عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة من عينات كبيرة الحجم مع الامتثال لممارسات التصنيع الجيدة للتجارب السريرية

تم التأكيد على الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC-sEVs) كطريقة علاج خالية من الخلايا مع الحد الأدنى من الآثار الضارة. توفر هذه الدراسة بروتوكولا يجمع بين غسيل الكلى والطرد المركزي الفائق ، مما يقلل بشكل كبير من الوقت المستغرق في العملية برمتها ويضمن الامتثال لمعايير ممارسات التصنيع الجيدة (GMP).

تم التأكيد على الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEV) المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC-sEVs) كطريقة علاج خالية من الخلايا مع الحد الأدنى من الآثار الضارة. في المقابل ، فإن طرق الاستخراج التقليدية مثل الطرد المركزي الفائق والكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم محدودة بكثافة الوقت والتكلفة وقابلية التوسع. للتغلب على هذه القيود ، نقترح طريقة تدمج جهاز تحليل الكلى والطرد المركزي الفائق. يستخدم هذا النهج جهاز غسيل الكلى بغشاء قطع الوزن الجزيئي 100 كيلو دالتون (MWCO) ، والذي يركز بشكل انتقائي على المركبات الكهربائية الكهربائية أثناء تصفية عدد كبير من البروتينات ، وبالتالي تعزيز إنتاجية ونقاء المركبات الكهربائية الكهربائية. يتبع خطوة التنقية الأولية هذه الطرد المركزي الفائق لتحسين إعداد sEV بشكل أكبر. لم يقتصر دمج هاتين التقنيتين على تقليل الوقت المستغرق في العملية برمتها بشكل كبير فحسب ، بل ضمن أيضا الامتثال لمعايير ممارسات التصنيع الجيدة (GMP). توضح الطريقة هنا كفاءة عالية في عزل المركبات الكهربائية الكهربائية عن حجم كبير من العينات ، مما يوفر تقدما كبيرا على الطرق التقليدية. يبشر هذا البروتوكول بتسريع ترجمة العلاجات القائمة على المركبات الكهربائية إلى ممارسة سريرية من خلال توفير حل قابل للتطوير وفعال من حيث التكلفة ومتوافق مع GMP.

الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC-sEVs) هي حويصلات غير متجانسة غنية بمكونات متعددة مثل mRNA و micro-RNA والسيتوكينات والدهون والمستقلبات¹. في السنوات الأخيرة ، أكدت العديد من الدراسات الإمكانات العلاجية الهائلة ل MSC-sEVs كطريقة علاج خالية من الخلايا مع الحد الأدنى من الآثار^{الضارة 2} ، مما يبشر بالخير في معالجة مجموعة من الحالات ، بما في ذلك الشيخوخة وتنكس الأنسجة والسرطان والاضطراب الالتهابي^3،4،5،6. ومع ذلك ، لا يزال هناك تحد خطير في استخراج المركبات الكهربائية على نطاق واسع ، حيث أثبتت الطرق التقليدية أنها إما تستغرق وقتا طويلا أو غير مجدية اقتصاديا. علاوة على ذلك ، يعد ضمان قابلية التكاثر أمرا بالغ الأهمية للتطبيق السريري وترجمة العلاجات القائمة على EV⁷. الباحثون في حاجة ماسة إلى طريقة تنقية ليست بسيطة وفعالة فحسب ، بل تتوافق أيضا مع معايير ممارسات التصنيع الجيدة (GMP)⁸.

تم تطبيق طرق التنقية التقليدية ، بما في ذلك الطرد المركزي الفائق ، والترشيح الفائق ، والكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم ، والتقارب المناعي ، وهطول الأمطار البوليمرية ، على نطاق واسع في الأبحاث السابقة⁹. بشكل عام ، تظهر الطرق التقليدية لعزل sEV قيودا مثل معدل الإنتاجية المنخفض ، والنقاء المخترق ، والتحديات في تلبية المعايير المعقمة الصارمة. علاوة على ذلك ، أفادت الأبحاث السابقة بإمكانيات التقنيات الواعدة مثل أنظمة الموائع الدقيقة^10،11 ، والعزل المغناطيسي الخالي من الملصقات¹² ، وعزل الكيمياء التساهمية¹³ لتحقيق أداء متميز. ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى المعدات المتخصصة تجعل هذه التقنيات المتقدمة صعبة بالنسبة لغالبية فرق البحث لاعتمادها. باختصار ، لا تزال الطريقة الفعالة لعزل المركبات الكهربائية من فئة GMP من حجم كبير من العينات عقبة خطيرة ، مما يحد من تقدم العديد من الفرق في كل من التطبيقات البحثية والسريرية.

الطرد المركزي الفائق هو الطريقة الأكثر اعتمادا على نطاق واسع لعزل sEV ومعترف به على أنه الطريقة القياسية الذهبية^14،15. إنها تقنية تستفيد من الاختلافات في الكثافة والحجم لعزل المركبات الكهربائية الكهربائية. عادة ما يتم شطف المركبات الكهربائية المعزولة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للتخلص من الملوثات المتبقية. بعد ذلك ، يتم استخدام حجم مناسب من PBS بشكل عام لإعادة تعليق sEVs المغسولة ويمكن حصاد تركيزات متوقعة مختلفة من sEVs عن طريق التحكم في حجم PBS. علاوة على ذلك ، يذكر أن نقاء sEVs البلازما التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي الفائق يبدو أفضل من نقاء sEVs البلازما المعزولة بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، وأن sEVs التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي الفائق لها شوائب أقل من الجسيمات غير الحويصلية خارج الخلية (NVEPs). هذا يجعل الطرد المركزي الفائق هو الأكثر استخداما ويصعب استبداله في العديد من العلاجات التي تتطلب تركيزات عالية من مركبات الكهربائية. ومع ذلك ، بالإضافة إلى الجودة والنقاء ، فإن الكفاءة هي أيضا عامل لا يمكن تجاهله في استخراج sEV بكميات كبيرة. حتى الآن ، يمكن لجولة واحدة من أجهزة الطرد المركزي الفائقة أن تدعم حجم عينة يصل إلى حوالي 600 مل ، مما يحدد أنه من الصعب تلبية الطلب على الاستخراج على نطاق واسع عن طريق الطرد المركزي^{الفائق 16} فقط.

يتكون جهاز غسيل الكلى من وحدة غشائية تحتوي على آلاف الألياف المجوفة. يدور الدم من خلال هذه الألياف داخل غرفة أسطوانية مغلقة¹⁷. يمكن أن تمر مكونات الدم بشكل انتقائي عبر هذه الأغشية بناء على حجمها الجزيئي وتركيزها الأيوني. في العيادة ، يستخدم على نطاق واسع ككلية اصطناعية لإزالة الفضلات والسوائل الزائدة من دم المرضى^18،19،20. بمعنى آخر ، فإن جهاز غسيل الكلى لديه أيضا القدرة على تركيز عينات كبيرة الحجم ، بالاعتماد على عملية مشابهة لترشيح التدفق العرضي (TFF). في الإرشادات الأخيرة الصادرة عن الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية (ISEV) ، تعتبر مركزات sEV مناسبة للعينات كبيرة الحجم ، مثل وسط زراعة الخلايا. بعد عقود من التطوير ، تم اعتماد أجهزة تحليل الكلى على نطاق واسع في المستشفيات ، مدعومة بوفرة من المواد الاستهلاكية الناضجة ومجموعة من المشغلين المهرة ، مما يسهل الحفاظ على العينة معقمة.

تقدم هذه الدراسة طريقة تنقية sEV تعتمد على جهاز تحليل الكلى وجهاز الطرد المركزي الفائق المتوافق مع GMPs. هنا ، نختار أجهزة غسيل الكلى بوزن جزيئي 100 كيلو دالتون (MWCO) ، والتي ثبت أنها تلتقط بشكل فعال sEVs وتصفية العديد من^{البروتينات 22}. يوفر الطرد المركزي الفائق أيضا خطوة لمزيد من التنقية. يوضح العمل أن جهاز غسيل الكلى مناسب بنفس القدر لتركيز sevs. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بعزل المركبات الكهربائية الصغيرة عن العينات كبيرة الحجم بكفاءة. لقد سجلنا التجربة السريرية في سجل التجارب السريرية الصيني (ChiCTR ، رقم ChiCTR2200059018) ، والتي لا تزال قيد التقدم ولم تكتمل بعد. على الرغم من أن البيانات السريرية غير متاحة بسهولة للنشر في هذه اللحظة ، إلا أن طريقة موثوقة وواسعة النطاق وفعالة ومتوافقة لإنتاج مركبات المركبات الكهربائية كما هو مذكور في هذا البروتوكول هي شرط أساسي لإجراء التجارب قبل السريرية والسريرية.

تمت الموافقة على البروتوكول وتنفيذه وفقا للجنة أخلاقيات البحث البشري في مستشفى ساوث ويست.

1. إزالة بقايا الخلية من وسط الاستزراع

ملاحظة: يجب تشغيل الإجراءات أدناه في بيئة متوافقة مع GMP، خاصة عندما تتعرض العينات مباشرة للبيئة.

1. نظرا لمتطلبات خالية من الجراثيم ، تأكد من تعقيم الفلتر والأنبوب المطاطي للتعقيم الفعال. تأكد من أن جميع المواد الاستهلاكية الأخرى التي قد تواجه وسط الاستزراع معقمة وفي عبوات محكمة الغلق. قم بإجراء عملية إزالة بقايا الخلية في خزانة التدفق الصفيحي.
2. قم بتجميع غشاء الترشيح 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر في جهاز المرشح. قم بتوصيل مضخة تمعجية (انظر جدول المواد) وجهاز المرشح بالأنبوب المطاطي. ضع الغشاء 0.45 ميكرومتر فوق الغشاء 0.22 ميكرومتر ؛ خلاف ذلك ، قد يقلل من كفاءة الترشيح (الشكل 1). انتبه للتمييز بين الجانبين الأمامي والخلفي لغشاء الترشيح الدقيق.
3. ابدأ المضخة التمعجية للترشيح. بالطاقة بواسطة المضخة ، يمر الوسط القاعدي للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCBM) مع مكمل 5٪ (انظر جدول المواد) عبر المرشح من أحد طرفيه ، ويمكن الحصول على وسط الثقافة المصفى في الطرف الآخر من المرشح ، كما هو موضح في (الشكل 1). اجمع وسط الاستزراع المفلتر في كيس تصريف بقنوات مزدوجة. الحفاظ على سلامة نظام الترشيح من خلال تحسين سرعة المضخة التمعجية واستبدال غشاء الترشيح حسب الحاجة.
4. بعد اكتمال الترشيح ، أغلق صمام المدخل الموجود على كيس الصرف وأغلقه باستخدام البارافيلم (انظر جدول المواد). تابع إلى الخطوة التالية أو قم بتخزين وسط زراعة الخلايا المفلترة مؤقتا عند 4 درجات مئوية.

2. تركيز وسط الثقافة المفلترة باستخدام جهاز غسيل الكلى

ملاحظة: الامتناع عن استخدام Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) الذي يحتوي على الفينول الأحمر في مزرعة الخلايا ، حيث سيتم تنشيط كاشف تسرب الدم في جهاز غسيل الكلى أو إيقاف تشغيل كاشف تسرب الدم في إعداد جهاز غسيل الكلمة.

1. تحضير المواد الاستهلاكية.
   1. تحضير السلالات ، 100 كيلو دالتون MWCO أغشية البولي سلفون عالية التدفق ، جهاز غسيل الدم ، مجموعة التسريب ، محلول ملحي فسيولوجي ، كيس التسريب ، محلول اليود ، ومسحات القطن قبل التركيز (انظر جدول المواد).
2. قم بتشغيل النظام والاختبار الذاتي.
   1. تحقق من توصيل كابل طاقة جهاز تحليل الكلى وقم بتشغيل الطاقة الرئيسية.
   2. انتظر حتى يكمل الجهاز إجراء التشخيص الذاتي بالكامل.
3. قم بتثبيت السلالات وجهاز غسيل الكلى.
   1. تحقق من تواريخ انتهاء صلاحية السلالات التي تستخدم لمرة واحدة وجهاز غسيل الكلى ، وتأكد من سلامة عبواتها الخارجية والتحقق من عدم وجود أي تلف في الخطوط.
   2. قم بتثبيت الأنبوب في نفس اتجاه تدفق الدم في الدائرة خارج الجسم ، وإغلاق الصمامات الفرعية بالتتابع لتشكيل دورة دوران مغلقة الحلقة.
4. ابدأ عملية الشطف.
   1. استخدم مجموعة التسريب لتوصيل المحلول الملحي الفسيولوجي (بدون الهيبارين) من أنبوب قبل المضخة بدائرة غسيل الكلى. قم بتوصيل موقع التجميع الوريدي بكيس سائل النفايات.
      ملاحظة: يجب ألا يحتوي المحلول الملحي الفسيولوجي على الهيبارين أو أي مضادات تخثر أخرى.
   2. قم بتوصيل خطوط إمداد / إرجاع غسيل الكلى بجهاز غسيل الكلى.
   3. ابدأ تشغيل جهاز غسيل الكلى واضبط معدل التدفق على 80-100 مل / دقيقة. طرد كل الهواء من دائرة غسيل الكلى وجهاز غسيل الكلى لضمان امتلاء نظام الأنابيب بالكامل بالسوائل.
   4. اضبط مستوى السائل في الغرف الشريانية والوريدية إلى 2/3 ممتلئ تقريبا. يتدفق المحلول الملحي بالتتابع عبر الخط الشرياني وجهاز غسيل الكلى والخط الوريدي وكيس سائل النفايات.
5. ابدأ تركيز الترشيح الفائق.
   1. بعد الانتهاء من إجراء الشطف ، قم بتعليق كيس التصريف الذي يحتوي على وسط الثقافة المصفى على حامل التسريب ، وقم بتطهير قناة الإخراج بمسحات قطنية مبللة باليود ، وقم بتوصيل قناة الإخراج لكيس الصرف بمنفذ ما قبل المضخة باستخدام مجموعة التسريب.
   2. انضم إلى المنفذ الشرياني والمنفذ الوريدي للسلالات. إنشاء دائرة غسيل الكلى المعزولة (ISO-UF ، الترشيح الفائق بدون تدفق غسيل الكلى) (الشكل 1).
   3. اضبط الحجم المستهدف للترشيح الفائق على جهاز غسيل الكلى ليتوافق مع الحجم الكلي للسائل الموجود في كيس التصريف. اضبط وقت غسيل الكلى للترشيح الفائق على الحد الأدنى لوقت تشغيل النظام. بعد تعيين المعلمات بنجاح ، ابدأ الترشيح الفائق.
      ملاحظة: نظرا لحساب نظام غسيل الكلى ، لن يكون وقت غسيل الكلى قصيرا جدا ولكن سيتم الحفاظ عليه بمعدل أكثر اعتدالا.
6. احصل على السائل المركز.
   1. بعد تحقيق حجم الجفاف المستهدف ، أغلق المشبك الشرياني وقم بتوصيل المنفذ الوريدي بكيس تسريب معقم.
   2. افتح منفذ ما قبل الضخ لخطوط الدم التي تستخدم لمرة واحدة والمجهزة بفلتر هواء. قم بتنشيط مضخة الدم بسرعة 50 مل / دقيقة تقريبا ، مما يسمح للسائل داخل السلالات بالدوران مرة أخرى من الخط الشرياني إلى الخط الوريدي. اسحب كل السائل المركز ، حوالي 158 مل ، من الدائرة مرة أخرى إلى كيس التسريب المعقم.
   3. في المرحلة المتأخرة من التركيز ، اجمع السائل الضائع من خط عودة غسيل الكلى. قم بتطبيق العمليات اللاحقة المماثلة لتلك الخاصة بوسط الاستزراع المركز على عينة السوائل المهدرة لمراقبة أي خسارة عرضية للمركبات الكهربائية الكهربائية.
   4. أغلق جميع الصمامات وقم بإزالة كيس التسريب وجهاز غسيل الكلى وجميع الخطوط. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وتطهير الجهاز عن طريق مسحه.

3. فصل sEVs مع أجهزة الطرد المركزي الفائقة

1. انقل وسط الاستزراع المركز إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق ثم قم بموازنتها.
2. جهاز طرد مركزي في جهاز طرد مركزي فائق من الدرجة السريرية (انظر جدول المواد) عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة ، ثم اغسل الحبيبات بمحلول ملحي معقم واستمر في الطرد المركزي الثاني عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة أخرى.
3. أعد تعليق مركبات الكهربائي المحببة في كمية مناسبة من محلول ملحي معقم.
4. انقل مركبات المركبات الكهربائية إلى أنبوب معقم لمزيد من الاختبارات أو قم بتخزينها عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

4. توصيف المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها

1. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
   1. قم بتخفيف sEVs التي تم الحصول عليها (1 ميكرولتر) باستخدام PBS (1 مل) (انظر جدول المواد). اضبط عدد مركبات المركبات الكهربائية المرئية في مجال الرؤية الحالي ليكون بين 50 و 200.
   2. قم بحقن العينة المخففة بعناية في العينة جيدا ، وتجنب إدخال فقاعات الهواء.
   3. قم بإجراء القياس عندما يكون عدد الجسيمات في مجال الرؤية مرتفعا ومستقرا قدر الإمكان لجميع المواضع. معلمات التحليل هي كما يلي: الحد الأقصى للمساحة: 1000 ، الحد الأدنى للمساحة: 10 ، الحد الأدنى للسطوع: 30 ، طول التتبع: 15 ، درجة الحرارة: 25 درجة مئوية ، الحساسية: 75.
   4. قم بقياس كل عينة ثلاث مرات على الأقل.
2. تحليل النشاف الغربي
   1. تخفيف حل sEVs في PBS. استخدم مجموعة فحص البروتين بحمض البيسنشونيك (BCA) (انظر جدول المواد) لقياس تركيز البروتين.
   2. قم بغلي المركبات الكهربائية الكهربائية في المخزن المؤقت للعينة عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   3. قم بإعداد جل الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم بنسبة 12٪ (SDS-PAGE) (انظر جدول المواد). قم بتجميع جهاز الرحلان الكهربائي للهلام. قم بتحميل كميات متساوية من البروتين من كل عينة في آبار جل SDS-PAGE. اضبط جهد الرحلان الكهربائي على 80 فولت للتركيز و 100 فولت للفصل.
   4. قم بتنشيط غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) (انظر جدول المواد) بالميثانول لمدة 1 دقيقة ، ثم انقع غشاء PVDF في مخزن مؤقت للنقل قبل متابعة النقل عند 100 فولت لمدة 1 ساعة.
   5. اغمر غشاء PVDF في عازلة TBST (20 ملي مولار تريس ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، و 0.1٪ توين 20) التي تحتوي على 5٪ ألبومين مصل بقري (BSA ؛ انظر جدول المواد) ثم قم بتثبيتها لمدة 30 دقيقة.
   6. احتضان غشاء PVDF بالجسم المضاد الأساسي طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر. الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي كما يلي: الأجسام المضادة البشرية ل CD63 (تخفيف 1: 1000) ، ومضاد CD9 البشري (تخفيف 1: 1000) ، ومضاد HSP70 البشري (تخفيف 1: 1000) (انظر جدول المواد).
   7. في اليوم التالي ، اغسل غشاء PVDF بمحلول TBST خمس مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ثم احتضانه بجسم مضاد ثانوي مترافق ب HRP (تخفيف 1: 10000) (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
   8. بعد الغسيل باستخدام TBST خمس مرات ، استخدم كاشف الكشف عن التلألؤ الكيميائي للتصوير على نظام التلألؤ الكيميائي.
3. الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال
   1. أضف قطرة عينة مخففة بسعة 20 ميكرولتر من PBS إلى ورق شمع. بعد ذلك ، ضع شبكة نحاسية (انظر جدول المواد) على القطرة حتى تتمكن قطرة العينة من تغطية الشبكة النحاسية واتركها تقف عند RT لمدة 20 دقيقة.
   2. امتصاص السوائل الزائدة بورق الترشيح. بعد ذلك ، قم بإصلاح العينات في محلول 20 ميكرولتر من محلول 2٪ بارافورمالدهيد ، و 2٪ جلوتارالديهايد ، و 0.05 M محلول فوسفات لمدة دقيقتين.
   3. اشطف الشبكة النحاسية ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج ، ثم قم بتلطيخ 20 ميكرولتر من حمض الفوسفوتونغستيك 2٪ (PTA) لمدة 1 دقيقة في RT.
   4. امتصاص السائل الزائد باستخدام ورق الترشيح. جفف الشبكات طوال الليل قبل تحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: الإعدادات الموصى بها ل TEM هي كما يلي: التعريض الضوئي: 1.0 ثانية ، جهد HT 100.00 كيلو فولت ، تيار الحزم: 50 μA ، حجم البقعة: 1 ، الوضع: TEM. قد تتغير هذه الإعدادات باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

التوصيف المورفولوجي للمركبات الكهربائية الكهربائية.
في المرحلة الأخيرة من التركيز ، تم أيضا جمع السائل المهدر كما هو موصوف. تم طرد الوسط المركز والسائل المهدر على التوالي. قمنا بجمع الترسبات لتحليل المجهر الإلكتروني (TEM). كما هو متوقع ، لوحظ عدد كبير من الحويصلات النانوية على شكل كوب في مجموعة الوسط المركز (الشكل 2 أ ، ب). ومع ذلك ، لم يتم اكتشاف جزيئات sEV النموذجية في مجموعة السوائل المهدرة. تقدم هذه النتائج دليلا على أن البروتوكول قادر على فصل المركبات الكهربائية المركبة دون التعرض لخسارة كبيرة أثناء خطوة التركيز الحاسمة.

توصيف علامات البروتين للمركبات الكهربائية الكهربائية
علاوة على ذلك ، تم استخدام تحليل اللطخة الغربية لتوصيف علامات البروتين (CD9 ، CD81 ، HSP70) للمركبات الكهربائية المعزولة. لوحظت نطاقات بروتينية واضحة في مجموعة الوسط المركز ، بينما لم يتم الكشف عن أي نطاقات مقابلة في عينات السوائل المهدرة (الشكل 2 ج). معا ، تتحقق هذه النتائج من وجود مكونات sEV.

خصائص الحجم ومحصول الحويصلات خارج الخلية
لتوصيف الكمية والحجم بشكل أكبر ، تم تطبيق NTA على العينات التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي التقليدي (UC التقليدي) والبروتوكول الخاص بنا. نظرا لأن كلتا الطريقتين تستخدمان الطرد المركزي الفائق ، فقد تم استخدام مركبات sev المعزولة من وسط استزراع MSC بواسطة UC التقليدي كعنصر تحكم ، والذي تضمن بشكل أساسي الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 15 دقيقة ، ثم 2,000 × جم لمدة 15 دقيقة وجهاز طرد مركزي فائق عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم تم غسل الكريات في محلول ملحي وتم إجراء الطرد المركزي الفائق الثاني لمدة 70 دقيقة عند 110 ، 000 × جرام. أظهرت النتيجة أن نطاق حجم sevs التي تم الحصول عليها بواسطة هذا البروتوكول كان من 48.1 نانومتر إلى 166.2 نانومتر بمتوسط حجم 103.6 نانومتر ، وكان نطاق حجم sevs التي تم الحصول عليها بواسطة UC التقليدي من 51.8 نانومتر إلى 186.7 نانومتر بمتوسط حجم 112.6 نانومتر (الشكل 3 أ ، ب). قدمنا أيضا نسبة التخفيف إلى نتائج NTA لقياس إجمالي الجسيمات التي تم حصادها بواسطة بروتوكولين. أشارت النتيجة أيضا إلى أنه على الرغم من تعذر تجنب الخسارة ، فقد حصدنا كمية كبيرة من المركبات الكهربائية الكهربائية. بعد ذلك ، يتم تقديم مخططات نمط مضيعة للوقت لبروتوكولين للعزل هنا (الشكل 3 ج). بعد ذلك ، قمنا بتحديد استهلاك الوقت للبروتوكولات. تطلبت طريقة UC التقليدية حوالي 2030 دقيقة ، وتطلب هذا البروتوكول 260 دقيقة (الشكل 3D). كان العائد أعلى باستخدام هذا البروتوكول (الشكل 3E) ، مما يدل على كفاءة البروتوكول للعينات ذات الحجم الكبير.

اختبارات العقم لمراقبة الجودة
اختبارات العقم ضرورية لضمان سلامة المنتجات. تم تطبيق اكتشافات البكتيريا والفطريات والفيروسات والسموم الداخلية على مركبات المركبات الكهربائية التي عزلناها. تم فرز النتائج هنا (الجدول 1). وأشارت النتائج إلى أن المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها بواسطة بروتوكولنا كانت محمية بشكل جيد من الملوثات.

الشكل 1: رسم تخطيطي لبروتوكول تركيز MSC-sEVs وعزلها عن مادة طافية مزرعة MSC. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: صور TEM التمثيلية واللطخة الغربية للمركبات الكهربائية المنخفضة. (أ ، ب) يهدف البروتوكول إلى الحصول على وسيط مركز (عينة). بعد التركيز والطرد المركزي اللاحق ، يشير السائل المهدر إلى النفايات المجمعة. تم الكشف عن MSC-sEVs "على شكل كوب" في العينات المستهدفة (الوسط المركز) ولم يتم ملاحظتها في نفايات السوائل. أشرطة المقياس: 200 نانومتر. (ج) لوحظت نطاقات بروتين شفافة من CD63 و CD9 و HSP70 في الوسط المركز ، بينما لم يتم الكشف عن نطاقات مقابلة في عينات السوائل المهدرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: حجم الجسيمات النانوية وعدد الجسيمات التي اكتشفتها NTA. (أ ، ب) حجم وتركيز مركبات المركبات الكهربائية المعزولة بواسطة الاتصالات الموحدة التقليدية وهذا البروتوكول. (ج) مخطط التدفق لجامعة كاليفورنيا التقليدية (أعلى) وجهاز تحليل الدم + UC أحادي الجولة (أسفل). (د) استهلاك الوقت لجامعة كاليفورنيا التقليدية ومحلل الدم + دورة واحدة من المقاطعات. (ه) العائد (الجسيمات التي تم الحصول عليها في الساعة) لبروتوكولين مختلفين. تم تمثيل البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (* p < 0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: اختبارات العقم لمراقبة الجودة.

تشمل الطرق التقليدية لعزل المركبات الكهربائية التفاضلية ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، وهطول الأمطار PEG ، ولكل منها مزاياها وعيوبها. في حين أن دمج هذه التقنيات المتباينة قد يعزز إنتاجية أو نقاء المركبات الكهربائية ، فإن الخطوات الإضافية غالبا ما توفر المزيد من الفرص لتلوث العينات. ظهرت في السوق أنظمة متكاملة تدعي أنها تستخرج المركبات الكهربائية بكميات كبيرة وتلتزم بمعايير GMP²¹. ومع ذلك ، فإن اعتمادها على نطاق واسع يشكل تحديا اقتصاديا كبيرا ، لا سيما بالنسبة للعدد المتزايد من فرق أبحاث المركبات الكهربائية. علاوة على ذلك ، فإن عدم وجود بروتوكولات موحدة وإجراءات معترف بها لهذه الأجهزة الجديدة قد يؤدي إلى مستوى معين من المخاطر. يتطلب GMP مزيدا من المحاولات على كل من المنهجية والمعدات لضمان الامتثال المتزامن للعائد والنقاء.

وفقا لمراجعة حديثة للتطبيقات السريرية للمركبات الكهربائية^{القصيرة 23} ، استخدمت 35٪ من الدراسات هذه الطريقة حصريا. استخدمت 12.5٪ إضافية من الدراسات الطرد المركزي الفائق بالاشتراك مع تقنيات أخرى. ويشير تطبيقه الواسع النطاق أيضا إلى أن أجهزة الطرد المركزي الفائقة أصبحت معدات في متناول جزء كبير من^{الباحثين 24}.

من الناحية العملية ، يساعد استخدام الطرد المركزي الفائق طريقتنا على عزل المشتقات الخلوية الدقيقة بدقة عن العناصر الأخرى مثل الخلايا الأكبر وشظايا الخلايا والخلايا^{الميتة 25}. علاوة على ذلك ، يجب تسليط الضوء على أنه على الرغم من الإبلاغ عن فعاليتها ، فإن تحقيق الفعالية العلاجية المرضية يتطلب عادة استخدام تركيزات عالية من مركبات المركبات الكهربائية ، لا سيما في التجارب على والدراسات الحيوانية الكبيرة قبل السريرية والتجارب السريرية. يعد الطرد المركزي الفائق حاليا الطريقة الأكثر أهمية للحصول على مركبات sev عالية التركيز ، مما يعزز أهمية البروتوكول لسيناريوهات التطبيق المذكورة أعلاه. وكطريقة ناضجة ، يمتلك الطرد المركزي الفائق مزايا كونه قابلا للتطبيق على عينات واسعة النطاق وفعالا من حيث التكلفة.

تم استخدام جهاز تحليل الكلى بشكل مبتكر لمعالجة كميات كبيرة من عينات طافية زراعة الخلايا ، مما يتيح العزل اللاحق للمركبات الكهربائية من خلال الطرد المركزي الفائق أحادي الجولة. كما هو موضح في الخطوة 2.5.2 ، فإن الوضع المستخدم في الترشيح الفائق هو ISO-UF. جهاز تحليل الكلى في هذا الوضع هو نفسه TFF. نظرا لعدم استخدام غسيل الكلى الخارجي ، فإن الجزيئات الصغيرة فقط تخرج من غشاء المرشح ، مثل H₂O. TFF هو بالفعل بروتوكول تخصيب sEVs مثبت وموصى به على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن معدات TFF المتوافقة مع GMP لعزل sEV باهظة الثمن وغالبا ما تفتقر إلى المعايير التشغيلية. هذا النوع من المعدات أقل تحققا ، لذلك يصعب ضمان جودة المنتج. في المقابل ، يتم استكمال جهاز غسيل الكلى بالمواد الاستهلاكية الراسخة وبروتوكولات التشغيل الموحدة والموظفين المدربين. تقدم هذه الطريقة حلا قابلا للتطبيق لتركيز العينات ، خاصة لفرق البحث في المستشفيات المشاركة في التجارب السريرية. علاوة على ذلك ، كامتداد ، نظرا لخصائصها الفيزيائية القريبة ، نعتقد أن هذا البروتوكول مناسب نظريا لعزل sevs عن جميع MSCs من سلالات مختلفة ، ولكن بالتأكيد ، هناك حاجة إلى مزيد من التحقق التجريبي.

يوفر هذا البروتوكول متطلبات العقم التي يتم تلبيتها بسهولة أكبر ، وهو مطلب حاسم في بيئات GMP. لقد أجرينا اختبارات شاملة عند استكشاف البروتوكول ، بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات والسموم الداخلية في العينات ، وكانت النتائج كلها سلبية. (الجدول 1) الاختبار هنا ليس هو مفتاح عملية البروتوكول التي أبلغنا عنها ، لذلك اخترنا عدم تضمين النتائج. العقم هو مطلب في جميع أنحاء البروتوكول ، بما في ذلك العينة ، والتشغيل ، والمعدات ، والبيئة ، وما إلى ذلك. يعد اختبار العقم ضروريا ، خاصة بالنسبة للمنتجات المخصصة للاستخدام العلاجي. إلى جانب ذلك ، يجب النظر في مراقبة الجودة الأخرى (QC) للامتثال لممارسات التصنيع الجيدة من جوانب مثل الهوية والفعالية. هنا ، حددنا الخصائص الفيزيائية وعلامات البروتين ل sEV. يجب أيضا التحقق من فاعلية المركبات الكهربائية المعزولة إذا كان الباحثون يعتزمون استخدام المنتج لمزيد من التطبيق.

وتجدر الإشارة أيضا إلى أن هذا البروتوكول يشتمل أولا على خطوة ترشيح مزدوجة مع مرشحات 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر لإزالة الحطام الخلوي والحويصلات التي يزيد حجمها عن 220 نانومتر²⁶. على الرغم من أن الطرق البديلة ، مثل الطرد المركزي منخفض السرعة ، يمكن أن تسبق نظريا الطرد المركزي^{الفائق 27} ، إلا أن هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الكفاءة أثناء العمليات واسعة النطاق. إذا كانت عينات الخلايا الطافية تحتوي على كمية زائدة من الجسيمات بسبب العمليات التي تسبق الترشيح ، فإن غشاء المرشح المستخدم هنا لديه احتمال أكبر لتقليل سرعة الترشيح بسبب الانسداد في العملية. وبالتالي ، يوصى دائما بإعداد أغشية مرشح معقمة احتياطية للاستبدال في حالة الانسداد. علاوة على ذلك ، لا يعتبر تشغيل غسيل الكلى معقدا ، خاصة بالنسبة للمهنيين المدربين. ومع ذلك ، من المهم التأكد من أن وسط زراعة الخلية لا يحتوي على الفينول الأحمر. يتم اتخاذ هذا الاحتياط ليس فقط لأن الأدلة تشير إلى أن المؤشر قد يؤثر على الوظائف البيولوجية ل sev ولكن أيضا بسبب قدرته على إطلاق إنذار تسرب الدم لغسيل الكلى.

هذا البروتوكول غير مناسب للمهام ذات الحجم الصغير من العينات المراد معالجتها. عندما يمكن تحقيق العزل عن طريق جولتين من الطرد المركزي الفائق ، فإن هذا البروتوكول لا يوفر ميزة زمنية. ومع ذلك ، مع زيادة الحجم ، يمكن أن يصبح هذا البروتوكول طريقة عزل فعالة. تستخدم خطوة التركيز في هذا البروتوكول الترشيح الفائق فقط دون استخدام عازلة غسيل الكلى. من المتصور أنه من خلال استخدام مخازن غسيل الكلى المختلفة ، يمكن تحقيق المزيد من إزالة التلوث من المواد المعزولة بشكل مشترك من المركبات الكهربائية الكهربائية. لا يستبعد أن يؤثر المخزن المؤقت لغسيل الكلى على استقرار الغشاء الخارجي للمركبات الكربونية الكهربائية. وبالتالي ، هناك حاجة إلى مزيد من البحث للتحقق من ذلك.

باختصار ، قدمنا طريقة للعزل على نطاق واسع ل MSC-sEVs التي تلبي معايير GMP. يعتمد بشكل أساسي على أجهزة تحليل الكلى وأجهزة الطرد المركزي الفائقة ، والتي يمكن الوصول إليها بشكل أكبر للعديد من فرق البحث من بعض المعدات المتخصصة الأحدث المتوفرة في السوق. لقد قمنا بتمييز المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها ، بالإضافة إلى إجراء فحص لنفايات الترشيح لتحديد العمليات الحرجة التي قد تؤدي إلى فقدان المركبات الكهربائية الكهربائية. تشير النتائج إلى عدم وجود خسارة كبيرة ، مما يشير إلى كفاءة واستقرار البروتوكول. من خلال الاستخدام الكامل لمعدات المختبرات الحالية لتلبية المتطلبات الجديدة ، يوفر هذا النهج أيضا منظورا بحثيا جديدا.

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

تم دعم هذا العمل بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (822101167 ، إلى BB) ومؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ (CSTB2022NSCQ-MSX0020 إلى BB) ، ودكتوراه في تشونغتشينغ "من خلال القطار" مشروع البحث العلمي في الصين (CSTB2022BSXM-JCX0031 إلى BB) والمؤسسة الوطنية للعلوم الصينية (82271132 إلى YL). نحن ممتنون للمساعدة التي قدمها قسم أمراض الكلى ، والمستشفى التابع الأول ، والجامعة الطبية العسكرية الثالثة (الجامعة الطبية العسكرية) ، ومعهد علم الأمراض ومركز السرطان الجنوبي الغربي ، ومستشفى ساوث ويست ، والجامعة الطبية العسكرية الثالثة (الجامعة الطبية العسكرية) للمعدات والدعم الفني.