Isolamento di piccole vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali da campioni di grande volume con conformità GMP per studi clinici

Piccole vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali (MSC-sEVs) sono state evidenziate come una modalità di trattamento priva di cellule con effetti avversi minimi. Questo studio fornisce un protocollo che combina l'emodialisi con l'ultracentrifugazione, riducendo significativamente il tempo dedicato all'intero processo e garantendo la conformità agli standard delle buone pratiche di fabbricazione (GMP).

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) derivate da cellule staminali mesenchimali (MSC-sEVs) sono state evidenziate come una modalità di trattamento cell-free con effetti avversi minimi. Al contrario, i metodi di estrazione tradizionali come l'ultracentrifugazione e la cromatografia ad esclusione dimensionale sono limitati dall'intensità del tempo, dal costo e dalla scalabilità. Per superare questi limiti, proponiamo un metodo che integra un emodializzatore e un'ultracentrifugazione. Questo approccio utilizza un dispositivo per emodialisi con una membrana di cut-off del peso molecolare (MWCO) da 100 kDa, che concentra selettivamente le sEV filtrando una pletora di proteine, migliorando così la resa e la purezza delle sEV. Questa fase iniziale di purificazione è seguita dall'ultracentrifugazione per affinare ulteriormente la preparazione della sEV. L'integrazione di queste due tecnologie non solo ha ridotto significativamente il tempo dedicato all'intero processo, ma ha anche garantito la conformità agli standard GMP (Good Manufacturing Practice). Il metodo dimostra un'elevata efficienza nell'isolamento delle sEV da un grande volume di campioni, offrendo un progresso significativo rispetto ai metodi tradizionali. Questo protocollo promette di accelerare la traduzione delle terapie basate sulle vescicole extracellulari nella pratica clinica, fornendo una soluzione scalabile, economica e conforme alle GMP.

Le piccole vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali (MSC-sEV) sono vescicole eterogenee arricchite con molteplici componenti come mRNA, micro-RNA, citochine, lipidi e metaboliti¹. Negli ultimi anni, molti studi hanno sottolineato l'immenso potenziale terapeutico delle MSC-sEV come modalità di trattamento senza cellule con effetti avversi minimi², dimostrandosi promettenti nell'affrontare uno spettro di condizioni, tra cui l'invecchiamento, la degenerazione tissutale, il cancro e il disturbo infiammatorio ^3,4,5,6. Ciononostante, persiste una sfida critica nell'estrazione su larga scala di sEV, con i metodi tradizionali che si dimostrano laboriosamente dispendiosi in termini di tempo o economicamente irrealizzabili. Inoltre, garantire la riproducibilità è fondamentale per l'applicazione clinica e la traduzione delle terapie basate su EV⁷. I ricercatori hanno un disperato bisogno di un metodo di purificazione che non sia solo semplice ed efficiente, ma anche conforme agli standard di buona pratica di fabbricazione (GMP)⁸.

I metodi di purificazione convenzionali, tra cui l'ultracentrifugazione, l'ultrafiltrazione, la cromatografia ad esclusione dimensionale, l'immunoaffinità e la precipitazione polimerica, sono stati ampiamente applicati in ricerche precedenti⁹. In generale, i metodi tradizionali per l'isolamento delle sEV presentano limitazioni come basso tasso di resa, purezza compromessa e sfide nel soddisfare rigorosi standard asettici. Inoltre, ricerche precedenti hanno riportato il potenziale di tecniche promettenti come i sistemi microfluidici^10,11, l'isolamento magnetico senza marcatura¹² e l'isolamento chimico covalente¹³ per ottenere prestazioni eccezionali. Tuttavia, la necessità di attrezzature specializzate rende queste tecniche avanzate difficili da adottare per la maggior parte dei team di ricerca. In sintesi, il metodo efficiente per isolare le sEV di grado GMP da un grande volume di campioni rimane un ostacolo critico, limitando il progresso di numerosi team sia nella ricerca che nelle applicazioni cliniche.

L'ultracentrifugazione è il metodo più adottato per l'isolamento delle sEV ed è riconosciuto come il metodo gold standard^14,15. Si tratta di una tecnica che sfrutta le differenze di densità e dimensioni per isolare le sEV. Le sEV isolate vengono comunemente risciacquate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per eliminare i contaminanti residui. Quindi, un volume appropriato di PBS viene generalmente utilizzato per risospendere le sEV risciacquate e diverse concentrazioni attese di sEV possono essere raccolte controllando il volume di PBS. Inoltre, è stato riportato che la purezza delle sEV plasmatiche ottenute mediante ultracentrifugazione sembra essere migliore di quella delle sEV plasmatiche isolate mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e le sEV ottenute mediante ultracentrifugazione hanno impurità inferiori alle particelle extracellulari non vescicolari (NVEP). Questo rende anche l'ultracentrifugazione la più utilizzata e difficile da sostituire in molti trattamenti che richiedono alte concentrazioni di sEV. Tuttavia, oltre alla qualità e alla purezza, anche l'efficienza è un fattore che non può essere ignorato nell'estrazione di grandi volumi di sEV. Finora, un singolo ciclo di ultracentrifugazione può supportare un volume di campione fino a circa 600 mL, il che determina che è difficile soddisfare la domanda di estrazione su larga scala con la sola ultracentrifugazione¹⁶.

Un dispositivo per emodialisi è costituito da un modulo basato su membrana che ospita migliaia di fibre cave. Il sangue circola attraverso queste fibre all'interno di una camera cilindrica chiusa¹⁷. I costituenti del sangue possono passare selettivamente attraverso queste membrane in base alle loro dimensioni molecolari e alla concentrazione ionica. In clinica, è ampiamente utilizzato come rene artificiale per rimuovere i prodotti di scarto e i liquidi in eccesso dal sangue dei pazienti 18,19,20. In altre parole, l'emodializzatore ha anche il potenziale per concentrare campioni di grandi volumi, basandosi su un processo simile alla filtrazione a flusso tangenziale (TFF). Nelle recenti linee guida emesse dall'International Society for Extracellular Vesicles (ISEV), i concentrati di sEV sono considerati adatti per campioni di grande volume, come i terreni di coltura cellulare. Dopo decenni di sviluppo, gli emodializzatori sono stati ampiamente adottati negli ospedali, supportati da un'abbondanza di materiali di consumo maturi e da un pool di operatori qualificati, che rende più facile mantenere sterile il campione.

Questo studio presenta un metodo di purificazione sEV basato su un emodializzatore e un'ultracentrifuga compatibile con le GMP. In questo caso, abbiamo scelto dializzatori con cut-off del peso molecolare (MWCO) di 100 kDa, che hanno dimostrato di catturare efficacemente le sEV e filtrare numerose proteine²². L'ultracentrifugazione fornisce anche una fase per un'ulteriore purificazione. Il lavoro dimostra che l'emodializzatore è ugualmente adatto per la concentrazione di sEVs. Questo protocollo consente ai ricercatori di isolare in modo efficiente le sEV da campioni di grandi volumi. Abbiamo registrato lo studio clinico nel registro cinese degli studi clinici (ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018), che è ancora in corso e non è stato ancora completato. Sebbene i dati clinici non siano prontamente disponibili per la pubblicazione in questo momento, un metodo affidabile, su larga scala, efficiente e conforme per la produzione di sEV come riportato in questo protocollo è un prerequisito per condurre studi preclinici e clinici.

Il protocollo è stato approvato e condotto in conformità con il Comitato Etico per la Ricerca Umana del Southwest Hospital.

1. Rimozione dei detriti cellulari dal terreno di coltura

NOTA: Le procedure seguenti devono essere eseguite in un ambiente conforme alle GMP, soprattutto quando i campioni possono essere esposti direttamente all'ambiente.

1. Dato il requisito di assenza di microbiota, assicurarsi che il filtro e il tubo di gomma siano sterilizzati in autoclave per una sterilizzazione efficace. Assicurarsi che tutti gli altri materiali di consumo che potrebbero incontrare il terreno di coltura siano sterili e in confezioni sigillate. Eseguire il processo di rimozione dei detriti cellulari in una cappa a flusso laminare.
2. Assemblare la membrana di filtrazione da 0,45 μm e 0,22 μm all'apparato filtrante. Collegare una pompa peristaltica (vedi Tabella dei materiali) e l'apparato filtrante con il tubo di gomma. Posizionare la membrana da 0,45 μm sopra la membrana da 0,22 μm; in caso contrario, potrebbe diminuire l'efficienza di filtrazione (Figura 1). Prestare attenzione a distinguere tra i lati anteriore e posteriore della membrana di microfiltrazione.
3. Avviare la pompa peristaltica per la filtrazione. Alimentato dalla pompa, il terreno basale delle cellule staminali mesenchimali (MSCBM) con un supplemento del 5% (vedi Tabella dei materiali) passa attraverso il filtro da un'estremità e il terreno di coltura filtrato può essere ottenuto all'altra estremità del filtro, come mostrato in (Figura 1). Raccogliere il terreno di coltura filtrato in una sacca di drenaggio con doppi canali. Mantenere l'integrità del sistema di filtrazione ottimizzando la velocità della pompa peristaltica e sostituendo la membrana filtrante secondo necessità.
4. Al termine della filtrazione, chiudere la valvola di ingresso sulla sacca di drenaggio e sigillarla ulteriormente con parafilm (vedere la Tabella dei materiali). Continuare con il passaggio successivo o conservare temporaneamente il terreno di coltura cellulare filtrato a 4 °C.

2. Concentrare il terreno di coltura filtrato con un emodializzatore

NOTA: Astenersi dall'utilizzare il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco contenente rosso fenolo in coltura cellulare, poiché il rilevatore di perdite di sangue nell'emodializzatore verrà attivato o spegnerà il rilevatore di perdite di sangue nell'impostazione dell'emodializzatore.

1. Preparare i materiali di consumo.
   1. Preparare le linee di sangue, le membrane in polisulfone ad alto flusso MWCO da 100 kDa, il dializzatore del sangue, il set per infusione, la soluzione salina fisiologica, la sacca per infusione, la soluzione di iodio e i tamponi di cotone prima della concentrazione (vedere la Tabella dei materiali).
2. Accensione del sistema e autotest.
   1. Controllare il collegamento del cavo di alimentazione dell'emodializzatore e accendere l'alimentazione principale.
   2. Attendere che la macchina completi l'intera procedura di autodiagnosi.
3. Installa le linee di sangue e il dializzatore.
   1. Verificare le date di scadenza delle linee di sangue monouso e del dializzatore, assicurandosi dell'integrità della loro confezione esterna e controllando eventuali danni alle linee.
   2. Installare il tubo nella stessa direzione del flusso sanguigno nel circuito extracorporeo, chiudendo in sequenza le valvole di derivazione per formare una circolazione a circuito chiuso.
4. Avviare la procedura di risciacquo.
   1. Utilizzare un set per infusione per collegare la soluzione salina fisiologica (senza eparina) da un tubo prima della pompa al circuito di dialisi. Collegare il sito di raccolta venosa alla sacca del fluido di scarto.
      NOTA: La soluzione fisiologica non deve contenere eparina o altri anticoagulanti.
   2. Collegare le linee di alimentazione/ritorno del dializzatore al dializzatore.
   3. Avviare l'emodializzatore e impostare la portata a 80-100 mL/min. Espellere tutta l'aria dal circuito di dialisi e dal dializzatore per garantire che l'intero sistema di tubi sia pieno di liquido.
   4. Regolare il piano del liquido nelle camere arteriosa e venosa a circa 2/3 di pieno. La soluzione salina scorre in sequenza attraverso la linea arteriosa, il dializzatore, la linea venosa e la sacca del liquido di scarto.
5. Avviare la concentrazione di ultrafiltrazione.
   1. Al termine della procedura di risciacquo, appendere la sacca di drenaggio contenente il terreno di coltura filtrato sul supporto per infusione, disinfettare il canale di uscita con tamponi di cotone imbevuti di iodio e collegare il canale di uscita della sacca di drenaggio a una porta pre-pompa utilizzando un set per infusione.
   2. Unisci la porta arteriosa e la porta venosa delle linee di sangue. Stabilire un circuito di dialisi di ultrafiltrazione isolato (ISO-UF, ultrafiltrazione senza flusso di dializzato) (Figura 1).
   3. Regolare il volume target di ultrafiltrazione sulla macchina per dialisi in modo che corrisponda al volume totale di liquido presente nella sacca di drenaggio. Impostare il tempo di dialisi dell'ultrafiltrazione sul tempo minimo di funzionamento del sistema. Dopo che i parametri sono stati impostati correttamente, avviare l'ultrafiltrazione.
      NOTA: A causa del calcolo del sistema di emodialisi, il tempo di dialisi non sarà troppo breve ma sarà mantenuto a una velocità più moderata.
6. Ottenere il fluido concentrato.
   1. Dopo aver raggiunto il volume di disidratazione target, chiudere il morsetto arterioso e collegare la porta venosa a una sacca per infusione sterile.
   2. Aprire la porta di pre-pompaggio delle linee ematiche monouso dotate di filtro dell'aria. Attivare la pompa del sangue a una velocità di circa 50 ml/min, consentendo al fluido all'interno delle linee sanguigne di circolare nuovamente dalla linea arteriosa alla linea venosa. Ritrarre tutto il fluido concentrato, circa 158 ml, dal circuito nella sacca sterile per infusione.
   3. Nella fase avanzata della concentrazione, raccogliere il liquido di scarto dalla linea di ritorno del dializzato. Applicare processi successivi identici a quelli del terreno di coltura concentrato al campione di fluido sprecato per monitorare eventuali perdite accidentali di sEV che potrebbero essersi verificate durante la concentrazione.
   4. Chiudere tutte le valvole e rimuovere la sacca per infusione, il dializzatore e tutte le linee. Spegnere l'alimentazione e disinfettare la macchina strofinandola.

3. Separazione delle sEV con ultracentrifuga

1. Trasferire il terreno di coltura concentrato in provette per ultracentrifuga e quindi bilanciarle.
2. Centrifugare in un'ultracentrifuga di grado clinico (vedi Tabella dei materiali) a 110.000 × g per 70 minuti, quindi lavare il pellet con soluzione salina sterile e procedere con una seconda centrifugazione a 110.000 × g per altri 70 minuti.
3. Risospendere le sEV pellettate in una quantità appropriata di soluzione salina sterile.
4. Trasferire le sEV in una provetta sterile per ulteriori test o conservarle a -80 °C per un uso futuro.

4. Caratterizzazione delle sEV ottenute

1. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
   1. Diluire le sEV ottenute (1 μL) con PBS (1 mL) (vedi Tabella dei materiali). Regolare il numero di sEV visibili nel campo visivo corrente in modo che sia compreso tra 50 e 200.
   2. Iniettare con cura il campione diluito nel pozzetto del campione, evitando l'introduzione di bolle d'aria.
   3. Eseguire la misurazione quando il numero di particelle nel campo visivo è il più alto e stabile possibile per tutte le posizioni. I parametri di analisi sono i seguenti: Area massima: 1000, Area minima: 10, Luminosità minima: 30, Lunghezza traccia: 15, Temperatura: 25 °C, Sensibilità: 75.
   4. Misurare ogni campione almeno tre volte.
2. Analisi del Western blotting
   1. Soluzione diluita di sEVs in PBS. Utilizzare un kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinconinnico (BCA) (vedere la Tabella dei materiali) per misurare la concentrazione proteica.
   2. Far bollire i sEV nel tampone del campione a 100 °C per 5 minuti.
   3. Preparare un gel per elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide al 12% (SDS-PAGE) (vedi Tabella dei materiali). Assemblare l'apparecchio per elettroforesi su gel. Caricare quantità uguali di proteine di ciascun campione nei pozzetti del gel SDS-PAGE. Impostare la tensione dell'elettroforesi a 80 V per la concentrazione e a 100 V per la separazione.
   4. Attivare la membrana in polivinilidene difluoruro (PVDF) (vedere la Tabella dei materiali) con metanolo per 1 minuto, quindi immergere la membrana in PVDF nel tampone di trasferimento prima di procedere con il trasferimento a 100 V per 1 ora.
   5. Immergere la membrana PVDF in tampone TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl e 0,1% Tween 20) contenente il 5% di albumina sierica bovina (BSA; vedere Tabella dei materiali) e quindi bloccare per 30 minuti.
   6. Incubare la membrana in PVDF con l'anticorpo primario per una notte a 4 °C su un agitatore. Gli anticorpi primari utilizzati sono i seguenti: anti-CD63 umano (diluizione 1:1000), anti-CD9 umano (diluizione 1:1000) e anti-HSP70 umano (diluizione 1:1000) (vedi Tabella dei materiali).
   7. Il giorno successivo, lavare la membrana in PVDF con la soluzione di TBST cinque volte per 5 minuti ciascuna e quindi incubare con anticorpo secondario coniugato HRP (diluizione 1:10000) (vedere la Tabella dei materiali) a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
   8. Dopo aver lavato con TBST cinque volte, utilizzare un reagente di rilevamento della chemiluminescenza per l'imaging su un sistema a chemiluminescenza.
3. Microscopia elettronica a trasmissione
   1. Aggiungere una goccia di campione diluita con PBS da 20 μl a una carta oleata. Quindi, posizionare una griglia di rame (vedere Tabella dei materiali) sulla goccia in modo che la goccia del campione possa coprire la griglia di rame e lasciarla riposare a RT per 20 minuti.
   2. Assorbire il liquido in eccesso con carta da filtro. Quindi, fissare i campioni in una soluzione da 20 μL di paraformaldeide al 2%, glutaraldeide al 2% e una soluzione di fosfato 0,05 M per 2 minuti.
   3. Sciacquare la griglia di rame tre volte con acqua bidistillata, quindi colorare con 20 μL di acido fosfotungstico al 2% (PTA) per 1 minuto a RT.
   4. Assorbire il liquido ridondante con carta da filtro. Asciugare le griglie per una notte prima di essere analizzate mediante microscopia elettronica a trasmissione (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Le impostazioni consigliate per TEM sono le seguenti: Esposizione: 1,0 s, Tensione HT 100,00 kV, Corrente del fascio: 50 μA, Dimensione spot: 1, Modalità: TEM. Queste impostazioni potrebbero cambiare seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).

Caratterizzazione morfologica delle sEV
Nella fase finale della concentrazione, anche il fluido sprecato è stato raccolto come descritto. Il mezzo concentrato e il fluido di scarto sono stati ultracentrifugati, rispettivamente. Abbiamo raccolto le precipitazioni per l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Come anticipato, un numero significativo di nanovescicole a forma di coppa è stato osservato nel gruppo del mezzo concentrato (Figura 2A, B). Tuttavia, le tipiche particelle sEV non sono state rilevate nel gruppo dei fluidi sprecati. Questi risultati forniscono la prova che il protocollo è in grado di separare le sEV senza subire perdite significative durante la fase cruciale della concentrazione.

Caratterizzazione di marcatori proteici per sEVs
Inoltre, l'analisi Western blot è stata impiegata per caratterizzare i marcatori proteici (CD9, CD81, HSP70) delle sEV isolate. Nel gruppo del mezzo concentrato sono state osservate bande proteiche chiare, mentre non sono state rilevate bande corrispondenti nei campioni di fluido sprecati (Figura 2C). Insieme, questi risultati convalidano la presenza di componenti sEV.

Dimensioni, caratteristiche e resa delle vescicole extracellulari
Per caratterizzare ulteriormente la quantità e le dimensioni, l'NTA è stato applicato ai campioni ottenuti mediante ultracentrifugazione tradizionale (UC tradizionale) e al nostro protocollo. Poiché entrambi i metodi utilizzavano l'ultracentrifugazione, come controllo sono state utilizzate sEV isolate dal terreno di coltura MSC mediante UC tradizionale, che includeva principalmente la centrifugazione a 300 × g per 15 minuti, quindi 2.000 × g per 15 minuti e un'ultracentrifuga a 110.000 × g per 70 minuti a 4 °C, quindi i pellet sono stati lavati in soluzione salina e la seconda ultracentrifugazione è stata eseguita per 70 minuti a 110, 000 × g. Il risultato ha dimostrato che l'intervallo di dimensioni delle sEV ottenute da questo protocollo era compreso tra 48,1 nm e 166,2 nm con una dimensione media di 103,6 nm, mentre l'intervallo di dimensioni delle sEV ottenute con l'UC tradizionale era compreso tra 51,8 nm e 186,7 nm con una dimensione media di 112,6 nm (Figura 3A, B). Abbiamo inoltre introdotto il rapporto di diluizione nei risultati NTA per misurare le particelle totali raccolte da due protocolli. Il risultato ha anche indicato che, sebbene non sia stato possibile evitare perdite, abbiamo raccolto una notevole quantità di sEV. Successivamente, vengono presentati i diagrammi dei modelli che richiedono molto tempo di due protocolli di isolamento (Figura 3C). Quindi, abbiamo quantificato il consumo di tempo dei protocolli. Il metodo UC tradizionale richiedeva circa 2030 minuti e questo protocollo richiedeva 260 minuti (Figura 3D). La resa è stata maggiore utilizzando questo protocollo (Figura 3E), mostrando l'efficienza del protocollo per campioni di grandi volumi.

Test di sterilità per il controllo qualità
I test di sterilità sono fondamentali per garantire che i prodotti siano sicuri. I rilevamenti di batteri, funghi, virus ed endotossine sono stati applicati alle sEV che abbiamo isolato. I risultati sono stati ordinati qui (Tabella 1). E i risultati hanno indicato che le sEV ottenute dal nostro protocollo erano ben protette dai contaminanti.

Figura 1: Illustrazione schematica del protocollo per la concentrazione e l'isolamento delle MSC-sEVs dal surnatante della coltura di MSC. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative TEM e western blot di sEV. (A,B) Il protocollo mira ad ottenere un mezzo concentrato (campione). Dopo la concentrazione e la successiva ultracentrifugazione, il fluido sprecato denota il rifiuto raccolto. Le MSC-sEV "a forma di coppa" sono state rilevate nei campioni target (terreno concentrato) e non sono state osservate nei rifiuti fluidi. Barre di scala: 200 nm. (C) Nel mezzo concentrato sono state osservate bande proteiche chiare di CD63, CD9 e HSP70, mentre non sono state rilevate bande corrispondenti nei campioni di fluido sprecati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Dimensione delle nanoparticelle e numero di particelle rilevate da NTA. (A,B) La dimensione e la concentrazione delle sEV isolate dalle UC tradizionali e da questo protocollo. (C) Il diagramma di flusso dell'UC tradizionale (in alto) e dell'Emodializzatore + UC a giro singolo (in basso). (D) Il consumo di tempo dell'UC tradizionale e dell'emodializzatore + UC a giro singolo. (E) La resa (particelle ottenute all'ora) di due diversi protocolli. I dati sono stati rappresentati come media ± deviazione standard (*p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: I test di sterilità del controllo qualità.

I metodi tradizionali per l'isolamento delle sEV includono l'ultracentrifugazione differenziale, la cromatografia ad esclusione dimensionale e la precipitazione PEG, ciascuno con i propri pregi e demeriti. Sebbene l'amalgama di queste tecniche disparate possa migliorare la resa o la purezza delle sEV, passaggi aggiuntivi spesso introducono maggiori opportunità di contaminazione del campione. Sul mercato sono emersi sistemi integrati che dichiarano di estrarre sEV in massa e di aderire agli standard GMP²¹. Tuttavia, la loro adozione diffusa rappresenta una sfida economica significativa, in particolare per il numero crescente di team di ricerca sui veicoli elettrici. Inoltre, l'assenza di protocolli standardizzati e procedure riconosciute per questi nuovi dispositivi può introdurre un certo livello di rischio. Le GMP richiedono più tentativi sia sulla metodologia che sulle attrezzature per garantire la conformità simultanea alla resa e alla purezza.

Secondo una recente revisione delle applicazioni cliniche delle sEV²³, il 35% degli studi ha impiegato esclusivamente questo metodo; Un ulteriore 12,5% degli studi ha utilizzato l'ultracentrifugazione in combinazione con altre tecniche. La sua applicazione diffusa implica anche che le ultracentrifughe sono diventate apparecchiature accessibili a una parte considerevole dei ricercatori²⁴.

In termini pratici, l'impiego dell'ultracentrifugazione aiuta il nostro metodo a isolare con precisione derivati cellulari precisi da altri elementi come cellule più grandi, frammenti cellulari e cellule morte²⁵. Inoltre, va sottolineato che, sebbene sia stata segnalata l'efficacia delle sEV, la realizzazione di un'efficacia terapeutica soddisfacente richiede tipicamente l'uso di alte concentrazioni di sEV, in particolare negli esperimenti sugli animali, negli studi preclinici su grandi animali e negli studi clinici. L'ultracentrifugazione è attualmente il metodo più cruciale per ottenere sEV ad alta concentrazione, il che aumenta la rilevanza del protocollo per gli scenari applicativi sopra menzionati. Essendo un metodo maturo, l'ultracentrifugazione presenta i vantaggi di essere applicabile a campioni di ampia portata e di essere conveniente.

L'emodializzatore è stato utilizzato in modo innovativo per l'elaborazione di grandi volumi di campioni di surnatante di colture cellulari, consentendo il successivo isolamento delle sEV attraverso l'ultracentrifugazione a ciclo singolo. Come descritto nel passaggio 2.5.2, la modalità utilizzata nell'ultrafiltrazione è ISO-UF. L'emodializzatore in questa modalità è lo stesso del TFF. Poiché non viene utilizzato dialisato esogeno, solo piccole molecole escono dalla membrana filtrante, come l'H₂O. TFF è già un protocollo di arricchimento delle sEVs ampiamente collaudato e raccomandato. Tuttavia, le apparecchiature TFF conformi alle GMP per l'isolamento delle sEV sono costose e spesso mancano di standard operativi. Questo tipo di attrezzatura è meno verificata, quindi la qualità del prodotto è difficile da garantire. Al contrario, l'emodializzatore è completato da materiali di consumo consolidati, protocolli operativi standardizzati e personale qualificato. Questo metodo offre una soluzione praticabile per la concentrazione dei campioni, in particolare per i team di ricerca ospedalieri impegnati in studi clinici. Inoltre, come estensione, a causa delle loro proprietà fisiche vicine, riteniamo che questo protocollo sia teoricamente adatto per l'isolamento di sEV da tutte le MSC di vari lignaggi, ma per certo è necessaria un'ulteriore verifica sperimentale.

Questo protocollo fornisce un requisito di sterilità più facilmente soddisfatto, che è un requisito cruciale negli ambienti GMP. Abbiamo condotto test completi durante l'esplorazione del protocollo, inclusi batteri, funghi, virus ed endotossine nei campioni, e i risultati sono tutti negativi. (Tabella 1) Il test qui non è la chiave per l'operazione di protocollo che abbiamo riportato, quindi scegliamo di non includere i risultati. La sterilità è un requisito in tutto il protocollo, compreso il campione, il funzionamento, l'attrezzatura, l'ambiente, ecc. Il test di sterilità è fondamentale, soprattutto per i prodotti destinati all'uso terapeutico. Inoltre, altri controlli di qualità (QC) per la conformità alle GMP dovrebbero essere considerati da aspetti quali l'identità e la potenza. Qui, abbiamo identificato le caratteristiche fisiche e i marcatori proteici della sEV. La potenza delle sEV isolate dovrebbe essere verificata anche se i ricercatori intendono utilizzare il prodotto per ulteriori applicazioni.

Va inoltre notato che, in primo luogo, questo protocollo incorpora una doppia fase di filtrazione con filtri da 0,45 μm e 0,22 μm per rimuovere detriti cellulari e vescicole più grandi di 220 nm²⁶. Sebbene metodi alternativi, come la centrifugazione a bassa velocità, possano teoricamente precedere l'ultracentrifugazione²⁷, ciò potrebbe comportare una diminuzione dell'efficienza durante le operazioni su larga scala. Se i campioni di surnatante cellulare contengono una quantità eccessiva di particolato a causa di operazioni precedenti alla filtrazione, la membrana filtrante qui utilizzata ha una maggiore probabilità di ridurre la velocità di filtrazione a causa del blocco nel processo. Pertanto, si raccomanda anche di avere sempre le membrane filtranti sterili di riserva preparate per la sostituzione in caso di intasamento. Inoltre, l'operazione di emodialisi non è considerata complessa, soprattutto per i professionisti qualificati. Tuttavia, è importante assicurarsi che il terreno di coltura cellulare non contenga rosso fenolo. Questa precauzione viene presa non solo perché le prove suggeriscono che l'indicatore può potenzialmente influenzare le funzioni biologiche della sEV, ma anche per la sua capacità di innescare l'allarme di perdita di sangue dell'emodialisi.

Questo protocollo non è adatto per attività con un piccolo volume di campioni da elaborare. Quando l'isolamento può essere realizzato con 2 cicli di ultracentrifugazione, questo protocollo non offre un vantaggio in termini di tempo. Tuttavia, all'aumentare del volume, questo protocollo può diventare un metodo di isolamento efficiente. La fase di concentrazione di questo protocollo utilizza esclusivamente l'ultrafiltrazione senza l'uso di tampone per dialisi. È ipotizzabile che, utilizzando diversi tamponi per dialisi, si possa ottenere un'ulteriore decontaminazione delle sostanze co-isolate dalle sEV. Non è escluso che il tampone per dialisi possa influire sulla stabilità della membrana esterna della sEV; Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per verificarlo.

In sintesi, abbiamo presentato un metodo per l'isolamento su larga scala di MSC-sEV che soddisfa gli standard GMP. Si basa principalmente su emodializzatori e ultracentrifughe, che sono più accessibili a molti team di ricerca rispetto ad alcune delle più recenti apparecchiature specializzate disponibili sul mercato. Abbiamo caratterizzato le sEV ottenute e, inoltre, condotto un esame dei rifiuti di filtrazione per identificare i processi critici che possono portare alla perdita di sEV. I risultati non indicano alcuna perdita significativa, suggerendo l'efficienza e la stabilità del protocollo. Utilizzando appieno le apparecchiature di laboratorio esistenti per soddisfare le nuove esigenze, questo approccio fornisce anche una nuova prospettiva di ricerca.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della National Science Foundation of China (822101167, a BB) e della Natural Science Foundation di Chongqing (da CSTB2022NSCQ-MSX0020 a BB), del Chongqing PhD "Through Train" Scientific Research Project of China (CSTB2022BSXM-JCX0031 a BB) e della National Science Foundation of China (da 82271132 a YL). Siamo grati per l'assistenza del Dipartimento di Nefrologia, del Primo Ospedale affiliato, della Terza Università Medica Militare (Università Medica dell'Esercito) e dell'Istituto di Patologia e del Centro Oncologico del Sud-Ovest, dell'Ospedale del Sud-Ovest, della Terza Università Medica Militare (Università Medica dell'Esercito) per le attrezzature e il supporto tecnico.