小鼠类风湿关节炎的过继转移模型

在这里，我们报道了一种通过过继转移 SKG 小鼠的 CD4 ⁺ T 细胞建立类风湿性关节炎 （RA） 小鼠模型的方案，为研究 RA 的免疫机制、病理进展和新疗法的开发提供了一种快速可靠的实验工具。

类风湿性关节炎 （RA） 是一种慢性、全身性自身免疫性炎症性疾病，可能导致关节损伤、畸形、残疾甚至死亡。由于其复杂的病因和异质性的临床表现，目前的治疗策略在有效控制疾病进展方面仍然不足，特别是在实现早期诊断和提供个性化治疗方面。因此，开发新的治疗方法至关重要。为了实现这一目标，可靠的动物模型对于研究 RA 的发病机制至关重要。目前，使用了几种 RA 动物模型，包括胶原诱导的关节炎模型 （CIA）、K/BxN 模型和 SKG 小鼠。尽管这些模型可以成功模拟 RA 的免疫机制和临床表现，但它们都有明显的局限性。

在该协议中，我们描述了通过从 SKG 小鼠过继转移 CD4 ⁺ T 细胞建立 RA 小鼠模型的过程。与传统模型相比，该模型在 C57BL/6 小鼠中提供了更短的建立时间和更高的发生率 （100%）。它相对具有成本效益，涉及简单的程序，并且可靠地复制 T 细胞介导的免疫反应，确保卓越的实验控制和可重复性。我们对模型进行了全面评估，评估了关节症状等临床表型。通过临床表型评估，我们观察到明显的关节肿胀和炎症反应。此外，使用 PCR 技术测量关键转录因子的表达水平，我们发现该模型有效地模拟了 T 细胞介导的免疫反应和 RA 的关键病理特征。利用该模型，研究人员可以更好地模拟 T 细胞介导的免疫反应和 RA 的关键病理特征，从而为研究免疫机制和病理进展以及开发 RA 的新疗法提供可靠有效的实验工具。

RA 是一种慢性、系统性自身免疫性炎症性疾病，影响全球约 1% 的人口，导致高发病率和沉重的社会经济负担 ^1,2。该病的特点是持续的滑膜炎症、软骨破坏和骨侵蚀，最终导致关节畸形、残疾，严重时会导致过早死亡 ^3,4,5。RA 的发病机制涉及遗传、环境和免疫因素的相互作用，其关键特征包括细胞免疫异常激活、促炎细胞因子的过度释放和免疫耐受的破坏 ^6,7。在这个过程中，自身反应性 T 细胞，尤其是 CD4⁺ T 细胞，作为免疫调节的关键驱动因素，通过多种机制直接推动 RA 的病理进展。

辅助性 T 细胞 （Th）1 细胞产生干扰素-γ （IFN-γ），激活巨噬细胞和滑膜成纤维细胞，导致肿瘤坏死因子 （TNF）-α 和白细胞介素 （IL）-6 的释放并引起滑膜炎。Th17 细胞分泌 IL-17，IL-17 促进滑膜细胞和破骨细胞的活化，加剧软骨破坏和骨侵蚀 ^8,9。此外，CD4⁺ T 细胞通过共刺激信号激活 B 细胞，诱导产生抗瓜氨酸蛋白抗体 （ACPA） 和类风湿因子 （RF）¹⁰，从而放大炎症反应。同时，功能缺陷和 Treg 细胞数量的减少是 RA 免疫失衡的关键原因，导致炎症不受控制^11,12。由于病因复杂，临床表现异质性，早期诊断困难，目前 RA 的治疗效果不理想。因此，开发新的治疗方法至关重要。可靠的动物模型对于研究 RA 的发病机制以更深入地了解 RA 的潜在机制和探索新的治疗策略至关重要。

传统的 RA 模型，如 CIA 和 K/BxN 小鼠模型 13,14,15，有助于提高我们对 RA 的理解。但是，这些模型显示出明显的局限性。例如，C57BL/6 小鼠中的 CIA 模型成功率低，诱导期长，这降低了它在某些实验环境中的实用性。同样，尽管 K/BxN 模型很有价值，但建立成本高昂，并且在复制人类 RA 的复杂病理学方面存在局限性，尤其是免疫细胞和细胞因子之间的相互作用。

为了解决这些限制，我们通过将 CD4 ⁺ T 细胞从具有 C57BL/6 背景的 SKG 小鼠转移到免疫功能正常的 C57BL/6 小鼠中，结合甘露聚糖诱导的免疫激活，开发了一种新的 RA 小鼠模型。该模型有效地复制了 RA 的关键特征，包括 T 细胞介导的免疫反应和滑膜炎症和关节侵蚀等基本病理特征，同时在可重复性、简单性和成本效益方面具有优势。我们概述了建立该模型的详细方法，其中包括在 C57BL/6 背景上生成 SKG 小鼠、从 SKG 小鼠中分离 CD4 ⁺ T 细胞、它们的过继转移以及随后的甘露聚糖诱导。此外，我们描述了用于评估关节炎严重程度的临床和组织学标准，确保其可靠性和可重复性。通过始终模拟 T 细胞介导的免疫反应和 RA 的基本病理特征，该模型可作为研究 RA 免疫机制、疾病进展和开发新疗法的强大而有效的实验工具。

本研究的所有实验程序严格遵循《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》规定的指导方针，包括畜牧、实验作和安乐死，并得到华中科技大学同济医学院动物伦理委员会的批准。

1. 动物

1. SKG 小鼠的产生 （C57BL/6 背景）
   1. 基因编辑策略
      1. 设计靶向 ZAP70 基因的特异性向导 RNA （gRNA） （gRNA） （gRNA） 并使用 CRISPR/Cas9 系统进行基因编辑。设计具有 ZAP70（W163C） 突变的供体 DNA，以确保突变的精确掺入-n（这里，CAGGCCCCACAGGTGGAGAAGCTCATTG
         CTACCACAGCCCACGAGCGAATGCCCTG系列
         CTATCACAGCAGCCTGACTCGTGAGGAG
         GCCGAGCGCAAACTCTATTCCGGCCA）。
         注：gRNA 将 Cas9 蛋白引导至 ZAP70 基因的特定位点进行精确切割。供体 DNA 序列中 带下划线的碱基表示突变的碱基。该突变对应于 ZAP70 蛋白中的 W163C 突变 （TGG→TGC），该蛋白位于关键功能域。
   2. 微量注射器注射
      1. 使用显微注射将 Cas9 mRNA、gRNA 和供体 DNA 引入受精的 C57BL/6 小鼠卵中。共注射 Cas9 蛋白和 gRNA，使它们切割 ZAP70 基因并通过同源重组插入 ZAP70（W163C） 突变。将注射的受精卵移植到假怀孕的雌性小鼠中，等待大约 20 天，并将出生的小鼠指定为 F0 代。通过 PCR 扩增和测序鉴定基因型（参见步骤 1.1.5.3）。
   3. F0 代小鼠的基因分型
      1. 对 F0 代小鼠进行 PCR 和测序，以确认获得 ZAP70 （W163C） 突变（参见步骤 1.1.5.3）。
         注：F0 代小鼠由于胚胎快速切割而具有嵌合性。他们可能缺乏稳定的基因传递。实施系列育种，建立稳定的品系。
   4. F1 代小鼠的采集和基因型鉴定
      1. 将 F0 阳性小鼠与野生型 C57BL/6J 小鼠繁殖以获得 F1 代小鼠，并通过 PCR 和测序进行基因分型以获得 SKG 小鼠（C57BL/6 背景;参见步骤 1.1.5.4）。
   5. 基于 PCR 的 F0 和 F1 代基因分型方法
      1. 用无菌剪刀从尾巴上切下 0.5 厘米的一块。
      2. 使用动物基因组 DNA 提取试剂盒提取小鼠 DNA。
      3. 对于 F0，准备以下 PCR 反应系统：13.2 μL ddH₂O、2 μL PCR 缓冲液、2 μL 2.5 mM dNTP、0.5 μL 正向 （5'-GATGCCTAGGTGGGTGGGGTTCC-3'） 和反向 （5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTACA-3'） 引物 （10 pmol/μL）、0.8 μL DNA 聚合酶和 1 μL 从小鼠尾部提取的基因组 DNA （50-100 ng/μL）， 最终反应体积为 20 μL。使用以下 PCR 程序进行基因扩增：94 °C 3 分钟;98 °C 持续 15 s，58 °C 持续 15 s，68 °C 持续 1 分钟，共 35 个循环;68 °C 5 分钟;保持在 12 °C。
      4. 对于 F1，准备以下 PCR 反应系统：14.9 μL ddH₂O、2 μL 10x Taq PCR 缓冲液、1 μL 2.5 mM dNTP、0.5 μL 正向 （5'-GATGCCTAGGTGGGTGGGGTTCC-3'） 和反向 （5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTACA-3'） 引物 （10 pmol/μL）、0.1 μL Taq DNA 聚合酶和 1 μL 从小鼠尾部提取的基因组 DNA （50-100 ng/μL）， 最终反应体积为 20 μL。使用以下 PCR 程序进行基因扩增：94 °C 5 分钟;94 °C 持续 30 秒，58 °C 持续 30 秒，72 °C 持续 1 分钟，重复 35 个循环;72 °C 5 分钟;保持在 12 °C。
      5. 运行电泳以确认产品具有预期大小。
      6. 对 PCR 产物进行测序以验证基因型和特异性突变。
2. 供体和受体小鼠的选择
   1. 选择 6-8 周龄（雄性或雌性）的 SKG 小鼠作为供体小鼠。
   2. 选择 6-8 周龄的 C57BL/6 小鼠（最好是雌性以获得一致的实验结果）作为受体小鼠。
   3. 在 SPF 条件下将 C57BL/6 和 SKG 小鼠（6-8 周龄）放在单独通风的笼子中。在 12 小时的光照/黑暗循环中免费获得 SPF 级饲料和无菌水。在开始实验之前，让小鼠适应 1 周。

2. SKG 小鼠 CD4⁺ T 细胞的分离和纯化

1. 使用 CO₂ 窒息在无菌层流罩下对 SKG 小鼠实施安乐死。将小鼠浸入 75% 酒精中 5 分钟进行消毒。定位腹腔中的脾脏以及腹股沟和腘窝区域的淋巴结（腹股沟和腘窝）。使用无菌镊子和剪刀仔细解剖脾脏和淋巴结，并立即将它们转移到预冷的 PBS 中。
2. 将脾脏和淋巴结放入单独的培养皿中。使用无菌注射器的柱塞将组织压入 70 μm 细胞过滤器，然后逐渐加入 10-12 mL 预冷的 PBS 以形成均匀的细胞悬液。将细胞悬液通过相同的 70 μm 细胞过滤器放入 15 mL 离心管中，然后在 4 °C 下以 300 × g 离心 7 分钟。 弃去上清液并保留细胞沉淀。
3. 进行台盼蓝染色以评估细胞活力。对细胞进行计数并确认活力为 ≥90%。
4. 使用 CD4 ⁺ T 细胞分离试剂盒中提供的缓冲液将细胞浓度调节至 1 × 10⁸ 个细胞/mL。
5. 将 100 μL 细胞悬液（10、⁷ 个细胞）转移到新试管中。加入 10 μL 生物素-抗体-混合物，充分混合，并在冰上孵育 15 分钟。
6. 通过以最大速度涡旋来重悬珠子。加入 10 μL 链霉亲和素微珠悬浮液，充分混匀，并在冰上孵育 15 分钟。
7. 加入 CD4⁺ T 细胞分离试剂盒中提供的 2.5 mL 缓冲液，并将试管放入磁力架中 5 分钟。
8. 小心地将液体（靶细胞）从试管中倒入新的无菌试管中，然后在 4 °C、300 × g 下离心 5 分钟。弃去上清液并保留细胞沉淀。
9. 加入足量的无菌 PBS 溶液，将细胞浓度调节至 2 × 10⁶ 个细胞/mL，并将悬浮液置于冰上以备后用。
10. 使用流式细胞术评估分选细胞的纯度（补充图 S1）。计算细胞纯度为：（CD4 ⁺ T 细胞数/总细胞计数）× 100%。确认纯度为 ≥90%¹⁶。

3. CD4⁺ T 细胞的过继转移

1. 用 2%-3% 异氟醚麻醉 C57BL/6 小鼠，达到小鼠失去所有活动能力但保持正常自主呼吸的麻醉深度。
2. 用无菌棉签轻轻清洁小鼠的内眦（眼角），以去除分泌物和毛发，露出静脉。
3. 用手固定鼠标。将 200 μL CD4⁺ T 细胞悬液（每只小鼠 2 × 10^{个 5-5} × 10⁵ 个细胞）吸入 1 mL 注射器中。将针头以 10-15° 角插入内眦静脉，确保准确放置。在 10-15 秒内缓慢均匀地注射细胞悬液。
4. 拔针后，用无菌棉签轻轻按压内眦区域 3-5 秒，以防止出血。
5. 将鼠标放在安静、干燥、干净的笼子里进行监测，直到它完全恢复意识，呼吸稳定，无异常行为（如抽搐或猝死）。确认术后状态稳定后，将鼠标移至标准外壳笼。
   注：由于内眦静脉较小，因此轻柔的处理和控制的输注速度对于避免因速度过快而导致静脉破裂或细胞堵塞至关重要。
6. 记录输注细节并标记模型组和对照组小鼠（每组四只动物），以防止在后续实验中混淆。施用 CD4 ⁺ T 细胞对小鼠进行建模，而不处理对照小鼠。确保所有小鼠都是受体小鼠。

4. 甘露聚糖的刺激和诱导

1. 在第 4 天（CD4 ⁺ T 细胞输注后 72 小时）进行甘露聚糖诱导。将相同的诱导条件应用于所有实验小鼠和对照小鼠。
   1. 称取甘露聚糖粉末，并将其溶解在无菌 PBS 中，浓度为 100 mg/mL。
   2. 正确握住鼠标以露出其腹部。用 75% 酒精消毒皮肤并确定注射部位（距腹部中线一侧 ~1 厘米）。
   3. 彻底混合甘露聚糖溶液，并将适当体积（每只小鼠 20-30 mg）吸入 1 mL 注射器中。将针头以 45° 角插入腹膜腔并缓慢注入溶液以确保均匀分布。慢慢拔出针头，用无菌棉签轻轻按压注射部位几秒钟，以防止渗漏或感染。
2. 将注射的小鼠置于安静干净的笼子中，密切监测 5-10 min，确保注射部位无渗漏、腹胀或呼吸异常。
3. 详细记录每只鼠标的注入详细信息。

5. 测量

1. 临床表型观察
   1. 关节炎症状评分
      1. 甘露聚糖诱导后每 3 天进行一次联合评估。检查前肢和后肢的所有关节，特别注意膝盖、踝关节、手腕和手指/脚趾关节。使用标准对关节炎的严重程度进行评分（表 1）¹⁷。记录并比较每个时间点的总分，以评估关节炎的进展。
2. 记录组织病理特征
   1. 甘露聚糖诱导一个月后，使用 CO₂ 窒息（遵循伦理委员会指南）在无菌层流罩下对小鼠实施安乐死，将小鼠固定在泡沫板上，并露出后肢。从脚踝开始切开皮肤，然后向上剥离以露出肌肉和关节。识别踝关节（胫骨/腓骨和距骨之间）和跖趾关节（跖骨和近端指骨之间）并解剖这些关节以进行组织学分析并准备石蜡切片。
   2. 将切除的组织在 4% 福尔马林中固定 72 小时，然后将它们转移到 10% 乙二胺四乙酸（EDTA，pH 7.4）中脱钙 4 周以确保完全脱钙。
   3. 脱钙后，用 PBS 洗涤组织以去除任何残留的固定剂，然后通过分级乙醇系列（75%、80%、95%、100%）使组织脱水。
      注意：福尔马林会刺激眼睛、皮肤和呼吸道。它应该在通风橱中处理。
   4. 使用石蜡包埋机将组织包埋在石蜡中。使用切片机将包埋的组织切成 4 μm 厚的切片。将切片漂浮在含有蒸馏水的 40 °C 水浴中。
   5. 转移并干燥切片。将切片放在载玻片上。在室温 （RT） 下干燥过夜。将载玻片储存在 RT 中进行染色。
   6. 苏木精和伊红 （H&E） 染色
      1. 将载玻片放入 60 °C 烘箱中 2 小时以去除石蜡。
      2. 在室温下，按以下顺序将载玻片浸入 5 分钟：二甲苯→二甲苯→ 100% 乙醇→ 100% 乙醇→ 95% 乙醇→ 80% 乙醇→ 75% 乙醇。用蒸馏水冲洗 2 分钟。
      3. 在苏木精溶液中依次染色玻片 5 分钟，用去离子水冲洗 2 分钟，然后用 0.1% 氨水处理 1 分钟，用去离子水冲洗 3 x 2 分钟，用伊红染色 1 分钟，最后用去离子水冲洗 2 分钟。
      4. 将载玻片分别浸入 80% 乙醇→ 95% 乙醇→ 100% 乙醇→二甲苯→二甲苯中 5 分钟。
      5. 自然风干玻片并用中性树脂封片。
   7. Safranin O-Fast Green 染色
      1. 将石蜡切片脱蜡到水中，并使用 Van Gieson 染色试剂盒对其进行染色。染色后用中性树脂安装载玻片，并在显微镜下捕获图像（在步骤 5.2.5 中准备）。
3. T 细胞和细胞因子的变化
   1. 使用无菌手术工具从小鼠身上去除脾脏。
      1. 根据制造商的说明，使用 RNA 提取试剂盒从脾组织中提取总 RNA。使用分光光度计定量 RNA 浓度和纯度，并确保 A260/A280 比率在 1.8 和 2.0 之间。
      2. 使用逆转录试剂盒从提取的 RNA 中合成 cDNA。遵循制造商的反应设置和循环条件方案。将 cDNA 储存在 -20 °C 用于后续的 qPCR 分析。
      3. 进行 qPCR：使用基于 SYBR Green 的 qPCR 测量脾组织中 Tbx21、Gata3、Il-17 和 Foxp3 的相对 mRNA 表达水平，反应体积为：5 μL 2x SYBR Green 预混液，正向和反向引物各 0.2 μL（10 μM;表 2 中的序列），0.5-1 μL cDNA（50-100 ng/μL）， 和无核酸酶的水体积。使用以下热循环条件：在 95 °C 下初始变性 30 秒，然后在 95 °C 下 10 秒和 60 °C 下 30 秒的 40 个循环，进行熔解曲线分析 （65-95 °C）。使用 2^{（-ΔΔCt）} 方法将表达水平标准化为 Gapdh。
   2. 血清分离和细胞微球阵列 （CBA） 分析
      1. 使用眼眶摘除法的眼眶采血从小鼠收集血液，将血液转移到抗凝剂涂层的收集管中，并在室温下静置 30 分钟。将凝结的血液在 4 °C、1,000 × g 离心 15 分钟，小心收集上清液（血清），并将其储存在 -80 °C 直至分析。
      2. 根据制造商的说明，使用 CBA 试剂盒测定血清中 IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α 和 IFN-γ 的表达水平。

小鼠关节肿胀及发生率的临床评分
图 1 显示了模型小鼠关节肿胀的临床评分和发病率。结果表明，模型组中的所有小鼠都发生了这种疾病 （n = 4），发病率为 100%。模型组的分数显着增加，在第二周出现短暂缓解，随后在 6 周内上升。

小鼠关节肿胀表现
模型组小鼠的关节表现出明显的增厚和肿胀，前肢和后肢也观察到明显的肿胀和增厚（图 2）。

小鼠踝关节的病理结果
病理结果表明，与对照组相比，模型组小鼠踝关节滑膜明显增厚，骨骼不连续，炎症细胞明显聚集（图 3、 图 4 和 图 5）。

血清 T 细胞相关炎症因子
与对照组相比，模型组小鼠的血清 IL-10 水平（7.51 vs 2.15 pg/mL）、TNF（78.83 vs 13.11 pg/mL）、IL-17（101.6 vs 12.64 pg/mL）和 IFN-γ（5.15 vs 1.90 pg/mL）水平显著增加（p < 0.05）。与对照组相比，IL-6 也显著增加 （15.59 vs 6.27 pg/mL） （p = 0.05， 图 6）。

脾脏中 T 细胞亚群 Th1/2/17 和 Treg 的变化
测量 Tbx21 （Th1） 、 Gata3 （Th2） 、 Il-17 （Th17） 和 Foxp3 （Tregs） 的 mRNA 表达水平，以评估脾脏 T 细胞亚群的变化。这些基因编码关键转录因子和细胞因子，这些转录因子和细胞因子定义了它们各自 T 细胞亚群的分化和功能。与对照组相比，模型组小鼠显示相对于内参基因 Gapdh，脾脏中 Tbx21 （1.68 对 0.61） 和 Il-17 （26.30 对 0.75） 的 mRNA 表达显著增加 （p < 0.05）。

图 1：关节肿胀的临床评分。 （A） 模型组小鼠;（B） 模型组小鼠的累积发生率。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：对照和模型小鼠的关节肿胀表现 （n = 4）。 （A-C） 对照组和模型小鼠的爪子和关节肿胀评分 （0,2,4） 的代表性图像。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：用苏木精-伊红染色观察到的对照组和模型组小鼠踝关节的组织学变化。 （A） 对照小鼠踝关节;（B） 模型组小鼠踝关节骨骼不连续性;（C） 模型组小鼠踝关节滑膜增生。比例尺 = 50 μm（第一列），100 μm（第二列和第三列）。图 3B 和 3C 中的图像来自同一只小鼠，表现出不同的病理表型。请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：对照组和模型组小鼠踝关节滑膜厚度的差异 （p < 0.05）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：用 Safranin O-Fast Green 染色观察到的对照组和模型组小鼠踝关节的组织学变化。 （A） 对照组小鼠的踝关节;（B） 模型组小鼠踝关节滑膜增生。比例尺 = 50 μm（第一列），100 μm（第二列和第三列）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6：对照组和模型组小鼠 T 细胞相关炎症因子和亚群的变化。 （A） 对照组和模型组小鼠血清中 T 细胞相关炎症因子的表达，以及 （B） 脾脏中 T 细胞亚群 Th1/2/17 和 Tregs 的变化。*p < 0.05，**p < 0.01。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：关节炎评分标准。 为了对关节炎进行评分，根据肿胀和红斑对每个肢体进行评分，每个肢体的评分为 0-6。将所有四个肢体的分数相加以生成每只小鼠的关节炎总分。

表 2：引物序列列表。

补充图 S1：通过流式细胞术对 CD4 ⁺ T 细胞进行分选的门控策略。请点击此处下载此文件。

RA 的发展与滑膜组织中异常的免疫细胞浸润密切相关，这些免疫细胞的失调激活导致各种促炎细胞因子的释放，从而进一步导致滑膜和关节结构的损伤^18,19。几种 RA 动物模型已被广泛评估，包括 CIA 模型、K/BxN 模型和 SKG 小鼠 13,20,21。虽然这些模型成功地复制了 RA 的免疫机制和临床表现，但它们都存在重大局限性。例如，C57BL/6 小鼠中的 CIA 模型成功率较低，起效期较长，并且受环境和实验条件的显着影响，使其在某些实验环境中不太实用。SKG 小鼠代表基于 ZAP-70 基因突变的 RA 小鼠模型，该突变会导致 T 细胞受体 （TCR） 信号转导突然异常并诱导自身免疫性关节炎²²。然而，这种模型成本高昂，并且实验结果的可重复性很容易受到诱导条件的影响。K/BxN 是一种由 T 细胞和 B 细胞的协同活性触发的遗传性关节炎模型，表现出明显的免疫反应²³。然而，构建这个模型成本高昂，而且其特异性受到限制，导致免疫反应有限，无法完全捕捉人类 RA 的多方面病理过程。因此，开发一种能够复制 RA 关键病理特征、满足各种实验要求并确保高重现性的动物模型非常重要。

在这项研究中，我们提出了一种通过过继转移 SKG 小鼠的适应性 CD4 ⁺ T 细胞来建立 RA 模型的方法。该模型的构建依赖于从具有 C57/BL6 背景的 SKG 小鼠中选择 CD4⁺ T 细胞和诱导甘露聚糖，这一过程确保了模型的成功。众所周知，BALB/c 背景下的 SKG 小鼠携带自发性 ZAP70 基因突变 （W163C），这会导致 TCR 信号转导选择异常，导致高度自反应性 T 细胞²⁴。这会导致 T 细胞过度活化以及滑膜炎和关节破坏的发生，从而模拟 RA 的关键病理过程，例如滑膜修复和免疫细胞活化^25,26。SKG 小鼠的临床特征与人类 RA 患者的临床特征非常相似。

为了将这种突变引入 C57BL/6 背景中，我们采用 CRISPR/Cas9 技术成功生成了携带 ZAP70 （W163C） 突变的 C57BL/6 背景 SKG 小鼠模型。CRISPR/Cas9 具有高精度和高效率，能够靶向引入所需的突变，同时保持与传统随机诱导方法相关的低脱靶插入率或不需要的基因修饰，从而确保模型的稳定性和唯一性^27,28。更重要的是，该技术还显著减少了模型构建所需的时间，提高了模型开发的可控性和效率。使用这个模型，我们可以在 C57BL/6 背景下精确复制 T 细胞介导的滑膜炎和 RA 的关节破坏。与传统 SKG 小鼠的 BALB/C 背景相比，C57BL/6 背景下的模型小鼠在免疫学研究中具有更广泛的适用性，并且更容易与其他转基因模型（例如，Rag1^-/- 或 IL17^-/-）结合。这使得它们适用于研究 ZAP70 突变在 RA 和其他自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮或多发性硬化症）中的作用。

基于 CD4 ⁺ T 细胞^29,30 在 RA 激活中的关键作用，我们选择它们作为关键介质。T 细胞是 RA 中免疫反应的主要驱动因素，可通过激活 Th1/Th17 效应子亚群³¹ 直接诱导滑膜损伤，具体取决于 IL-6、IL-17 和 TNF-α 等炎症因子^32,33。CD4⁺ T 细胞作为免疫调节的关键介质，分泌促炎细胞因子，触发并维持炎症级联反应，导致滑膜增生和关节损伤，从而直接促进 RA 的病理进展。它们有助于 B 细胞产生特异性抗体（例如 ACPA）³⁴。同时，RA 滑膜的典型组织病理学特征是 CD4⁺ T 细胞聚集。某些 II 类主要组织相容性复合体 （MHC） 基因，尤其是与人类白细胞抗原-DR 同种型 （HLA-DR） 相关的“共享表位”，被认为与 RA³⁵ 的发病机制密切相关。此外，用细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4 （CTLA4）-Ig 阻断 T 细胞共刺激的策略已在 RA³⁶ 中显示出显着的临床疗效。此外，甘露聚糖诱导可作为模型的有效激活剂，促进树突状细胞和巨噬细胞等先天免疫成分的激活³⁷。这一步骤进一步促进了 CD4⁺ T 细胞活化和免疫反应，显着增加了免疫系统对自身组织的攻击，从而模拟了 RA 中免疫失调和滑膜损伤的病理特征。

完成模型诱导后，我们使用多个参数对模型组进行了系统验证，包括关节肿胀的临床评分、病理验证 （观察滑膜炎组织病理和关节破坏特征） 和免疫学验证 （血清和脾脏中 Th1/2/17 和 Treg 细胞的表达）。结果表明，我们的模型成功复制了 T 细胞介导的 RA 滑膜炎和关节破坏，诱导特征性免疫激活和滑膜病理变化，与 RA 的主要病理生理机制一致，患病率为 100%。值得注意的是，在我们的模型中，小鼠的临床关节肿胀评分在 1 周达到峰值，在第 2 周显示明显降低，然后在后期逐渐再次上升，这与在常规关节炎动物模型中观察到的典型病程不完全一致³⁸。这可能是因为，在诱导后 1 周，模型小鼠的免疫系统因注射甘露聚糖而处于强烈激活的初始阶段，导致关节炎症达到高峰。第 2 周，免疫调节和自我恢复机制导致临床症状暂时缓解。随着疾病的进展，免疫耐受逐渐减弱，免疫反应再次增强，表现为后期病情逐渐恶化。

尽管与其他模型相比，此模型相对简单，但在建模过程中仍有几个关键点需要解决。首先，SKG 小鼠 CD4⁺ T 细胞的活性和纯度构成了模型成功的基础。细胞纯度应超过 90%，以保证实验结果的一致性和可靠性。其次，应仔细控制注射到内眦静脉的速度，以避免注射过快导致静脉破裂或注射过慢导致细胞渗漏。此外，细胞剂量的选择至关重要。剂量过低可能导致模型失败，而剂量过高可能会触发非特异性炎症反应。因此，在造模过程中，应密切监测小鼠的整体状况，如有异常症状应及时记录，以保证实验的顺利进行和数据的科学有效性。

与传统模型相比，该模型具有更短的建立时间，在 C57BL/6 小鼠中实现了更高的发病率，并且保持相对成本效益且易于作。采用自身反应性 CD4⁺ T 细胞的转移可准确再现 T 细胞介导的免疫反应，并捕获 RA 的关键病理特征，例如关节肿胀和损伤。此外，其临床表现与人类 RA 的临床表现非常一致，更真实地反映了 RA 的临床和病理过程。此外，内眦静脉输注与甘露聚糖诱导相结合，进一步提高了模型的可控性和实验稳定性，使其重现性高，提供了出色的实验控制。当然，这种模式仍然存在局限性。它主要关注 T 细胞驱动的免疫反应;对 B 细胞介导的抗体反应和其他免疫细胞 （如自然杀伤 （NK） 细胞和 Treg 细胞） 的协同作用的模拟不足，因此很难完全代表 RA 的多细胞病理机制。尽管如此，这种 RA 小鼠模型仍然是一种稳定可靠的动物模型，为研究人员提供了一个更好的平台来模拟 T 细胞介导的免疫反应和 RA 的主要病理特征。该模型使研究人员能够深入研究 RA 的免疫机制和病理进展，为开发新疗法提供重要的实验证据和工具，特别是在了解 T 细胞驱动的免疫失调和确定治疗靶点方面。

作者没有需要披露的利益冲突。

这项工作得到了中国国家自然科学基金 （82270903、82401588 和 81974254） 和中国博士后科学基金 （2024M751019） 的资助。