Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales a partir de muestras de gran volumen con cumplimiento de GMP para ensayos clínicos

Las pequeñas vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales (MSC-sEVs) han sido subrayadas como una modalidad de tratamiento libre de células con efectos adversos mínimos. Este estudio proporciona un protocolo que combina la hemodiálisis con la ultracentrifugación, reduciendo significativamente el tiempo empleado en todo el proceso y asegurando el cumplimiento de las normas de buenas prácticas de fabricación (GMP).

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) derivadas de células madre mesenquimales (MSC-sEVs) han sido subrayadas como una modalidad de tratamiento libre de células con efectos adversos mínimos. Por el contrario, los métodos de extracción tradicionales, como la ultracentrifugación y la cromatografía de exclusión por tamaño, están limitados por su intensidad de tiempo, costo y escalabilidad. Para superar estas limitaciones, proponemos un método que integra un hemodializador y ultracentrifugación. Este enfoque utiliza un dispositivo de hemodiálisis con una membrana de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa, que concentra selectivamente los sEV mientras filtra una gran cantidad de proteínas, mejorando así el rendimiento y la pureza de los sEV. A este paso inicial de purificación le sigue la ultracentrifugación para refinar aún más la preparación del sEV. La integración de estas dos tecnologías no solo redujo significativamente el tiempo dedicado a todo el proceso, sino que también garantizó el cumplimiento de las normas de buenas prácticas de fabricación (GMP). El método aquí demuestra una alta eficiencia en el aislamiento de sEV de un gran volumen de muestras, lo que ofrece un avance significativo sobre los métodos tradicionales. Este protocolo es prometedor para acelerar la traslación de las terapias basadas en VE a la práctica clínica al proporcionar una solución escalable, rentable y que cumple con las GMP.

Las pequeñas vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales (MSC-sEVs) son vesículas heterogéneas enriquecidas con múltiples componentes como ARNm, micro-ARN, citocinas, lípidos y metabolitos¹. En los últimos años, muchos estudios han subrayado el inmenso potencial terapéutico de los MSC-sEV como una modalidad de tratamiento libre de células con efectos adversos mínimos², mostrándose prometedores para abordar un espectro de afecciones, incluido el envejecimiento, la degeneración de tejidos, el cáncer y el trastorno inflamatorio ^3,4,5,6. Sin embargo, persiste un desafío crítico en la extracción a gran escala de sEV, ya que los métodos tradicionales demuestran ser laboriosamente lentos o económicamente inviables. Además, garantizar la reproducibilidad es primordial para la aplicación clínica y la traslación de las terapias basadas en VE⁷. Los investigadores necesitan urgentemente un método de purificación que no solo sea simple y eficiente, sino que también cumpla con los estándares de buenas prácticas de fabricación (GMP)⁸.

Los métodos convencionales de purificación, incluyendo la ultracentrifugación, la ultrafiltración, la cromatografía de exclusión por tamaño, la inmunoafinidad y la precipitación de polímeros, se han aplicado ampliamente en investigaciones^{previas 9}. En general, los métodos tradicionales para el aislamiento de sEV presentan limitaciones como una baja tasa de rendimiento, una pureza comprometida y desafíos para cumplir con los estrictos estándares asépticos. Además, investigaciones anteriores han informado del potencial de técnicas prometedoras como los sistemas microfluídicos^10,11, el aislamiento magnético sin etiquetas¹² y el aislamiento químico covalente¹³ para lograr un rendimiento excepcional. Sin embargo, la necesidad de equipos especializados hace que la adopción de estas técnicas avanzadas sea un reto para la mayoría de los equipos de investigación. En resumen, el método eficiente para aislar sEV de grado GMP de un gran volumen de muestras sigue siendo un obstáculo crítico, lo que limita el progreso de numerosos equipos tanto en investigación como en aplicaciones clínicas.

La ultracentrifugación es el método más ampliamente adoptado para el aislamiento de sEV y es reconocido como el método de referencia^14,15. Es una técnica que aprovecha las diferencias de densidad y tamaño para aislar los sEV. Los SEV aislados se enjuagan comúnmente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los contaminantes residuales. A continuación, se suele utilizar un volumen adecuado de PBS para resuspender los sEV enjuagados y se pueden cosechar diferentes concentraciones esperadas de sEV controlando el volumen de PBS. Además, se ha informado de que la pureza de los sEV de plasma obtenidos por ultracentrifugación parece ser mejor que la de los sEV de plasma aislados por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), y los sEV obtenidos por ultracentrifugación tienen menos impurezas de partículas extracelulares no vesiculares (NVEP). Esto también hace que la ultracentrifugación sea la más utilizada y difícil de reemplazar en muchos tratamientos que requieren altas concentraciones de sEV. Sin embargo, además de la calidad y la pureza, la eficiencia también es un factor que no se puede ignorar en la extracción de sEV de gran volumen. Hasta ahora, una sola ronda de ultracentrifugación puede soportar un volumen de muestra de hasta aproximadamente 600 mL, lo que determina que es difícil satisfacer la demanda de extracción a gran escala solo por ultracentrifugación¹⁶.

Un dispositivo de hemodiálisis consiste en un módulo basado en una membrana que alberga miles de fibras huecas. La sangre circula a través de estas fibras dentro de una cámara cilíndrica cerrada¹⁷. Los constituyentes de la sangre pueden pasar selectivamente a través de estas membranas en función de su tamaño molecular y concentración iónica. En la clínica, es ampliamente utilizado como riñón artificial para eliminar los productos de desecho y el exceso de líquidos de la sangre de los pacientes 18,19,20. En otras palabras, el hemodializador también tiene el potencial de concentrar muestras de gran volumen, basándose en un proceso similar a la filtración de flujo tangencial (TFF). En la reciente directriz emitida por la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV), los concentrados de sEV se consideran adecuados para muestras de gran volumen, como el medio de cultivo celular. Después de décadas de desarrollo, los hemodializadores han sido ampliamente adoptados en los hospitales, respaldados por una gran cantidad de consumibles maduros y un grupo de operadores calificados, lo que facilita mantener la muestra estéril.

En este estudio se presenta un método de purificación de sEV basado en un hemodializador y una ultracentrífuga compatibles con GMPs. En este caso, elegimos dializadores de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa, que se ha demostrado que capturan eficazmente las sEV y filtran numerosas proteínas²². La ultracentrifugación también proporciona un paso para una mayor purificación. El trabajo demuestra que el hemodializador es igualmente adecuado para la concentración de sEVs. Este protocolo permite a los investigadores aislar sEV de muestras de gran volumen de manera eficiente. Hemos registrado el ensayo clínico en el Registro Chino de Ensayos Clínicos (ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018), que aún está en curso y aún no se ha completado. Aunque los datos clínicos no están disponibles para su publicación en este momento, un método confiable, a gran escala, eficiente y compatible para producir sEV como se informa en este protocolo es un requisito previo para realizar ensayos preclínicos y clínicos.

El protocolo fue aprobado y llevado a cabo de acuerdo con el Comité de Ética de Investigación en Humanos del Southwest Hospital.

1. Eliminación de los restos celulares del medio de cultivo

NOTA: Los procedimientos a continuación deben operarse en un entorno que cumpla con las GMP, especialmente cuando las muestras pueden exponerse directamente al medio ambiente.

1. Dado el requisito de estar libre de microbiota, asegúrese de que el filtro y el tubo de goma se esterilizen en autoclave para una esterilización eficaz. Asegúrese de que todos los demás consumibles que puedan entrar en contacto con el medio de cultivo estén estériles y en envases sellados. Realice el proceso de eliminación de residuos celulares en una cabina de flujo laminar.
2. Ensamble la membrana de filtración de 0,45 μm y 0,22 μm en el aparato de filtro. Conecte una bomba peristáltica (ver Tabla de Materiales) y el aparato de filtro con el tubo de goma. Coloque la membrana de 0,45 μm por encima de la membrana de 0,22 μm; de lo contrario, puede disminuir la eficiencia de filtración (Figura 1). Preste atención a distinguir entre los lados delantero y trasero de la membrana de microfiltración.
3. Ponga en marcha la bomba peristáltica para la filtración. Alimentado por la bomba, el medio basal de células madre mesenquimales (MSCBM) con un suplemento del 5% (ver Tabla de Materiales) pasa a través del filtro desde un extremo, y el medio de cultivo filtrado se puede obtener en el otro extremo del filtro, como se muestra en (Figura 1). Reúna el medio de cultivo filtrado en una bolsa de drenaje con canales dobles. Mantenga la integridad del sistema de filtración optimizando la velocidad de la bomba peristáltica y reemplazando la membrana de filtración según sea necesario.
4. Una vez completada la filtración, cierre la válvula de entrada de la bolsa de drenaje y séllela aún más con parafilm (consulte la tabla de materiales). Continúe con el siguiente paso o almacene temporalmente el medio de cultivo celular filtrado a 4 °C.

2. Concentración del medio de cultivo filtrado con un hemodializador

NOTA: Absténgase de usar el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene rojo de fenol en cultivo celular, ya que el detector de fugas de sangre en el hemodializador se activará o apagará el detector de fugas de sangre en la configuración del hemodializador.

1. Prepara los consumibles.
   1. Prepare líneas de sangre, membranas de polisulfona de alto flujo MWCO de 100 kDa, dializador de sangre, equipo de infusión, solución salina fisiológica, bolsa de infusión, solución de yodo e hisopos de algodón antes de la concentración (consulte la tabla de materiales).
2. Encienda el sistema y realice la autoevaluación.
   1. Compruebe la conexión del cable de alimentación del hemodializador y encienda la alimentación principal.
   2. Espere a que la máquina complete todo el procedimiento de autodiagnóstico.
3. Instale las líneas de sangre y el dializador.
   1. Verifique las fechas de caducidad de las líneas de sangre desechables y del dializador de sangre, garantizando la integridad de su embalaje exterior y comprobando si hay daños en las líneas.
   2. Instale el tubo en la misma dirección que el flujo sanguíneo en el circuito extracorpóreo, cerrando secuencialmente las válvulas de derivación para formar una circulación de circuito cerrado.
4. Inicie el procedimiento de enjuague.
   1. Utilice un equipo de infusión para conectar la solución salina fisiológica (sin heparina) desde un tubo antes de la bomba hasta el circuito de diálisis. Conecte el sitio de recolección venosa a la bolsa de líquido residual.
      NOTA: La solución salina fisiológica no debe contener heparina ni ningún otro anticoagulante.
   2. Conecte las líneas de suministro/retorno de dializado al dializador.
   3. Ponga en marcha el hemodializador y ajuste el caudal a 80-100 mL/min. Expulse todo el aire del circuito de diálisis y del dializador para asegurarse de que todo el sistema de tubos esté lleno de líquido.
   4. Ajuste el plano líquido en las cámaras arteriales y venosas a aproximadamente 2/3 de su capacidad. La solución salina fluye secuencialmente a través de la vía arterial, el dializador, la vía venosa y la bolsa de líquido residual.
5. Inicie la concentración de ultrafiltración.
   1. Después de finalizar el procedimiento de enjuague, cuelgue la bolsa de drenaje que contiene el medio de cultivo filtrado en el soporte de infusión, desinfecte el canal de salida con hisopos de algodón empapados en yodo y conecte el canal de salida de la bolsa de drenaje a un puerto de prebomba usando un equipo de infusión.
   2. Se unen el puerto arterial y el puerto venoso de las líneas de sangre. Establecer un circuito de diálisis aislado por ultrafiltración (ISO-UF, ultrafiltración sin flujo de dializado) (Figura 1).
   3. Ajuste el volumen objetivo de ultrafiltración en la máquina de diálisis para que se corresponda con el volumen total de líquido presente en la bolsa de drenaje. Ajuste el tiempo de diálisis de la ultrafiltración al tiempo mínimo de funcionamiento del sistema. Una vez que los parámetros se hayan establecido correctamente, inicie la ultrafiltración.
      NOTA: Debido al cálculo del sistema de hemodiálisis, el tiempo de diálisis no será demasiado corto, sino que se mantendrá a un ritmo más moderado.
6. Obtener el líquido concentrado.
   1. Después de alcanzar el volumen de deshidratación objetivo, cierre la pinza arterial y conecte el puerto venoso a una bolsa de infusión estéril.
   2. Abra el puerto de prebomba de las líneas de sangre desechables equipadas con un filtro de aire. Activar la bomba de sangre a una velocidad aproximada de 50 mL/min, permitiendo que el líquido dentro de las líneas sanguíneas circule una vez más desde la línea arterial a la vía venosa. Retire todo el líquido concentrado, aproximadamente 158 ml, del circuito y vuelva a la bolsa de infusión estéril.
   3. En la última etapa de concentración, recoja el líquido desperdiciado de la línea de retorno de dializado. Aplique procesos posteriores idénticos a los del medio de cultivo concentrado a la muestra de fluido desperdiciada para controlar cualquier pérdida accidental de sEV que pueda haber ocurrido durante la concentración.
   4. Cierre todas las válvulas y retire la bolsa de infusión, el dializador y todas las vías. Apague la fuente de alimentación y desinfecte la máquina limpiándola.

3. Separación de los sEV con ultracentrífuga

1. Transfiera el medio de cultivo concentrado a tubos de ultracentrífuga y luego equilibrelos.
2. Centrifugar en una ultracentrífuga de grado clínico (ver Tabla de Materiales) a 110.000 × g durante 70 min, luego lavar el pellet con solución salina estéril y proceder con una segunda centrifugación a 110.000 × g durante otros 70 min.
3. Vuelva a suspender los sEV peletizados en una cantidad adecuada de solución salina estéril.
4. Transfiera los sEV a un tubo estéril para realizar más pruebas o guárdelos a -80 °C para su uso futuro.

4. Caracterización de los sEV obtenidos

1. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
   1. Diluir los sEVs obtenidos (1 μL) con PBS (1 mL) (ver Tabla de Materiales). Ajuste el número de sEV visibles en el campo de visión actual para que esté entre 50 y 200.
   2. Inyecte con cuidado la muestra diluida en el pocillo de la muestra, evitando la introducción de burbujas de aire.
   3. Realice la medición cuando el número de partículas en el campo de visión sea lo más alto y estable posible para todas las posiciones. Los parámetros de análisis son los siguientes: Área máxima: 1000, Área mínima: 10, Brillo mínimo: 30, Longitud de traza: 15, Temperatura: 25 °C, Sensibilidad: 75.
   4. Mida cada muestra al menos tres veces.
2. Análisis de Western blot
   1. Diluir la solución de sEVs en PBS. Utilice un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (consulte la tabla de materiales) para medir la concentración de proteínas.
   2. Hervir los sEV en el tampón de muestra a 100 °C durante 5 min.
   3. Prepare un gel de electroforesis en gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sodio al 12% (SDS-PAGE) (ver Tabla de Materiales). Ensamble el aparato de electroforesis en gel. Cargue cantidades iguales de proteína de cada muestra en los pocillos de gel SDS-PAGE. Ajuste el voltaje de la electroforesis a 80 V para la concentración y 100 V para la separación.
   4. Active la membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (ver Tabla de materiales) con metanol durante 1 min, luego remoje la membrana de PVDF en tampón de transferencia antes de continuar con la transferencia a 100 V durante 1 h.
   5. Sumerja la membrana de PVDF en tampón TBST (20 mM de Tris, 150 mM de NaCl y 0,1% de Tween 20) que contenga 5% de albúmina sérica bovina (BSA; consulte la Tabla de materiales) y luego bloquee durante 30 minutos.
   6. Incubar la membrana de PVDF con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C en un agitador. Los anticuerpos primarios utilizados son los siguientes: anti-CD63 humano (dilución 1:1000), anti-CD9 humano (dilución 1:1000) y anti-HSP70 humano (dilución 1:1000) (ver Tabla de Materiales).
   7. Al día siguiente, lavar la membrana de PVDF con la solución TBST cinco veces durante 5 minutos cada una y luego incubar con anticuerpo secundario conjugado con HRP (dilución 1:10000) (ver Tabla de Materiales) a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
   8. Después de lavar con TBST cinco veces, use un reactivo de detección de quimioluminiscencia para obtener imágenes en un sistema de quimioluminiscencia.
3. Microscopía electrónica de transmisión
   1. Agregue una gota de muestra diluida en PBS de 20 μL a un papel encerado. Luego, coloque una rejilla de cobre (consulte la Tabla de materiales) en la gota para que la gota de muestra pueda cubrir la rejilla de cobre y déjela reposar en RT durante 20 minutos.
   2. Absorbe el exceso de líquido con papel de filtro. A continuación, fije las muestras en una solución de 20 μL de paraformaldehído al 2%, glutaraldehído al 2% y fosfato al 0,05 M durante 2 min.
   3. Enjuague la rejilla de cobre tres veces con agua bidestilada, luego tiña con 20 μL de ácido fosfotúngstico (PTA) al 2% durante 1 min en RT.
   4. Absorbe el líquido redundante con papel de filtro. Seque las rejillas durante la noche antes de ser analizadas por microscopía electrónica de transmisión (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: Los ajustes recomendados para TEM son los siguientes: Exposición: 1,0 s, Voltaje HT 100,00 kV, Corriente del haz: 50 μA, Tamaño de punto: 1, Modo: TEM. Estos ajustes pueden cambiar siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).

Caracterización morfológica de los sEV
En la etapa final de concentración, también se recolectó el líquido desperdiciado como se describe. El medio concentrado y el fluido desperdiciado fueron ultracentrífugos, respectivamente. Se recolectaron las precipitaciones para el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Como se anticipó, se observó un número significativo de nanovesículas en forma de copa en el grupo de medio concentrado (Figura 2A,B). Sin embargo, no se detectaron partículas típicas de sEV en el grupo de fluidos desperdiciados. Estos hallazgos proporcionan evidencia de que el protocolo es capaz de separar los sEV sin experimentar una pérdida significativa durante el paso crucial de concentración.

Caracterización de marcadores proteicos para sEVs
Además, se empleó el análisis de Western blot para caracterizar los marcadores proteicos (CD9, CD81, HSP70) de los sEV aislados. Se observaron bandas de proteínas claras en el grupo de medio concentrado, mientras que no se detectaron bandas correspondientes en las muestras de fluidos desperdiciados (Figura 2C). En conjunto, estos resultados validan la presencia de componentes sEV.

Tamaño, características y rendimiento de las vesículas extracelulares
Para caracterizar aún más la cantidad y el tamaño, se aplicó NTA a las muestras obtenidas por ultracentrifugación tradicional (UC tradicional) y a nuestro protocolo. Dado que ambos métodos utilizaron ultracentrifugación, se utilizaron como control los sEV aislados del medio de cultivo MSC por UC tradicional, que incluyó principalmente la centrifugación a 300 × g durante 15 min, luego 2.000 × g durante 15 min y una ultracentrífuga a 110.000 × g durante 70 min a 4 °C, y luego los pellets se lavaron en solución salina y se realizó la segunda ultracentrifugación durante 70 min a 110, 000 × g. Los resultados demostraron que el rango de tamaño de los sEV obtenidos por este protocolo fue de 48,1 nm a 166,2 nm con un tamaño medio de 103,6 nm, el rango de tamaño de los sEV obtenidos por UC tradicional fue de 51,8 nm a 186,7 nm con un tamaño medio de 112,6 nm (Figura 3A,B). Además, introdujimos la relación de dilución con los resultados de NTA para medir el total de partículas recolectadas por dos protocolos. El resultado también indicó que, aunque no se pudo evitar la pérdida, cosechamos una cantidad considerable de sEV. A continuación, se presentan aquí dos diagramas de patrones de protocolos de aislamiento que consumen mucho tiempo (Figura 3C). A continuación, cuantificamos el consumo de tiempo de los protocolos. El método tradicional de UC requirió alrededor de 2030 min, y este protocolo requirió 260 min (Figura 3D). El rendimiento fue mayor utilizando este protocolo (Figura 3E), lo que muestra la eficiencia del protocolo para muestras de gran volumen.

Pruebas de esterilidad de control de calidad
Las pruebas de esterilidad son fundamentales para garantizar que los productos sean seguros. Las detecciones de bacterias, hongos, virus y endotoxinas se aplicaron a los sEV que aislamos. Los resultados se ordenaron aquí (Tabla 1). Y los resultados indicaron que los sEV obtenidos por nuestro protocolo estaban bien protegidos de los contaminantes.

Figura 1: Ilustración esquemática del protocolo para la concentración y el aislamiento de MSC-sEVs del sobrenadante de cultivo MSC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas de TEM y Western blot de sEVs. (A,B) El protocolo tiene como objetivo obtener un medio concentrado (muestra). Después de la concentración y posterior ultracentrifugación, el fluido desperdiciado denota el residuo recogido. Los MSC-sEV "en forma de copa" se detectaron en las muestras objetivo (medio concentrado) y no se observaron en los residuos fluidos. Barras de escala: 200 nm. (C) Se observaron bandas claras de proteínas CD63, CD9 y HSP70 en el medio concentrado, mientras que no se detectaron bandas correspondientes en muestras de fluidos desperdiciados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Tamaño de nanopartícula y número de partícula detectados por NTA. (A,B) El tamaño y la concentración de los sEV aislados por UC tradicional y este protocolo. (C) El diagrama de flujo de la UC tradicional (arriba) y el Hemodializer + UC de una sola ronda (abajo). (D) El consumo de tiempo de la CU tradicional y el Hemodializador + CU de una sola ronda. (E) El rendimiento (partículas obtenidas por hora) de dos protocolos diferentes. Los datos se representaron como media ± desviación estándar (*p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Las pruebas de esterilidad de control de calidad.

Los métodos tradicionales para el aislamiento de sEV incluyen la ultracentrifugación diferencial, la cromatografía de exclusión por tamaño y la precipitación PEG, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Si bien la amalgama de estas técnicas dispares puede mejorar el rendimiento o la pureza de los sEV, los pasos adicionales a menudo introducen más oportunidades para la contaminación de la muestra. Han surgido en el mercado sistemas integrados que afirman extraer sEV a granel y cumplir con las normas GMP²¹. Sin embargo, su adopción generalizada plantea un importante reto económico, especialmente para el creciente número de equipos de investigación de vehículos eléctricos. Además, la ausencia de protocolos estandarizados y procedimientos reconocidos para estos nuevos dispositivos puede introducir un cierto nivel de riesgo. Las buenas prácticas de fabricación (GMP) requieren más intentos tanto en la metodología como en el equipo para garantizar el cumplimiento simultáneo del rendimiento y la pureza.

Según una revisión reciente de las aplicaciones clínicas de los sEV²³, el 35% por ciento de los estudios emplearon exclusivamente este método; Un 12,5% adicional de los estudios utilizaron la ultracentrifugación en combinación con otras técnicas. Su aplicación generalizada también implica que las ultracentrífugas se han convertido en equipos accesibles para una parte considerable de los investigadores²⁴.

En términos prácticos, el empleo de la ultracentrifugación ayuda a nuestro método a aislar con precisión derivados celulares precisos de otros elementos, como células más grandes, fragmentos de células y células muertas²⁵. Además, cabe destacar que, aunque se ha informado de la eficacia de los sEV, la realización de una eficacia terapéutica satisfactoria suele requerir el uso de altas concentraciones de sEV, especialmente en experimentos con animales, estudios preclínicos con animales grandes y ensayos clínicos. La ultracentrifugación es actualmente el método más crucial para obtener sEV de alta concentración, lo que aumenta la relevancia del protocolo para los escenarios de aplicación antes mencionados. Y como método maduro, la ultracentrifugación posee las ventajas de ser aplicable a muestras de amplio alcance y ser rentable.

El hemodializador se ha utilizado de forma innovadora para el procesamiento de grandes volúmenes de muestras de sobrenadantes de cultivos celulares, lo que permite el posterior aislamiento de sEV mediante ultracentrifugación de una sola ronda. Como se describe en el paso 2.5.2, el modo utilizado en la ultrafiltración es ISO-UF. El hemodializador en este modo es el mismo que el TFF. Dado que no se utiliza dializado exógeno, solo pequeñas moléculas salen de la membrana del filtro, como el_H2O. TFF ya es un protocolo de enriquecimiento de sEVs ampliamente probado y recomendado. Sin embargo, los equipos TFF que cumplen con las GMP para el aislamiento de sEV son costosos y, a menudo, carecen de estándares operativos. Este tipo de equipo está menos verificado, por lo que la calidad del producto es difícil de garantizar. Por el contrario, el hemodializador se complementa con consumibles establecidos, protocolos operativos estandarizados y personal capacitado. Este método ofrece una solución viable para concentrar muestras, especialmente para los equipos de investigación hospitalarios que participan en ensayos clínicos. Además, como extensión, debido a sus propiedades físicas cercanas, creemos que este protocolo es teóricamente adecuado para el aislamiento de sEV de todas las MSC de varios linajes, pero para asegurarse, se necesita una verificación experimental adicional.

Este protocolo proporciona un requisito de esterilidad más fácil de cumplir, que es un requisito crucial en entornos GMP. Hemos realizado pruebas exhaustivas al explorar el protocolo, incluidas bacterias, hongos, virus y endotoxinas en las muestras, y los resultados son todos negativos. (Tabla 1) La prueba aquí no es la clave para el funcionamiento del protocolo que informamos, por lo que elegimos no incluir los resultados. La esterilidad es un requisito a lo largo de un protocolo, incluida la muestra, la operación, el equipo, el entorno, etc. Las pruebas de esterilidad son esenciales, especialmente para los productos destinados a uso terapéutico. Además, se deben considerar otros controles de calidad (QC) para el cumplimiento de las GMP desde aspectos como la identidad y la potencia. Aquí, identificamos las características físicas y los marcadores proteicos de sEV. También se debe verificar la potencia de los sEV aislados si los investigadores tienen la intención de utilizar el producto para aplicaciones posteriores.

También hay que tener en cuenta que, en primer lugar, este protocolo incorpora una doble etapa de filtración con filtros de 0,45 μm y 0,22 μm para eliminar los restos celulares y las vesículas mayores de 220 nm²⁶. Aunque los métodos alternativos, como la centrifugación a baja velocidad, podrían teóricamente preceder a la ultracentrifugación²⁷, esto podría resultar en una disminución de la eficiencia durante las operaciones a gran escala. Si las muestras de sobrenadante celular contienen una cantidad excesiva de material particulado debido a las operaciones previas a la filtración, la membrana filtrante utilizada aquí tiene una mayor probabilidad de reducir la velocidad de filtración debido al bloqueo en el proceso. Por lo tanto, también se recomienda tener siempre membranas filtrantes estériles de repuesto preparadas para su reemplazo en caso de obstrucción. Además, la operación de la hemodiálisis no se considera compleja, especialmente para los profesionales capacitados. Sin embargo, es importante asegurarse de que el medio de cultivo celular no contenga rojo de fenol. Esta precaución se toma no solo porque la evidencia sugiere que el indicador puede afectar potencialmente las funciones biológicas de sEV, sino también debido a su capacidad para activar la alarma de fuga de sangre de la hemodiálisis.

Este protocolo no es adecuado para tareas con un pequeño volumen de muestras a procesar. Cuando el aislamiento se puede lograr mediante 2 rondas de ultracentrifugación, este protocolo no ofrece una ventaja de tiempo. Sin embargo, a medida que aumenta el volumen, este protocolo puede convertirse en un método de aislamiento eficiente. El paso de concentración de este protocolo utiliza únicamente ultrafiltración sin el uso de tampón de diálisis. Es concebible que mediante el empleo de diferentes tampones de diálisis, se pueda lograr una mayor descontaminación de las sustancias coaisladas de los sEV. No se excluye que el tampón de diálisis pueda afectar la estabilidad de la membrana externa del sEV; Por lo tanto, se necesita más investigación para verificar esto.

En resumen, hemos presentado un método para el aislamiento a gran escala de MSC-sEVs que cumple con los estándares GMP. Se basa principalmente en hemodializadores y ultracentrífugas, que son más accesibles para muchos equipos de investigación que algunos de los equipos especializados más nuevos disponibles en el mercado. Hemos caracterizado los sEV obtenidos y, además, hemos realizado un examen de los residuos de filtración para identificar los procesos críticos que pueden conducir a la pérdida de los sEV. Los resultados indican que no hay pérdidas significativas, lo que sugiere la eficiencia y estabilidad del protocolo. Al utilizar plenamente los equipos de laboratorio existentes para abordar las nuevas demandas, este enfoque también proporciona una perspectiva de investigación novedosa.

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (822101167, a BB) y la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (CSTB2022NSCQ-MSX0020 a BB), el Proyecto de Investigación Científica "A través del tren" de Chongqing PhD de China (CSTB2022BSXM-JCX0031 a BB) y la Fundación Nacional de Ciencias de China (82271132 a YL). Agradecemos la asistencia del Departamento de Nefrología, el Primer Hospital afiliado, la Tercera Universidad Médica Militar (Universidad Médica del Ejército), el Instituto de Patología y el Centro Oncológico del Suroeste, el Hospital del Suroeste, la Tercera Universidad Médica Militar (Universidad Médica del Ejército) por el equipo y el apoyo técnico.