Un modèle de transfert adoptif de la polyarthrite rhumatoïde chez la souris

Ici, nous rapportons un protocole établissant un modèle murin de polyarthrite rhumatoïde (PR) par transfert adoptif de lymphocytes T CD4⁺ de souris SKG, fournissant un outil expérimental rapide et fiable pour étudier les mécanismes immunologiques, la progression pathologique et le développement de nouveaux traitements pour la PR.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire auto-immune systémique chronique qui peut entraîner des lésions articulaires, des déformations, une invalidité et même la mort. En raison de son étiologie complexe et de sa présentation clinique hétérogène, les stratégies de traitement actuelles restent inadéquates pour contrôler efficacement la progression de la maladie, en particulier pour obtenir un diagnostic précoce et fournir des thérapies personnalisées. Par conséquent, le développement de nouvelles approches thérapeutiques est crucial. Pour y parvenir, des modèles animaux fiables sont essentiels pour étudier la pathogenèse de la PR. À l’heure actuelle, plusieurs modèles animaux de PR sont utilisés, notamment le modèle d’arthrite induite par le collagène (CIA), le modèle K/BxN et la souris SKG. Bien que ces modèles puissent imiter avec succès les mécanismes immunitaires et les manifestations cliniques de la PR, ils présentent chacun des limites notables.

Dans ce protocole, nous décrivons le processus d’établissement d’un modèle de souris PR par le transfert adoptif de lymphocytes T CD4⁺ de souris SKG. Par rapport aux modèles conventionnels, ce modèle offre un temps d’établissement plus court et un taux d’incidence plus élevé (100 %) chez les souris C57BL/6. Il est relativement rentable, implique des procédures simples et réplique de manière fiable les réponses immunitaires médiées par les lymphocytes T, assurant un contrôle expérimental et une reproductibilité supérieurs. Nous avons effectué une évaluation complète du modèle, en évaluant le phénotype clinique tel que les symptômes articulaires. Grâce à l’évaluation phénotypique clinique, nous avons observé un gonflement articulaire significatif et des réponses inflammatoires. De plus, en utilisant la technologie PCR pour mesurer les niveaux d’expression des facteurs de transcription clés, nous avons constaté que ce modèle simule efficacement les réponses immunitaires médiées par les lymphocytes T et les principales caractéristiques pathologiques de la PR. Grâce à ce modèle, les chercheurs peuvent mieux simuler la réponse immunitaire médiée par les lymphocytes T et les principales caractéristiques pathologiques de la PR, fournissant ainsi un outil expérimental fiable et efficace pour étudier les mécanismes immunitaires et la progression pathologique et développer de nouvelles thérapies pour la PR.

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire auto-immune systémique chronique qui touche environ 1 % de la population mondiale, entraînant une morbidité élevée et un lourd fardeau socio-économique ^1,2. La maladie se caractérise par une inflammation synoviale persistante, une destruction du cartilage et une érosion osseuse, entraînant finalement des déformations articulaires, des handicaps et, dans les cas graves,^{une mort} prématurée3,4,5. La pathogenèse de la PR implique l’interaction de facteurs génétiques, environnementaux et immunitaires, avec des caractéristiques clés telles que l’activation anormale de l’immunité cellulaire, la libération excessive de cytokines pro-inflammatoires et la perturbation de la tolérance immunitaire ^6,7. Dans ce processus, les lymphocytes T autoréactifs, en particulier les lymphocytes T CD4⁺, en tant que moteurs clés de la régulation immunitaire, favorisent directement la progression pathologique de la PR par de multiples mécanismes.

Les cellules T auxiliaires (Th)1 produisent de l’interféron-gamma (IFN-γ), qui active les macrophages et les fibroblastes synoviaux, entraînant la libération du facteur de nécrose tumorale (TNF)-α et de l’interleukine (IL)-6 et provoquant la synovite. Les cellules Th17 sécrètent de l’IL-17, qui favorise l’activation des cellules synoviales et des ostéoclastes, exacerbant la destruction du cartilage et l’érosion osseuse ^8,9. De plus, les lymphocytes T CD4⁺ amplifient les réponses inflammatoires en activant les lymphocytes B par des signaux de co-stimulation, induisant la production d’anticorps anti-protéine citrullinée (ACPA) et de facteurs rhumatoïdes (RF)¹⁰. Pendant ce temps, des défauts de fonction et une réduction du nombre de cellules Treg sont les principales raisons du déséquilibre immunitaire dans la PR, conduisant à une inflammation incontrôlée^11,12. En raison de l’étiologie complexe et de la présentation clinique hétérogène, le diagnostic précoce est difficile et le traitement actuel de la PR n’est pas satisfaisant. Par conséquent, le développement de nouvelles approches thérapeutiques est crucial. Des modèles animaux fiables sont essentiels pour étudier la pathogenèse de la PR afin de mieux comprendre les mécanismes potentiels de la PR et d’explorer de nouvelles stratégies de traitement.

Les modèles traditionnels de PR, tels que les modèles murins CIA et K/BxN 13,14,15, contribuent à améliorer notre compréhension de la PR. Cependant, ces modèles présentent des limites importantes. Par exemple, le modèle CIA chez les souris C57BL/6 a un faible taux de réussite et une longue période d’induction, ce qui diminue son utilité dans certains contextes expérimentaux. De même, bien que le modèle K/BxN soit précieux, il est coûteux à établir et présente des limites dans la reproduction de la pathologie complexe de la PR humaine, en particulier les interactions entre les cellules immunitaires et les cytokines.

Pour remédier à ces limitations, nous avons développé un nouveau modèle de souris PR en transférant des lymphocytes T CD4⁺ de souris SKG avec un fond C57BL/6 vers des souris C57BL/6 immunocompétentes, en combinaison avec une activation immunitaire induite par le mannane. Ce modèle reproduit efficacement les principales caractéristiques de la PR, y compris les réponses immunitaires médiées par les lymphocytes T et les caractéristiques pathologiques essentielles telles que l’inflammation synoviale et l’érosion articulaire, tout en offrant des avantages en termes de reproductibilité, de simplicité et de rentabilité. Nous avons décrit une méthodologie détaillée pour établir ce modèle, qui comprend la génération de souris SKG sur le fond C57BL/6, l’isolement des lymphocytes T CD4⁺ à partir de souris SKG, leur transfert adoptif et l’induction ultérieure par le mannane. De plus, nous décrivons les critères cliniques et histologiques utilisés pour évaluer la gravité de l’arthrite, en assurant sa fiabilité et sa reproductibilité. En imitant constamment les réponses immunitaires médiées par les lymphocytes T et les caractéristiques pathologiques fondamentales de la PR, ce modèle sert d’outil expérimental robuste et efficace pour étudier les mécanismes immunitaires, la progression de la maladie et le développement de nouveaux traitements pour la PR.

Toutes les procédures expérimentales de cette étude ont strictement suivi les directives établies par le « Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire », y compris l’élevage, les opérations expérimentales et l’euthanasie, et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale du Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology.

1. Animaux

1. Génération de souris SKG (fond C57BL/6)
   1. Stratégie d’édition génomique
      1. Concevez un ARN guide spécifique (ARNg) ciblant le gène ZAP70 (séquence d’ARNg : 5'-CAGCCCACGAGCGAATGCCCTGG-3') et effectuez l’édition de gènes avec le système CRISPR/Cas9. Concevoir un ADN donneur avec la mutation ZAP70(W163C) pour assurer une incorporation précise de la mutation (ici, CAGGCCCCACAGGTGGAGAAGCTCATTG
         CTACCACAGCCCACGAGCGAATGCCCTG
         CTATCACAGCAGCCTGACTCGTGAGGAG
         GCCGAGCGCAAACTCTATTCCGGCCA).
         REMARQUE : L’ARNg dirige la protéine Cas9 vers le site spécifique du gène ZAP70 pour une coupe précise. La base soulignée dans la séquence d’ADN du donneur indique des bases mutées. Cette mutation correspond à la mutation W163C (TGG→TGC) dans la protéine ZAP70, qui est située dans un domaine fonctionnel critique.
   2. Injection de microseringue
      1. Utilisez la micro-injection pour introduire l’ARNm, l’ARNg et l’ADN du donneur Cas9 dans les œufs de souris C57BL/6 fécondés. Co-injectez la protéine Cas9 et l’ARNg afin qu’ils clivent le gène ZAP70 et insèrent la mutation ZAP70(W163C) par recombinaison homologue. Transplantez les œufs fécondés injectés dans des souris femelles pseudo-enceintes, attendez environ 20 jours et désignez les souris nées comme la génération F0. Identifier les génotypes par amplification PCR et séquençage (voir étape 1.1.5.3).
   3. Génotypage de souris de génération F0
      1. Effectuer une PCR et un séquençage sur des souris de génération F0 pour confirmer l’acquisition de la mutation ZAP70 (W163C) (voir étape 1.1.5.3).
         REMARQUE : Les souris de la génération F0 sont chimériques en raison d’un clivage embryonnaire rapide. Ils peuvent manquer de transmission génétique stable. Mettre en place une sélection en série pour établir des lignées stables.
   4. Acquisition et identification génotypique de souris de la génération F1
      1. Élevez des souris F0 positives avec des souris C57BL/6J de type sauvage pour obtenir des souris de génération F1, et effectuez le génotypage par PCR et séquençage pour obtenir des souris SKG (contexte C57BL/6 ; voir étape 1.1.5.4).
   5. Méthodes de génotypage basées sur la PCR pour les générations F0 et F1
      1. Excisez un morceau de 0,5 cm de la queue avec des ciseaux stériles.
      2. Extrayez l’ADN de souris à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique animal.
      3. Pour F0, préparer le système de réaction PCR suivant : 13,2 μL de ddH₂O, 2 μL de tampon PCR, 2 μL de 2,5 mM dNTP, 0,5 μL de chacune des amorces avant (5'-GATGCCTAGGTGGGGGGGGTTCC-3') et inverse (5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTCTACA-3') (10 pmol/μL), 0,8 μL d’ADN polymérase et 1 μL d’ADN génomique (50-100 ng/μL) extrait des queues de souris, pour un volume de réaction final de 20 μL. Effectuer l’amplification génique à l’aide du programme PCR suivant : 94 °C pendant 3 min ; 98 °C pendant 15 s, 58 °C pendant 15 s et 68 °C pendant 1 min, pendant 35 cycles ; 68 °C pendant 5 min ; maintenir à 12 °C.
      4. Pour F1, préparer le système de réaction PCR suivant : 14,9 μL de ddH₂O, 2 μL de tampon PCR 10x Taq, 1 μL de 2,5 mM dNTP, 0,5 μL de chacune des amorces avant (5'-GATGCCTAGGTGGGGGGGGCC-3') et inverse (5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTCTACA-3') (10 pmol/μL), 0,1 μL d’ADN polymérase Taq et 1 μL d’ADN génomique (50-100 ng/μL) extrait des queues de souris, pour un volume de réaction final de 20 μL. Effectuer l’amplification génique à l’aide du programme PCR suivant : 94 °C pendant 5 min ; 94 °C pendant 30 s, 58 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 min, répété pendant 35 cycles ; 72 °C pendant 5 min ; maintenir à 12 °C.
      5. Exécutez une électrophorèse pour confirmer les produits de la taille attendue.
      6. Séquencez les produits de PCR pour vérifier à la fois le génotype et la mutation spécifique.
2. Sélection des souris donneuses et receveuses
   1. Sélectionnez des souris SKG âgées de 6 à 8 semaines (mâles ou femelles) comme souris donneuses.
   2. Sélectionnez des souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines (de préférence des femelles pour des résultats expérimentaux cohérents) comme souris receveuses.
   3. Abritez des souris C57BL/6 et SKG (âgées de 6 à 8 semaines) dans des conditions SPF dans des cages ventilées individuellement. Fournir un accès gratuit à des aliments de qualité SPF et à de l’eau stérile sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Acclimatez les souris pendant 1 semaine avant de commencer les expériences.

2. Isolement et purification des lymphocytes T CD4⁺ chez les souris SKG

1. Euthanasier les souris SKG sous une hotte stérile à flux laminaire par asphyxie au CO₂ . Plongez les souris dans de l’alcool à 75 % pendant 5 min pour les désinfecter. Localiser la rate dans la cavité abdominale ainsi que les ganglions lymphatiques (inguinal et poplité) dans les régions inguinale et poplitée. Disséquez soigneusement la rate et les ganglions lymphatiques à l’aide de pinces et de ciseaux stériles et transférez-les immédiatement dans du PBS pré-réfrigéré.
2. Placez la rate et les ganglions lymphatiques dans des boîtes de Pétri séparées. Pressez les tissus à travers une passoire cellulaire de 70 μm à l’aide du piston d’une seringue stérile et ajoutez progressivement 10 à 12 ml de PBS pré-refroidi pour former une suspension cellulaire uniforme. Passer la suspension cellulaire à travers la même crépine de 70 μm dans un tube à centrifuger de 15 mL, puis centrifuger à 300 × g pendant 7 min à 4 °C. Jetez le surnageant et conservez la pastille cellulaire.
3. Effectuer une coloration au bleu de trypan pour évaluer la viabilité cellulaire. Comptez les cellules et confirmez que la viabilité est de ≥90 %.
4. Ajustez la concentration cellulaire à 1 × 10⁸ cellules/mL à l’aide du tampon fourni dans le kit d’isolement des lymphocytes T CD4⁺ .
5. Transférez 100 μL de la suspension cellulaire (10^{7 cellules} ) dans un nouveau tube. Ajouter 10 μL de biotine-anticorps-cocktail, bien mélanger et incuber sur glace pendant 15 min.
6. Remettez les billes en suspension en tourbillonnant à vitesse maximale. Ajouter 10 μL de suspension de billes de streptavidine, bien mélanger et incuber sur de la glace pendant 15 min.
7. Ajoutez 2,5 ml de la mémoire tampon fournie dans la trousse d’isolement des lymphocytes T CD4⁺ et placez le tube dans l’aimant pendant 5 min.
8. Versez délicatement le liquide (cellules cibles) du tube dans un nouveau tube stérile, puis centrifugez à 4 °C, 300 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant et conservez la pastille cellulaire.
9. Ajouter une quantité suffisante de solution PBS stérile pour ajuster la concentration cellulaire à 2 × 10⁶ cellules/mL et maintenir la suspension sur de la glace pour une utilisation ultérieure.
10. Utilisez la cytométrie en flux pour évaluer la pureté des cellules triées (figure supplémentaire S1). Calculez la pureté cellulaire comme suit :(Nombre de lymphocytes T CD4⁺ / Nombre total de cellules) × 100 %. Confirmez que la pureté est de ≥90 %¹⁶.

3. Transfert adoptif de lymphocytes T CD4⁺

1. Anesthésie les souris C57BL/6 avec 2 à 3 % d’isoflurane, en atteignant une profondeur d’anesthésie où les souris perdent toute mobilité mais conservent une respiration spontanée normale.
2. Nettoyez délicatement le canthus interne (coin de l’œil) de la souris avec un coton-tige stérile pour éliminer les sécrétions et les poils, exposant ainsi la veine.
3. Immobiliser la souris à la main. Prélever 200 μL de suspension de lymphocytes T CD4⁺ (2 × 10^5-5 × 10⁵ cellules par souris) dans une seringue de 1 mL. Insérez l’aiguille à un angle de 10 à 15° dans la veine canthale interne, en assurant un placement précis. Injectez la suspension cellulaire lentement et uniformément pendant 10 à 15 s.
4. Après avoir retiré l’aiguille, appuyez doucement sur la zone interne du canthal avec un coton-tige stérile pendant 3 à 5 secondes pour éviter les saignements.
5. Placez la souris dans une cage silencieuse, sèche et propre pour la surveiller jusqu’à ce qu’elle reprenne complètement conscience, avec une respiration stable et aucun comportement anormal (comme des contractions ou une mort subite). Déplacez la souris dans une cage de boîtier standard après avoir confirmé un état postopératoire stable.
   REMARQUE : Comme la veine canthale interne est petite, une manipulation douce et une vitesse de perfusion contrôlée sont cruciales pour éviter la rupture de la veine ou le blocage cellulaire causé par une vitesse excessive.
6. Enregistrez les détails de la perfusion et étiquetez les souris du modèle et du groupe témoin (quatre animaux par groupe) pour éviter toute confusion lors des expériences ultérieures. Administrer des lymphocytes T CD4⁺ à des souris modèles et laisser les souris témoins non traitées. Assurez-vous que toutes les souris sont des souris receveuses.

4. Stimulation et induction du mannane

1. Effectuer l’induction de la mannane le jour 4 (72 h après la perfusion de lymphocytes T CD4⁺ ). Appliquez les mêmes conditions d’induction à toutes les souris expérimentales et témoins.
   1. Pesez la poudre de mannane et dissolvez-la dans du PBS stérile à une concentration de 100 mg/mL.
   2. Tenez correctement la souris pour exposer son abdomen. Désinfectez la peau avec de l’alcool à 75 % et identifiez le site d’injection (~1 cm sur le côté de la ligne médiane abdominale).
   3. Mélangez soigneusement la solution de mannane et prélevez le volume approprié (20-30 mg par souris) dans une seringue de 1 ml. Insérez l’aiguille à un angle de 45° dans la cavité péritonéale et injectez lentement la solution pour assurer une distribution uniforme. Retirez l’aiguille lentement et appuyez doucement sur le site d’injection avec un coton-tige stérile pendant quelques secondes pour éviter les fuites ou l’infection.
2. Placez la souris injectée dans une cage silencieuse et propre, et surveillez de près pendant 5 à 10 minutes pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuite au site d’injection, de distension abdominale ou de respiration anormale.
3. Enregistrez en détail les détails de l’injection pour chaque souris.

5. Mesures

1. Observation du phénotype clinique
   1. Évaluation des symptômes de l’arthrite
      1. Effectuez des évaluations articulaires tous les 3 jours après l’induction de la mannane. Inspectez toutes les articulations des membres antérieurs et postérieurs, en accordant une attention particulière aux articulations du genou, de la cheville, du poignet et des doigts/orteils. Évaluer la gravité de l’arthrite à l’aide de critères standard (tableau 1)¹⁷. Enregistrez et comparez les scores totaux à chaque point temporel pour évaluer la progression de l’arthrite.
2. Enregistrement des caractéristiques pathologiques tissulaires
   1. Après un mois d’induction de mannane, euthanasiez les souris sous une hotte stérile à flux laminaire en utilisant l’asphyxie au CO₂ (conformément aux directives du comité d’éthique), fixez la souris sur une planche de mousse et exposez les membres postérieurs. Incisez la peau en commençant par la cheville et pelez-la vers le haut pour exposer les muscles et les articulations. Identifier l’articulation de la cheville (entre le tibia/péroné et le talus) et les articulations métatarso-phalangiennes (entre les métatarses et les phalanges proximales) et disséquer ces articulations pour l’analyse histologique et préparer des coupes de paraffine.
   2. Fixez les tissus excisés dans du formol à 4 % pendant 72 h, puis transférez-les dans de l’acide éthylènediaminetétraacétique à 10 % (EDTA, pH 7,4) pendant 4 semaines de décalcification pour assurer une décalcification complète.
   3. Après la décalcification, lavez les tissus avec du PBS pour éliminer tout fixateur résiduel, puis déshydratez les tissus à l’aide d’une série d’éthanol gradué (75 %, 80 %, 95 %, 100 %).
      REMARQUE : Le formol peut irriter les yeux, la peau et les voies respiratoires. Il doit être manipulé dans une hotte.
   4. Incorporez le tissu dans de la paraffine à l’aide d’une machine d’enrobage de paraffine. À l’aide d’un microtome, sectionnez le tissu incrusté en tranches de 4 m d’épaisseur. Faites flotter les sections dans un bain-marie à 40 °C contenant de l’eau distillée.
   5. Transférez et séchez les sections. Placez les sections sur des lames de verre. Séchez-les une nuit à température ambiante (RT). Stockez les lames à RT pour la coloration.
   6. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)
      1. Placez les lames dans un four à 60 °C pendant 2 h pour retirer la paraffine.
      2. À température ambiante, immergez les lames dans l’ordre suivant pendant 5 min chacune : xylène → xylène → 100 % éthanol → 100 % éthanol → 95 % d’éthanol → 80 % d’éthanol → 75 % d’éthanol. Rincer à l’eau distillée pendant 2 min.
      3. Teignez les lames séquentiellement dans une solution d’hématoxyline pendant 5 min, rincez à l’eau désionisée pendant 2 min, puis traitez avec de l’ammoniac à 0,1 % pendant 1 min, rincez pendant 3 x 2 min dans de l’eau déminéralisée, teignez avec de l’éosine pendant 1 min, et enfin rincez à l’eau déminéralisée pendant 2 min.
      4. Immergez les lames pendant 5 min chacune dans de l’éthanol à 80 % → de l’éthanol à 95 % → du → du xylène → du xylène.
      5. Séchez les diapositives à l’air libre et montez-les avec de la résine neutre.
   7. Safranin O-Fast Coloration verte
      1. Déparaffinisez les sections de paraffine pour les arroser et les teindre à l’aide d’un kit de coloration Van Gieson. Montez les lames avec de la résine neutre après la coloration et capturez des images au microscope (préparé à l’étape 5.2.5).
3. Modifications des lymphocytes T et des cytokines
   1. Retirez la rate de la souris à l’aide d’outils chirurgicaux stériles.
      1. Extraire l’ARN total du tissu de la rate à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN selon les instructions du fabricant. Quantifiez la concentration et la pureté de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre et assurez-vous que le rapport A260/A280 est compris entre 1,8 et 2,0.
      2. Synthétisez l’ADNc à partir de l’ARN extrait à l’aide d’un kit de transcription inverse. Suivez le protocole du fabricant pour la configuration de la réaction et les conditions de cyclage. Conservez l’ADNc à -20 °C pour une analyse qPCR ultérieure.
      3. Effectuer une qPCR : Mesurez les niveaux d’expression relatifs de l’ARNm de Tbx21, Gata3, Il-17 et Foxp3 dans le tissu de la rate a été mesuré à l’aide de la qPCR basée sur SYBR Green dans des réactions de 10 μL contenant : 5 μL de 2x SYBR Green master mix, 0,2 μL chacune des amorces avant et inverse (10 μM ; séquences dans le tableau 2), 0,5-1 μL d’ADNc (50-100 ng/μL), et l’eau sans nucléases au volume. Utiliser les conditions de cycle thermique suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 30 s, suivie de 40 cycles de 95 °C pendant 10 s et 60 °C pendant 30 s, avec analyse de la courbe de fusion (65-95 °C). Normaliser les niveaux d’expression à Gapdh à l’aide de la méthode 2^(-ΔΔCt ).
   2. Isolement sérique et analyse des billes cytométriques (CBA)
      1. Prélevez le sang de la souris à l’aide de la méthode de collecte de sang orbitaire par énucléation, transférez le sang dans un tube de prélèvement enrobé d’anticoagulant et laissez-le reposer à température ambiante pendant 30 min. Centrifuger le sang coagulé à 4 °C, 1 000 × g pendant 15 min, prélever soigneusement le surnageant (sérum) et le conserver à -80 °C jusqu’à l’analyse.
      2. Déterminer les niveaux d’expression de l’IL-6, de l’IL-10, de l’IL-17, du TNF-α et de l’IFN-γ dans le sérum à l’aide d’une trousse d’ACA conformément aux instructions du fabricant.

Notation clinique de l’enflure articulaire et taux d’incidence chez la souris
La figure 1 montre l’évaluation clinique de l’enflure articulaire et le taux d’incidence chez les souris modèles. Les résultats indiquent que toutes les souris du groupe modèle ont développé la maladie (n = 4), avec un taux d’incidence de 100 %. Les scores dans le groupe modèle ont considérablement augmenté, ont montré un bref soulagement au cours de la deuxième semaine, puis ont augmenté sur une période de 6 semaines.

Manifestation d’un gonflement articulaire chez la souris
Les articulations des souris du groupe modèle présentent un épaississement et un gonflement significatifs, avec un gonflement et un épaississement notables également observés dans les membres antérieurs et postérieurs (Figure 2).

Résultats pathologiques des articulations de la cheville de souris
Les résultats pathologiques indiquent que, par rapport au groupe témoin, les souris du groupe modèle présentent un épaississement significatif de la synoviale dans les articulations de la cheville, une discontinuité osseuse et une agrégation marquée de cellules inflammatoires (Figure 3, Figure 4 et Figure 5).

Facteurs inflammatoires liés aux lymphocytes T sériques
Par rapport au groupe témoin, les souris du groupe modèle ont montré des augmentations significatives des taux sériques d’IL-10 (7,51 vs 2,15 pg/mL), de TNF (78,83 vs 13,11 pg/mL), d’IL-17 (101,6 vs 12,64 pg/mL) et d’IFN-γ (5,15 vs 1,90 pg/mL) (p < 0,05). L’IL-6 a également augmenté de manière significative par rapport au groupe témoin (15,59 vs 6,27 pg/mL) (p = 0,05, Figure 6).

Changements dans les sous-ensembles de lymphocytes T Th1/2/17 et les Tregs dans la rate
Les niveaux d’expression de l’ARNm de Tbx21 (Th1), Gata3 (Th2), Il-17 (Th17) et Foxp3 (Tregs) ont été mesurés pour évaluer les changements dans les sous-ensembles de lymphocytes T dans la rate. Ces gènes codent pour des facteurs de transcription et des cytokines clés qui définissent la différenciation et la fonction de leurs sous-ensembles respectifs de lymphocytes T. Par rapport au groupe témoin, les souris du groupe modèle ont montré une augmentation significative de l’expression de l’ARNm de Tbx21 (1,68 contre 0,61) et d’Il-17 (26,30 contre 0,75) dans la rate (p < 0,05) par rapport au gène de référence Gapdh.

Figure 1 : Évaluation clinique de l’enflure articulaire. (A) Souris du groupe modèle ; (B) Incidence cumulative chez les souris du groupe modèle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Manifestations de gonflement articulaire chez les souris témoins et modèles (n = 4). (A-C) Images représentatives des scores de gonflement des pattes et des articulations (0,2,4) dans les groupes témoins et modèles de souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Changements histologiques dans les articulations de la cheville de souris témoins et de souris du groupe modèle observées avec coloration à l’hématoxyline-éosine. (A) Articulation de la cheville de souris témoin ; (B) Discontinuité dans l’os de l’articulation de la cheville du groupe modèle de souris ; (C) Prolifération synoviale dans le groupe modèle souris cheville articulation. Barres d’échelle = 50 μm (première colonne), 100 μm (deuxième et troisième colonnes). Les images des Fig. 3B et 3C proviennent de la même souris, mettant en évidence des phénotypes pathologiques différents. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Différences d’épaisseur synoviale des articulations de la cheville entre les souris du groupe témoin et du groupe modèle (p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Modifications histologiques des articulations de la cheville des souris du groupe témoin et du groupe modèle observées avec coloration Safranin O-Fast Green. (A) Articulation de la cheville de la souris du groupe témoin ; (B) Prolifération synoviale dans l’articulation de la cheville de la souris du groupe modèle. Barres d’échelle = 50 μm (première colonne), 100 μm (deuxième et troisième colonnes). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Changements dans les facteurs inflammatoires liés aux lymphocytes T et les sous-ensembles chez les souris témoins et les souris du groupe modèle. (A) l’expression des facteurs inflammatoires liés aux lymphocytes T dans le sérum des souris témoins et des souris du groupe modèle et (B) les changements dans les sous-ensembles de lymphocytes T Th1/2/17 et les Tregs dans la rate. *p < 0,05, **p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Critères de notation de l’arthrite. Pour noter l’arthrite, chaque membre est noté en fonction de l’enflure et de l’érythème, avec un score de 0 à 6 attribué à chaque membre. La somme des scores pour les quatre membres est calculée pour générer le score total d’arthrite pour chaque souris.

Tableau 2 : Liste des séquences d’amorces.

Figure supplémentaire S1 : Stratégie de déclenchement pour le tri des lymphocytes T CD4⁺ par cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Le développement de la PR est étroitement associé à une infiltration anormale de cellules immunitaires dans le tissu synovial, où l’activation déréglée de ces cellules immunitaires entraîne la libération de diverses cytokines pro-inflammatoires, qui contribuent davantage à l’endommagement des structures synoviales et articulaires^18,19. Plusieurs modèles animaux de PR ont été largement évalués, notamment le modèle CIA, le modèle K/BxN et les souris SKG 13,20,21. Bien que ces modèles reproduisent avec succès les mécanismes immunitaires et les manifestations cliniques de la PR, ils présentent tous des limites importantes. Par exemple, le modèle CIA chez les souris C57BL/6 a un taux de réussite plus faible, une période d’apparition plus longue et est considérablement influencé par les conditions environnementales et expérimentales, ce qui le rend moins pratique dans certains contextes expérimentaux. Les souris SKG représentent un modèle murin de PR basé sur une mutation du gène ZAP-70, qui provoque une anomalie abrupte de la signalisation du récepteur des lymphocytes T (TCR) et induit une arthrite auto-immune²². Cependant, ce modèle est coûteux et la reproductibilité des résultats expérimentaux est facilement affectée par les conditions d’induction. K/BxN est un modèle d’arthrite héréditaire déclenché par l’activité coopérative des lymphocytes T et B, présentant une réponse immunitaire prononcée²³. Pourtant, la construction de ce modèle est coûteuse et sa spécificité est limitée, ce qui conduit à une réponse immunitaire limitée qui ne peut pas saisir entièrement le processus pathologique à multiples facettes de la PR humaine. Par conséquent, il est d’une grande importance de développer un modèle animal capable de reproduire les principales caractéristiques pathologiques de la PR, de répondre à diverses exigences expérimentales et d’assurer une reproductibilité élevée.

Dans cette étude, nous présentons une méthode pour établir un modèle de PR par le transfert adoptif de lymphocytes T CD4⁺ adaptatifs de souris SKG. La construction de ce modèle repose sur la sélection de lymphocytes T CD4⁺ de souris SKG avec un fond C57/BL6 et l’induction de mannane, un processus qui assure le succès du modèle. Il est bien connu que les souris SKG sur un fond BALB/c sont porteuses d’une mutation spontanée du gène ZAP70 (W163C), qui provoque une sélection anormale de la signalisation TCR, conduisant à des lymphocytes T hautement auto-réactifs²⁴. Cela entraîne une activation excessive des lymphocytes T et l’apparition de la synovite et de la destruction articulaire, imitant ainsi les principaux processus pathologiques de la PR tels que la réparation synoviale et l’activation des cellules immunitaires^25,26. Les caractéristiques cliniques des souris SKG ressemblent beaucoup à celles des patients humains atteints de PR.

Pour introduire cette mutation dans le fond C57BL/6, nous avons utilisé la technologie CRISPR/Cas9 pour générer avec succès un modèle de souris SKG avec le fond C57BL/6 portant la mutation ZAP70 (W163C). CRISPR/Cas9 offre une précision et une efficacité élevées, permettant l’introduction ciblée de la mutation souhaitée tout en maintenant un faible taux d’insertion hors cible ou de modifications génétiques indésirables associées aux méthodes d’induction aléatoires traditionnelles, assurant ainsi la stabilité et l’unicité du modèle^27,28. Plus important encore, cette technique réduit également considérablement le temps nécessaire à la construction du modèle, améliorant à la fois la contrôlabilité et l’efficacité du développement du modèle. En utilisant ce modèle, nous pouvons reproduire avec précision la synovite médiée par les lymphocytes T et la destruction conjointe de la PR sur un fond C57BL/6. Par rapport au fond BALB/C chez les souris SKG traditionnelles, les souris modèles sur fond C57BL/6 ont une applicabilité plus large dans la recherche immunologique et peuvent être plus facilement combinées avec d’autres modèles transgéniques (par exemple, Rag1^-/- ou IL17^-/-). Cela les rend aptes à étudier le rôle de la mutation ZAP70 dans la PR et d’autres maladies auto-immunes telles que le lupus érythémateux disséminé ou la sclérose en plaques.

Sur la base du rôle pivot^29,30 des lymphocytes T CD4⁺ dans l’activation de la PR, nous les avons sélectionnés comme médiateurs clés. Les lymphocytes T sont les principaux moteurs des réponses immunitaires dans la PR et peuvent induire directement des lésions synoviales en activant les sous-ensembles effecteurs Th1/Th17³¹, en fonction de facteurs inflammatoires tels que l’IL-6, l’IL-17 et le TNF-α^32,33. En tant que médiateurs essentiels de la régulation immunitaire, les lymphocytes T CD4⁺ sécrètent des cytokines pro-inflammatoires, déclenchant et maintenant la cascade inflammatoire, ce qui conduit à la prolifération synoviale et aux lésions articulaires, favorisant ainsi directement la progression pathologique de la PR. Ils aident les lymphocytes B à produire des anticorps spécifiques (p. ex., l’ACPA)³⁴. Pendant ce temps, la caractéristique histopathologique typique de la synoviale RA est l’agrégation des lymphocytes T CD4⁺. Certains gènes du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe II, en particulier les « épitopes partagés » liés à l’isotype de l’antigène leucocytaire humain-DR (HLA-DR), sont considérés comme étroitement liés à la pathogenèse de l’AR³⁵. De plus, la stratégie de blocage de la co-stimulation des lymphocytes T avec l’antigène 4 associé aux lymphocytes T cytotoxiques (CTLA4)-Ig a démontré une efficacité clinique significative dans l’AR³⁶. De plus, l’induction de mannane sert de puissant activateur pour le modèle, favorisant l’activation des composants immunitaires innés tels que les cellules dendritiques et les macrophages³⁷. Cette étape facilite davantage l’activation des lymphocytes T CD4⁺ et les réponses immunitaires, augmentant considérablement l’attaque du système immunitaire sur les tissus du soi, simulant ainsi les caractéristiques pathologiques de la dysrégulation immunitaire et des lésions synoviales dans la PR.

Après avoir terminé l’induction du modèle, nous avons effectué une vérification systématique du groupe modèle à l’aide de plusieurs paramètres, y compris la notation clinique de l’enflure articulaire, la validation pathologique (observation de la pathologie tissulaire de la synovite et des caractéristiques de destruction articulaire) et la validation immunologique (expression des cellules Th1/2/17 et Treg dans le sérum et la rate). Les résultats ont montré que notre modèle a réussi à reproduire la synovite médiée par les lymphocytes T et la destruction articulaire dans la PR, induisant une activation immunitaire caractéristique et des changements pathologiques synoviaux compatibles avec les principaux mécanismes physiopathologiques de la PR, avec un taux de prévalence de 100 %. Il convient de noter que dans notre modèle, le score clinique de l’articulation gonflée des souris atteint un pic à 1 semaine, montre une réduction marquée au cours de la deuxième semaine, puis augmente progressivement à nouveau dans les stades ultérieurs, ce qui n’est pas tout à fait conforme à l’évolution typique de la maladie observée dans les modèles animaux conventionnels d’arthrite³⁸. Cela peut être dû au fait que, 1 semaine après l’induction, le système immunitaire des souris modèles est dans une phase initiale intensément activée par l’injection de mannane, entraînant un pic d’inflammation articulaire. Au cours de la deuxième semaine, la régulation immunitaire et les mécanismes d’auto-récupération conduisent à un soulagement temporaire des symptômes cliniques. Au fur et à mesure que la maladie progresse, la tolérance immunitaire diminue progressivement et la réponse immunitaire s’intensifie à nouveau, ce qui se manifeste par une aggravation progressive de la maladie aux stades ultérieurs.

Bien que ce modèle soit relativement simple par rapport à d’autres modèles, il reste plusieurs points clés à aborder au cours du processus de modélisation. Tout d’abord, l’activité et la pureté des lymphocytes T CD4⁺ des souris SKG constituent la base du succès du modèle. La pureté des cellules doit dépasser 90 % pour assurer la cohérence et la fiabilité des résultats expérimentaux. Deuxièmement, la vitesse d’injection dans la veine canthale médiale doit être soigneusement contrôlée pour éviter une rupture veineuse due à une injection trop rapide ou une fuite cellulaire due à une injection trop lente. De plus, le choix de la dose cellulaire est essentiel. Une dose trop faible peut entraîner l’échec du modèle, tandis qu’une dose trop élevée peut déclencher des réponses inflammatoires non spécifiques. Par conséquent, au cours du processus de modélisation, l’état général des souris doit être surveillé de près et tout symptôme anormal doit être enregistré rapidement pour assurer le bon déroulement de l’expérience et la validité scientifique des données.

Par rapport aux modèles conventionnels, ce modèle a une période d’établissement plus courte, atteint un taux d’incidence plus élevé chez les souris C57BL/6 et reste relativement rentable et facile à utiliser. L’adoption du transfert de lymphocytes T CD4⁺ autoréactifs reproduit avec précision les réponses immunitaires médiées par les lymphocytes T et capture les principales caractéristiques pathologiques de la PR, telles que l’enflure et les lésions articulaires. De plus, ses manifestations cliniques s’alignent bien avec celles de la PR humaine, offrant un reflet plus authentique des processus cliniques et pathologiques de la PR. De plus, la combinaison de la perfusion de la veine canthale médiale et de l’induction de mannane, améliore encore la contrôlabilité et la stabilité expérimentale du modèle, ce qui le rend hautement reproductible et offre un excellent contrôle expérimental. Bien sûr, ce modèle a encore des limites. Il se concentre principalement sur les réponses immunitaires induites par les lymphocytes T ; la simulation des rôles collaboratifs des réponses anticorps médiées par les lymphocytes B et d’autres cellules immunitaires (telles que les cellules tueuses naturelles (NK) et les cellules Treg) est insuffisante, ce qui rend difficile la représentation complète des mécanismes pathologiques multicellulaires de la PR. Néanmoins, ce modèle murin de PR reste un modèle animal stable et fiable, offrant aux chercheurs une meilleure plate-forme pour simuler les réponses immunitaires médiées par les lymphocytes T et les principales caractéristiques pathologiques de la PR. Ce modèle permet aux chercheurs d’approfondir les mécanismes immunitaires et la progression pathologique de la PR, fournissant des preuves expérimentales et des outils importants pour le développement de nouvelles thérapies, en particulier pour comprendre la dérégulation immunitaire induite par les lymphocytes T et identifier des cibles thérapeutiques.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82270903, 82401588 et 81974254) et de la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (2024M751019).