattori genetici, ambientali e immunitari, con caratteristiche chiave tra cui l'attivazione anomala dell'immunità cellulare, l'eccessivo rilascio di citochine pro-infiammatorie e l'interruzione della tolleranza immunitaria ^6,7. In questo processo, le cellule T autoreattive, in particolare le cellule T CD4⁺, come fattori chiave della regolazione immunitaria, promuovono direttamente la progressione patologica dell'AR attraverso molteplici meccanismi.

Le cellule T helper (Th)1 producono interferone-gamma (IFN-γ), che attiva i macrofagi e i fibroblasti sinoviali, provocando il rilascio del fattore di necrosi tumorale (TNF)-α e dell'interleuchina (IL)-6 e causando sinovite. Le cellule Th17 secernono IL-17, che promuove l'attivazione delle cellule sinoviali e degli osteoclasti, esacerbando la distruzione della cartilagine e l'erosione ossea ^8,9. Inoltre, le cellule T CD4⁺ amplificano le risposte infiammatorie attivando le cellule B attraverso segnali co-stimolatori, inducendo la produzione di anticorpi anti-proteina citrullinata (ACPA) e fattori reumatoidi (RF)¹⁰. Nel frattempo, i difetti nella funzione e una riduzione del numero di cellule Treg sono le ragioni principali dello squilibrio immunitario nell'artrite reumatoide, che porta a un'infiammazione incontrollata^11,12. A causa della complessa eziologia e della presentazione clinica eterogenea, la diagnosi precoce è difficile e l'attuale trattamento dell'artrite reumatoide è insoddisfacente. Pertanto, lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici è fondamentale. Modelli animali affidabili sono fondamentali per studiare la patogenesi dell'artrite reumatoide al fine di ottenere una comprensione più profonda dei potenziali meccanismi dell'artrite reumatoide ed esplorare nuove strategie di trattamento.

I modelli tradizionali di AR, come i modelli murini CIA e K/BxN 13,14,15, contribuiscono a migliorare la nostra comprensione dell'AR. Tuttavia, questi modelli mostrano limitazioni significative. Ad esempio, il modello CIA nei topi C57BL/6 ha un basso tasso di successo e un lungo periodo di induzione, il che diminuisce la sua utilità in alcuni contesti sperimentali. Allo stesso modo, sebbene il modello K/BxN sia prezioso, è costoso da stabilire e ha limitazioni nel replicare la complessa patologia dell'artrite reumatoide umana, in particolare le interazioni tra cellule immunitarie e citochine.

Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un nuovo modello murino di AR trasferendo cellule T CD4⁺ da topi SKG con un background C57BL/6 in topi C57BL/6 immunocompetenti, in combinazione con l'attivazione immunitaria indotta dal mannano. Questo modello replica efficacemente le caratteristiche chiave dell'artrite reumatoide, comprese le risposte immunitarie mediate dalle cellule T e le caratteristiche patologiche essenziali come l'infiammazione sinoviale e l'erosione articolare, offrendo al contempo vantaggi in termini di riproducibilità, semplicità ed economicità. Abbiamo delineato una metodologia dettagliata per stabilire questo modello, che include la generazione di topi SKG sullo sfondo C57BL/6, l'isolamento delle cellule T CD4⁺ dai topi SKG, il loro trasferimento adottivo e la successiva induzione da parte del mannano. Inoltre, descriviamo i criteri clinici e istologici utilizzati per valutare la gravità dell'artrite, garantendone l'affidabilità e la riproducibilità. Imitando costantemente le risposte immunitarie mediate dalle cellule T e le caratteristiche patologiche fondamentali dell'artrite reumatoide, questo modello funge da strumento sperimentale robusto ed efficiente per studiare i meccanismi immunitari, la progressione della malattia e lo sviluppo di nuove terapie per l'artrite reumatoide.

Tutte le procedure sperimentali in questo studio hanno seguito rigorosamente le linee guida stabilite dalla "Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio", tra cui l'allevamento di animali, le operazioni sperimentali e l'eutanasia, e sono state approvate dal Comitato etico animale del Tongji Medical College, Università di Scienza e Tecnologia di Huazhong.

1. Animali

1. Generazione di topi SKG (sfondo C57BL/6)
   1. Strategia di editing genetico
      1. Progettare uno specifico RNA guida (gRNA) mirato al gene ZAP70 (sequenza gRNA: 5'-CAGCCCACGAGCGAATGCCCTGG-3') e condurre l'editing genetico con il sistema CRISPR/Cas9. Progettare un DNA di donatore con la mutazione ZAP70 (W163C) per garantire un'incorporazione precisa della mutazione (qui, CAGGCCCCACAGGTGGAGAAGCTCATTG
         CTACCACAGCCCACGAGCGAATGCCCTG
         CTATCACAGCAGCCTGACTCGTGAGGAG
         GCCGAGCGCAAACTCTATTCCGGCCA).
         NOTA: Il gRNA dirige la proteina Cas9 verso il sito specifico del gene ZAP70 per un taglio preciso. La base sottolineata nella sequenza di DNA del donatore indica basi mutate. Questa mutazione corrisponde alla mutazione W163C (TGG→TGC) nella proteina ZAP70, che si trova in un dominio funzionale critico.
   2. Iniezione di microsiringhe
      1. Utilizzare la microiniezione per introdurre l'mRNA Cas9, il gRNA e il DNA del donatore in ovuli di topo fecondati C57BL/6. Co-iniettare la proteina Cas9 e il gRNA in modo che scindano il gene ZAP70 e inseriscano la mutazione ZAP70 (W163C) tramite ricombinazione omologa. Trapiantare gli ovuli fecondati iniettati in topi femmina pseudogravidi, attendere circa 20 giorni e designare i topi nati come generazione F0. Identificare i genotipi attraverso l'amplificazione e il sequenziamento PCR (vedere il passaggio 1.1.5.3).
   3. Genotipizzazione di topi di generazione F0
      1. Eseguire la PCR e il sequenziamento su topi della generazione F0 per confermare l'acquisizione della mutazione ZAP70 (W163C) (vedere passaggio 1.1.5.3).
         NOTA: I topi della generazione F0 sono chimerici a causa della rapida scissione embrionale. Possono non avere una trasmissione genetica stabile. Implementare l'allevamento seriale per stabilire linee stabili.
   4. Acquisizione e identificazione genotipica di topi di generazione F1
      1. Allevare topi F0 positivi con topi C57BL/6J wild-type per ottenere topi di generazione F1 ed eseguire la genotipizzazione tramite PCR e sequenziamento per ottenere topi SKG (background C57BL/6; vedere il passaggio 1.1.5.4).
   5. Metodi di genotipizzazione basati sulla PCR per le generazioni F0 e F1
      1. Estrarre un pezzo di 0,5 cm dalla coda con forbici sterili.
      2. Estrarre il DNA di topo utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico animale.
      3. Per F0, preparare il seguente sistema di reazione PCR: 13,2 μL di ddH₂O, 2 μL di tampone PCR, 2 μL di 2,5 mM dNTP, 0,5 μL di ciascuno dei primer diretti (5'-GATGCCTAGGTGGGGGGGGGGCC-3') e inversi (5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTACA-3') (10 pmol/μL), 0,8 μL di DNA polimerasi e 1 μL di DNA genomico (50-100 ng/μL) estratto da code di topo, per un volume finale di reazione di 20 μL. Eseguire l'amplificazione genica utilizzando il seguente programma PCR: 94 °C per 3 min; 98 °C per 15 s, 58 °C per 15 s e 68 °C per 1 min, per 35 cicli; 68 °C per 5 min; mantenere a 12 °C.
      4. Per F1, preparare il seguente sistema di reazione PCR: 14,9 μL di ddH₂O, 2 μL di tampone PCR 10x Taq, 1 μL di dNTP 2,5 mM, 0,5 μL di ciascuno dei primer diretti (5'-GATGCCTAGGTGGGGGGGGTTCC-3') e inversi (5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTACA-3') (10 pmol/μL), 0,1 μL di Taq DNA polimerasi e 1 μL di DNA genomico (50-100 ng/μL) estratto da code di topo, per un volume finale di reazione di 20 μL. Eseguire l'amplificazione genica utilizzando il seguente programma PCR: 94 °C per 5 min; 94 °C per 30 s, 58 °C per 30 s, 72 °C per 1 min, ripetuto per 35 cicli; 72 °C per 5 min; mantenere a 12 °C.
      5. Eseguire l'elettroforesi per confermare i prodotti delle dimensioni previste.
      6. Sequenziare i prodotti della PCR per verificare sia il genotipo che la mutazione specifica.
2. Selezione di topi donatori e riceventi
   1. Seleziona topi SKG di 6-8 settimane (maschi o femmine) come topi donatori.
   2. Seleziona topi C57BL/6 di 6-8 settimane (preferibilmente femmine per risultati sperimentali coerenti) come topi riceventi.
   3. Ospitare topi C57BL/6 e SKG (6-8 settimane di età) in condizioni SPF in gabbie ventilate individualmente. Fornire libero accesso al mangime di qualità SPF e all'acqua sterile con un ciclo luce/buio di 12 ore. Acclimata i topi per 1 settimana prima di iniziare gli esperimenti.

2. Isolamento e purificazione di cellule T CD4⁺ da topi SKG

1. Eutanasia dei topi SKG sotto una cappa sterile a flusso laminare utilizzando l'asfissia da CO₂ . Immergere i topi in alcol al 75% per 5 minuti per disinfettare. Localizzare la milza nella cavità addominale e i linfonodi (inguinale e popliteo) nelle regioni inguinale e poplitea. Sezionare con cura la milza e i linfonodi utilizzando pinze e forbici sterili e trasferirli immediatamente in PBS preraffreddato.
2. Mettere la milza e i linfonodi in piastre di Petri separate. Premere i tessuti attraverso un colino cellulare da 70 μm utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile e aggiungere gradualmente 10-12 ml di PBS preraffreddato per formare una sospensione cellulare uniforme. Passare la sospensione cellulare attraverso lo stesso filtro cellulare da 70 μm in una provetta da centrifuga da 15 mL, quindi centrifugare a 300 × g per 7 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e conservare il pellet cellulare.
3. Eseguire la colorazione con blu di tripano per valutare la vitalità cellulare. Conta le cellule e conferma che la vitalità è del ≥90%.
4. Regolare la concentrazione delle cellule a 1 × 10⁸ cellule/mL con il tampone fornito nel kit di isolamento delle cellule T CD4⁺ .
5. Trasferire 100 μl della sospensione cellulare (10-7 celle) in una nuova provetta. Aggiungere 10 μL di Biotina-Anticorpo-Cocktail, mescolare accuratamente e incubare con ghiaccio per 15 minuti.
6. Risospendere le perline vorticando alla massima velocità. Aggiungere 10 μl di sospensione di perle di streptavidina, mescolare bene e incubare con ghiaccio per 15 minuti.
7. Aggiungere 2,5 mL del tampone fornito nel kit di isolamento delle cellule T CD4⁺ e posizionare la provetta nel magnete per 5 minuti.
8. Versare con cautela il liquido (cellule bersaglio) dalla provetta in una nuova provetta sterile, quindi centrifugare a 4 °C, 300 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante e conservare il pellet cellulare.
9. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione sterile di PBS per regolare la concentrazione cellulare a 2 × 10⁶ cellule/mL e mantenere la sospensione in ghiaccio per un uso successivo.
10. Utilizzare la citometria a flusso per valutare la purezza delle cellule selezionate (Figura S1 supplementare). Calcola la purezza delle cellule come: (Numero di cellule T CD4⁺ / Conta cellulare totale) × 100%. Confermare che la purezza sia ≥90%¹⁶.

3. Trasferimento adottivo di cellule T CD4⁺

1. Anestetizzare i topi C57BL/6 con isoflurano al 2%-3%, raggiungendo una profondità di anestesia in cui i topi perdono tutta la mobilità ma mantengono la normale respirazione spontanea.
2. Pulisci delicatamente il canto interno (angolo dell'occhio) del topo con un batuffolo di cotone sterile per rimuovere secrezioni e peli, esponendo la vena.
3. Immobilizza il mouse a mano. Aspirare 200 μL di sospensione di cellule T CD4⁺ (2 × 10^5-5 × 10⁵ cellule per topo) in una siringa da 1 mL. Inserire l'ago con un angolo di 10-15° nella vena cantale interna, assicurandosi un posizionamento accurato. Iniettare la sospensione cellulare lentamente e uniformemente per 10-15 s.
4. Dopo aver ritirato l'ago, premere delicatamente l'area del canto interno con un batuffolo di cotone sterile per 3-5 secondi per evitare sanguinamento.
5. Metti il topo in una gabbia tranquilla, asciutta e pulita per il monitoraggio fino a quando non riprende completamente conoscenza, con una respirazione stabile e nessun comportamento anomalo (come contrazioni o morte improvvisa). Spostare il mouse in una gabbia di alloggiamento standard dopo aver confermato lo stato postoperatorio stabile.
   NOTA: Poiché la vena cantale interna è piccola, una manipolazione delicata e una velocità di infusione controllata sono fondamentali per evitare la rottura della vena o il blocco cellulare causato da una velocità eccessiva.
6. Registrare i dettagli dell'infusione ed etichettare i topi modello e del gruppo di controllo (quattro animali per gruppo) per evitare confusione negli esperimenti successivi. Somministrare cellule T CD4⁺ ai topi modello e lasciare i topi di controllo non trattati. Assicurati che tutti i mouse siano topi riceventi.

4. Stimolazione e induzione del mannano

1. Eseguire l'induzione del mannano il giorno 4 (72 ore dopo l'infusione di cellule T CD4⁺ ). Applicare le stesse condizioni di induzione a tutti i topi sperimentali e di controllo.
   1. Pesare la polvere di mannano e scioglierla in PBS sterile a una concentrazione di 100 mg/mL.
   2. Tieni premuto correttamente il mouse per esporre l'addome. Disinfettare la pelle con alcol al 75% e identificare il sito di iniezione (~1 cm a lato della linea mediana addominale).
   3. Mescolare accuratamente la soluzione di mannano e aspirare il volume appropriato (20-30 mg per topo) in una siringa da 1 mL. Inserire l'ago con un angolo di 45° nella cavità peritoneale e iniettare lentamente la soluzione per garantire una distribuzione uniforme. Estrarre lentamente l'ago e premere delicatamente il sito di iniezione con un batuffolo di cotone sterile per alcuni secondi per evitare perdite o infezioni.
2. Metti il topo iniettato in una gabbia tranquilla e pulita e monitora attentamente per 5-10 minuti per assicurarti che non vi siano perdite nel sito di iniezione, distensione addominale o respirazione anomala.
3. Registrare in dettaglio i dettagli dell'iniezione per ciascun topo.

5. Misure

1. Osservazione del fenotipo clinico
   1. Punteggio dei sintomi dell'artrite
      1. Eseguire valutazioni congiunte ogni 3 giorni dopo l'induzione del mannano. Ispezionare tutte le articolazioni degli arti anteriori e posteriori, prestando particolare attenzione alle articolazioni del ginocchio, della caviglia, del polso e delle dita dei piedi. Valutare la gravità dell'artrite utilizzando criteri standard (Tabella 1)¹⁷. Registra e confronta i punteggi totali in ogni momento per valutare la progressione dell'artrite.
2. Registrazione delle caratteristiche patologiche tissutali
   1. Dopo un mese di induzione del mannano, sopprimere i topi sotto una cappa sterile a flusso laminare utilizzando l'asfissia da CO₂ (seguendo le linee guida del comitato etico), fissare il topo su una tavola di schiuma ed esporre gli arti posteriori. Incidere la pelle partendo dalla caviglia e sbucciarla verso l'alto per esporre muscoli e articolazioni. Identificare l'articolazione della caviglia (tra tibia/perone e astragalo) e le articolazioni metatarso-falangee (tra metatarsi e falangi prossimali) e sezionare queste articolazioni per l'analisi istologica e preparare sezioni di paraffina.
   2. Fissare i tessuti asportati in formalina al 4% per 72 ore, quindi trasferirli in acido etilendiamminotetraacetico al 10% (EDTA, pH 7,4) per 4 settimane di decalcificazione per garantire una decalcificazione completa.
   3. Dopo la decalcificazione, lavare i tessuti con PBS per rimuovere eventuali residui di fissativo e quindi disidratare i tessuti attraverso una serie di etanolo graduato (75%, 80%, 95%, 100%).
      NOTA: La formalina può irritare gli occhi, la pelle e le vie respiratorie. Dovrebbe essere maneggiato in una cappa aspirante.
   4. Incorporare il tessuto nella paraffina utilizzando una macchina per l'inclusione della paraffina. Utilizzare un microtomo per sezionare il tessuto incorporato in fette spesse 4 μm. Far galleggiare le sezioni in un bagno d'acqua a 40 °C contenente acqua distillata.
   5. Trasferire e asciugare le sezioni. Posizionare le sezioni su vetrini. Asciugarli per una notte a temperatura ambiente (RT). Conservare i vetrini in RT per la colorazione.
   6. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)
      1. Mettere i vetrini in forno a 60 °C per 2 ore per eliminare la paraffina.
      2. A temperatura ambiente, immergere i vetrini nella seguente sequenza per 5 minuti ciascuno: xilene → xilene → 100% etanolo → 100% etanolo → 95% etanolo → 80% etanolo → 75% etanolo. Sciacquare in acqua distillata per 2 minuti.
      3. Colorare i vetrini in sequenza in soluzione di ematossilina per 5 minuti, sciacquare in acqua deionizzata per 2 minuti, quindi trattare con ammoniaca allo 0,1% per 1 minuto, risciacquare per 3 x 2 minuti in acqua deionizzata, colorare con eosina per 1 minuto e infine risciacquare in acqua deionizzata per 2 minuti.
      4. Immergere i vetrini per 5 minuti ciascuno in etanolo all'80% → etanolo al 95% → etanolo al 100% → xilene → xilene.
      5. Asciugare le diapositive all'aria in modo naturale e montarle con resina neutra.
   7. Safranina O-Fast Colorazione verde
      1. Deparaffinare le sezioni di paraffina in acqua e colorarle usando un kit per coloranti di Van Gieson. Montare i vetrini con resina neutra dopo la colorazione e acquisire le immagini al microscopio (preparato al punto 5.2.5).
3. Cambiamenti nelle cellule T e nelle citochine
   1. Rimuovere la milza dal topo utilizzando strumenti chirurgici sterili.
      1. Estrarre l'RNA totale dal tessuto della milza utilizzando un kit di estrazione dell'RNA secondo le istruzioni del produttore. Quantificare la concentrazione e la purezza dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro e assicurarsi che il rapporto A260/A280 sia compreso tra 1,8 e 2,0.
      2. Sintetizzare il cDNA dall'RNA estratto utilizzando un kit di trascrizione inversa. Seguire il protocollo del produttore per la configurazione della reazione e le condizioni di ciclo. Conservare il cDNA a -20 °C per la successiva analisi qPCR.
      3. Eseguire la qPCR: misurare i livelli relativi di espressione dell'mRNA di Tbx21, Gata3, Il-17 e Foxp3 nel tessuto della milza è stato misurato utilizzando la qPCR a base di SYBR Green in reazioni da 10 μL contenenti: 5 μL di 2x SYBR Green master mix, 0,2 μL ciascuno di primer diretti e inversi (10 μM; sequenze nella Tabella 2), 0,5-1 μL di cDNA (50-100 ng/μL), e acqua priva di nucleasi a volume. Utilizzare le seguenti condizioni di cicli termici: denaturazione iniziale a 95 °C per 30 s, seguita da 40 cicli di 95 °C per 10 s e 60 °C per 30 s, con analisi della curva di fusione (65-95 °C). Normalizza i livelli di espressione a Gapdh utilizzando il metodo 2^(-ΔΔCt).
   2. Isolamento del siero e analisi citometrica di bead array (CBA)
      1. Raccogliere il sangue dal topo utilizzando il metodo di raccolta orbitale del sangue mediante enucleazione, trasferire il sangue in una provetta di raccolta rivestita di anticoagulante e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 30 minuti. Centrifugare il sangue coagulato a 4 °C, 1.000 × g per 15 minuti, raccogliere con cura il surnatante (siero) e conservarlo a -80 °C fino all'analisi.
      2. Determinare i livelli di espressione di IL-6, IL-10, IL-17, TNF-α e IFN-γ nel siero utilizzando un kit CBA secondo le istruzioni del produttore.

Punteggio clinico del gonfiore articolare e del tasso di incidenza nei topi
La Figura 1 mostra il punteggio clinico del gonfiore articolare e il tasso di incidenza nei topi modello. I risultati indicano che tutti i topi del gruppo modello hanno sviluppato la malattia (n = 4), con un tasso di incidenza del 100%. I punteggi nel gruppo modello sono aumentati significativamente, hanno mostrato un breve sollievo nella seconda settimana e successivamente sono aumentati per un periodo di 6 settimane.

Manifestazione di gonfiore articolare nei topi
Le articolazioni dei topi del gruppo modello mostrano un significativo ispessimento e gonfiore, con notevole gonfiore e ispessimento osservati anche negli arti anteriori e posteriori (Figura 2).

Risultati patologici delle articolazioni della caviglia del topo
I risultati patologici indicano che, rispetto al gruppo di controllo, i topi del gruppo modello mostrano un significativo ispessimento della sinovia nelle articolazioni della caviglia, discontinuità nell'osso e marcata aggregazione di cellule infiammatorie (Figura 3, Figura 4 e Figura 5).

Fattori infiammatori sierici correlati alle cellule T
Rispetto al gruppo di controllo, i topi del gruppo modello hanno mostrato aumenti significativi dei livelli sierici di IL-10 (7,51 vs 2,15 pg/mL), TNF (78,83 vs 13,11 pg/mL), IL-17 (101,6 vs 12,64 pg/mL) e IFN-γ (5,15 vs 1,90 pg/mL) (p < 0,05). Anche l'IL-6 è aumentata significativamente rispetto al gruppo di controllo (15,59 vs 6,27 pg/mL) (p = 0,05, Figura 6).

Cambiamenti nei sottogruppi di cellule T Th1/2/17 e Treg nella milza
I livelli di espressione dell'mRNA di Tbx21 (Th1), Gata3 (Th2), Il-17 (Th17) e Foxp3 (Tregs) sono stati misurati per valutare i cambiamenti nei sottogruppi di cellule T nella milza. Questi geni codificano fattori di trascrizione chiave e citochine che definiscono la differenziazione e la funzione dei rispettivi sottogruppi di cellule T. Rispetto al gruppo di controllo, i topi del gruppo modello hanno mostrato un aumento significativo dell'espressione dell'mRNA di Tbx21 (1,68 vs 0,61) e Il-17 (26,30 vs 0,75) nella milza (p < 0,05) rispetto al gene di riferimento Gapdh.

Figura 1: Punteggio clinico del gonfiore articolare. (A) Topi del gruppo modello; (B) Incidenza cumulativa nei topi del gruppo modello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Manifestazioni di gonfiore articolare nei topi di controllo e modello (n = 4). (A-C) Immagini rappresentative dei punteggi di gonfiore delle zampe e delle articolazioni (0,2,4) nei gruppi di controllo e modello di topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Cambiamenti istologici nelle articolazioni della caviglia di topi di controllo e del gruppo modello osservati con colorazione con ematossilina-eosina. (A) Controllo dell'articolazione della caviglia del topo; (B) Discontinuità nell'osso dell'articolazione della caviglia del topo del gruppo modello; (C) Proliferazione sinoviale nell'articolazione della caviglia del topo del gruppo modello. Barre della scala = 50 μm (prima colonna), 100 μm (seconda e terza colonna). Le immagini in Fig. 3B e 3C provengono dallo stesso topo e dimostrano diversi fenotipi patologici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Differenze nello spessore sinoviale delle articolazioni della caviglia tra il gruppo di controllo e i topi del gruppo modello (p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Cambiamenti istologici nelle articolazioni della caviglia di topi di controllo e del gruppo modello osservati con la colorazione Safranin O-Fast Green. (A) Articolazione della caviglia del topo del gruppo di controllo; (B) Proliferazione sinoviale nell'articolazione della caviglia del topo del gruppo modello. Barre della scala = 50 μm (prima colonna), 100 μm (seconda e terza colonna). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Cambiamenti nei fattori infiammatori correlati alle cellule T e nei sottogruppi nei topi di controllo e nel gruppo modello. (A) Espressione di fattori infiammatori correlati alle cellule T nel siero di topi di controllo e del gruppo modello e (B) le variazioni nei sottogruppi di cellule T Th1/2/17 e Tregs nella milza. *p < 0,05, **p < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Criteri di punteggio per l'artrite. Per valutare l'artrite, ogni arto viene valutato in base al gonfiore e all'eritema, con un punteggio da 0 a 6 assegnato a ciascun arto. I punteggi per tutti e quattro gli arti vengono sommati per generare il punteggio totale dell'artrite per ciascun topo.

Tabella 2: Elenco delle sequenze di primer.

Figura S1 supplementare: Strategia di gating per lo smistamento delle cellule T CD4⁺ mediante citometria a flusso. Clicca qui per scaricare questo file.

Lo sviluppo dell'artrite reumatoide è strettamente associato a un'anomala infiltrazione di cellule immunitarie nel tessuto sinoviale, dove l'attivazione disregolata di queste cellule immunitarie porta al rilascio di varie citochine pro-infiammatorie, che contribuiscono ulteriormente al danno delle strutture sinoviali e articolari^18,19. Diversi modelli animali di artrite reumatoide sono stati ampiamente valutati, tra cui il modello CIA, il modello K/BxN e i topi SKG 13,20,21. Sebbene questi modelli replichino con successo i meccanismi immunitari e le manifestazioni cliniche dell'artrite reumatoide, tutti presentano limitazioni significative. Ad esempio, il modello CIA nei topi C57BL/6 ha un tasso di successo inferiore, un periodo di insorgenza più lungo ed è significativamente influenzato dalle condizioni ambientali e sperimentali, rendendolo meno pratico in alcuni contesti sperimentali. I topi SKG rappresentano un modello murino di AR basato su una mutazione del gene ZAP-70, che causa un'anomalia improvvisa nella segnalazione del recettore delle cellule T (TCR) e induce l'artrite autoimmune²². Tuttavia, questo modello è costoso e la riproducibilità dei risultati sperimentali è facilmente influenzata dalle condizioni di induzione. K/BxN è un modello ereditario di artrite innescato dall'attività cooperativa delle cellule T e B, che mostra una pronunciata risposta immunitaria²³. Tuttavia, la costruzione di questo modello è costosa e la sua specificità è limitata, portando a una risposta immunitaria limitata che non può catturare completamente il processo patologico multiforme dell'artrite reumatoide umana. Pertanto, è di grande importanza sviluppare un modello animale in grado di replicare le principali caratteristiche patologiche dell'artrite reumatoide, soddisfare vari requisiti sperimentali e garantire un'elevata riproducibilità.

In questo studio, presentiamo un metodo per stabilire un modello di AR attraverso il trasferimento adottivo di cellule T CD4⁺ adattative da topi SKG. La costruzione di questo modello si basa sulla selezione di cellule T CD4⁺ da topi SKG con un background C57/BL6 e l'induzione del mannano, un processo che garantisce il successo del modello. È ampiamente noto che i topi SKG su un background BALB/c portano una mutazione spontanea del gene ZAP70 (W163C), che causa una selezione anomala del segnale TCR, portando a cellule T altamente autoreattive²⁴. Ciò si traduce in un'eccessiva attivazione delle cellule T e nell'insorgenza di sinovite e distruzione articolare, imitando così i processi patologici chiave dell'artrite reumatoide come la riparazione sinoviale e l'attivazione delle cellule immunitarie^25,26. Le caratteristiche cliniche dei topi SKG assomigliano molto a quelle dei pazienti con AR umana.

Per introdurre questa mutazione nel background C57BL/6, abbiamo impiegato la tecnologia CRISPR/Cas9 per generare con successo un modello murino di SKG con background C57BL/6 portatore della mutazione ZAP70 (W163C). CRISPR/Cas9 offre un'elevata precisione ed efficienza, consentendo l'introduzione mirata della mutazione desiderata mantenendo un basso tasso di inserimento fuori bersaglio o di modifiche genetiche indesiderate associate ai tradizionali metodi di induzione casuale, garantendo così la stabilità e l'unicità del modello^27,28. Ancora più importante, questa tecnica riduce significativamente il tempo necessario per la costruzione del modello, migliorando sia la controllabilità che l'efficienza dello sviluppo del modello. Utilizzando questo modello, possiamo replicare con precisione la sinovite mediata dalle cellule T e la distruzione congiunta dell'AR su uno sfondo C57BL/6. Rispetto al background BALB/C nei topi SKG tradizionali, i topi modello su un background C57BL/6 hanno un'applicabilità più ampia nella ricerca immunologica e possono essere più facilmente combinati con altri modelli transgenici (ad esempio, Rag1^-/- o IL17^-/-). Questo li rende adatti per studiare il ruolo della mutazione ZAP70 nell'artrite reumatoide e in altre malattie autoimmuni come il lupus eritematoso sistemico o la sclerosi multipla.

Sulla base del ruolo fondamentale^29,30 delle cellule T CD4⁺ nell'attivazione dell'AR, le abbiamo selezionate come mediatori chiave. Le cellule T sono i principali motori delle risposte immunitarie nell'artrite reumatoide e possono indurre direttamente il danno sinoviale attivando i sottogruppi effettori Th1/Th17³¹, a seconda di fattori infiammatori come IL-6, IL-17 e TNF-α ^32,33. Come mediatori fondamentali della regolazione immunitaria, le cellule T CD4⁺ secernono citochine pro-infiammatorie, innescando e mantenendo la cascata infiammatoria, che porta alla proliferazione sinoviale e al danno articolare, promuovendo così direttamente la progressione patologica dell'artrite reumatoide. Sono fondamentali per aiutare le cellule B nella produzione di anticorpi specifici (ad esempio, ACPA)³⁴. Nel frattempo, la caratteristica istopatologica tipica della sinovia dell'artrite reumatoide è l'aggregazione di cellule T CD4⁺. Alcuni geni del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II, in particolare gli "epitopi condivisi" correlati all'isotipo Human Leukocyte Antigen-DR (HLA-DR), sono considerati strettamente legati alla patogenesi dell'AR³⁵. Inoltre, la strategia di bloccare la co-stimolazione delle cellule T con l'antigene citotossico associato ai linfociti T 4 (CTLA4)-Ig ha dimostrato una significativa efficacia clinica nell'artrite reumatoide³⁶. Inoltre, l'induzione del mannano funge da potente attivatore per il modello, promuovendo l'attivazione di componenti immunitari innati come le cellule dendritiche e i macrofagi³⁷. Questo passaggio facilita ulteriormente l'attivazione delle cellule T CD4⁺ e le risposte immunitarie, aumentando significativamente l'attacco del sistema immunitario ai tessuti stessi, simulando così le caratteristiche patologiche della disregolazione immunitaria e del danno sinoviale nell'artrite reumatoide.

Dopo aver completato l'induzione del modello, abbiamo eseguito una verifica sistematica del gruppo modello utilizzando molteplici parametri, tra cui il punteggio clinico del gonfiore articolare, la convalida patologica (osservando la sinovite, la patologia tissutale e le caratteristiche della distruzione articolare) e la convalida immunologica (espressione delle cellule Th1/2/17 e Treg nel siero e nella milza). I risultati hanno mostrato che il nostro modello ha replicato con successo la sinovite mediata dalle cellule T e la distruzione articolare nell'AR, inducendo l'attivazione immunitaria caratteristica e i cambiamenti patologici sinoviali coerenti con i principali meccanismi fisiopatologici dell'AR, con un tasso di prevalenza del 100%. È interessante notare che nel nostro modello, il punteggio clinico delle articolazioni gonfie dei topi raggiunge il picco a 1 settimana, mostra una marcata riduzione nella seconda settimana, e poi aumenta gradualmente di nuovo nelle fasi successive, il che non è del tutto in linea con il decorso tipico della malattia osservato nei modelli animali convenzionali di artrite³⁸. Ciò può essere dovuto al fatto che, a 1 settimana dall'induzione, il sistema immunitario nei topi modello è in una fase iniziale intensamente attivata dall'iniezione di mannano, con conseguente picco di infiammazione articolare. Nella seconda settimana, la regolazione immunitaria e i meccanismi di autorecupero portano a un temporaneo alleviamento dei sintomi clinici. Con il progredire della malattia, la tolleranza immunitaria diminuisce gradualmente e la risposta immunitaria si intensifica nuovamente, manifestandosi con un graduale peggioramento della condizione nelle fasi successive.

Sebbene questo modello sia relativamente semplice rispetto ad altri modelli, ci sono ancora diversi punti chiave che devono essere affrontati durante il processo di modellazione. In primo luogo, l'attività e la purezza delle cellule T CD4⁺ dei topi SKG costituiscono la base per il successo del modello. La purezza delle celle deve superare il 90% per garantire la coerenza e l'affidabilità dei risultati sperimentali. In secondo luogo, la velocità di iniezione nella vena cantale mediale deve essere attentamente controllata per evitare la rottura della vena dovuta all'iniezione troppo rapida o la perdita di cellule dovuta all'iniezione troppo lenta. Inoltre, la selezione della dose cellulare è fondamentale. Una dose troppo bassa può portare al fallimento del modello, mentre una dose troppo alta potrebbe innescare risposte infiammatorie non specifiche. Pertanto, durante il processo di modellazione, le condizioni generali dei topi devono essere attentamente monitorate e qualsiasi sintomo anomalo deve essere registrato tempestivamente per garantire il regolare progresso dell'esperimento e la validità scientifica dei dati.

Rispetto ai modelli convenzionali, questo modello ha un periodo di insediamento più breve, raggiunge un tasso di incidenza più elevato nei topi C57BL/6 e rimane relativamente economico e facile da usare. L'adozione del trasferimento di cellule T CD4⁺ autoreattive riproduce accuratamente le risposte immunitarie mediate dalle cellule T e cattura le principali caratteristiche patologiche dell'artrite reumatoide, come il gonfiore e il danno articolare. Inoltre, le sue manifestazioni cliniche si allineano bene con quelle dell'AR umana, offrendo una riflessione più autentica dei processi clinici e patologici dell'AR. Inoltre, la combinazione dell'infusione mediale della vena cantale e dell'induzione del mannano migliora ulteriormente la controllabilità e la stabilità sperimentale del modello, rendendolo altamente riproducibile e offrendo un eccellente controllo sperimentale. Naturalmente, questo modello ha ancora dei limiti. Si concentra principalmente sulle risposte immunitarie guidate dalle cellule T; la simulazione dei ruoli collaborativi delle risposte anticorpali mediate dalle cellule B e di altre cellule immunitarie (come le cellule natural killer (NK) e le cellule Treg) è insufficiente, rendendo difficile rappresentare completamente i meccanismi patologici multicellulari dell'AR. Ciononostante, questo modello murino di AR rimane un modello animale stabile e affidabile, fornendo ai ricercatori una piattaforma migliore per simulare le risposte immunitarie mediate dalle cellule T e le principali caratteristiche patologiche dell'AR. Questo modello consente ai ricercatori di approfondire i meccanismi immunitari e la progressione patologica dell'artrite reumatoide, fornendo importanti prove sperimentali e strumenti per lo sviluppo di nuove terapie, in particolare nella comprensione della disregolazione immunitaria guidata dalle cellule T e nell'identificazione di bersagli terapeutici.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82270903, 82401588 e 81974254) e della China Postdoctoral Science Foundation (2024M751019).