Iniezione intratecale lombare di vettori di terapia genica per il targeting del sistema nervoso centrale in topi e ratti

Un'iniezione intratecale lombare rappresenta una via di somministrazione traslazionalmente rilevante per la somministrazione della terapia genica al sistema nervoso centrale. Questo protocollo standardizzato completo per le iniezioni intratecali lombari in topi e ratti neonatali, giovani e adulti mira a guidare i ricercatori nell'adozione di questa tecnica per gli studi preclinici di terapia genica.

Un metodo per colpire il sistema nervoso centrale per il trattamento delle malattie neurologiche prevede l'utilizzo della via di somministrazione intratecale lombare. Questo approccio bypassa la barriera emato-encefalica per accedere direttamente al liquido cerebrospinale e indirizzare preferenzialmente le cellule all'interno del sistema nervoso centrale. Diversi studi preclinici pubblicati che utilizzano la via di iniezione intratecale lombare hanno contribuito allo sviluppo di studi clinici di terapia genica; Tuttavia, i protocolli descritti sono variabili e distribuiti su più risorse. Qui viene presentato un set completo di protocolli per iniezioni intratecali lombari in topi e ratti neonatali, giovani e adulti per studi preclinici di terapia genica. Con una formazione adeguata, questa tecnica di iniezione può essere eseguita in modo rapido e affidabile. Oltre a dettagliare il protocollo di iniezione in ogni fase dello sviluppo, vengono discussi i parametri associati, come il volume di iniezione, che possono influenzare i risultati dello studio. Per dimostrare l'applicazione delle iniezioni intratecali lombari per il targeting del sistema nervoso centrale, l'espressione del virus adeno-associato sierotipo 9 nel cervello, nel midollo spinale e nei tessuti periferici viene presentata dopo un'iniezione riuscita o non riuscita.

Una sfida nel trattamento delle malattie neurologiche che richiedono la somministrazione globale del sistema nervoso centrale (SNC) ma che sono altrimenti buoni candidati per la terapia genica è stata in gran parte attribuita al targeting inefficiente del SNC e dei tipi di cellule rilevanti¹. È in corso una notevole quantità di ricerca per ottimizzare il targeting globale delle cellule e dei tessuti del SNC ingegnerizzando veicoli di consegna ^1,2. Tuttavia, la somministrazione di vettori ragionevolmente diffusa può ancora essere ottenuta con l'attuale tecnologia dei vettori di terapia genica, utilizzando determinate combinazioni di vettori virali e vie di somministrazione ^3,4. L'attuale gold standard per ottenere una somministrazione diffusa del SNC da un trattamento una tantum consiste nell'utilizzare il sierotipo 9 del virus adeno-associato (AAV9) insieme a un'iniezione diretta nel liquido cerebrospinale (CSF).

Esistono tre vie di somministrazione tipiche per le iniezioni dirette di liquido cerebrospinale: intratecale lombare (IT), intracerebroventricolare (ICV) e intracisternale (ICM)⁵. Ognuna di queste vie di somministrazione si traduce in diversi modelli di biodistribuzione nel SNC e nei tessuti periferici, ma tutte hanno il vantaggio di bypassare la barriera emato-encefalica (BBB) per raggiungere le cellule del SNC che contribuiscono alla patologia e ai fenotipi della malattia neurologica⁶. L'iniezione di IT lombare è lo standard per l'uso clinico della somministrazione di farmaci nell'uomo, poiché la procedura clinica è di routine e semplice, con meno invasività rispetto alle iniezioni di ICV e ICM.

L'iniezione di IT lombare è una tecnica consolidata che viene prontamente utilizzata nel campo degli anestetici e degli analgesici, con il primo articolo pubblicato nel 1885⁷. Il primo protocollo per le iniezioni di IT lombare nei topi adulti è stato pubblicato nel 1980⁸ e da allora è stato ampiamente adottato e rivisto⁹. Sono stati apportati lievi aggiustamenti o miglioramenti a questi protocolli 10,11,12, inclusa una tecnica di conservazione del prodotto ¹³. Anche i protocolli per le iniezioni di IT lombare nei ratti adulti sono stati pubblicati per la prima volta nel 1976, con cateterismo per somministrazione cronica¹⁴ e iniezione diretta per trattamenti una tantum¹⁵. Più recentemente, gruppi hanno pubblicato protocolli per iniezioni di IT lombare in topi e ratti neonatali o giovani^16,17.

L'ampia adozione e convalida di questa tecnica per bypassare la BBB e le cellule bersaglio nel SNC ha portato a molteplici studi preclinici e clinici di terapia genica di successo per il trattamento delle malattie neurologiche. I dati positivi sull'efficacia e la sicurezza nei topi, nei ratti e nei primati non umani che modellano le malattie neurologiche hanno suscitato entusiasmo e interesse per il potenziale beneficio clinico di queste malattie 18,19,20,21,22,23. Alcuni di questi studi sono ora in fase di sperimentazione clinica (ad esempio, identificatori clinicaltrials.gov NCT02362438, NCT04737460, NCT03381729 e NCT05518188)^3,6. In questo articolo viene descritto un semplice protocollo per iniezioni di IT lombare in topi e ratti di età diverse, senza rimuovere il liquido cerebrospinale, che può essere adottato per progetti di terapia genica traslazionale. Questo protocollo è simile ai protocolli già disponibili che sono ampiamente adottati; Tuttavia, è utile citare questi protocolli pertinenti in un unico posto per un facile accesso e riferimento, insieme alle immagini video di accompagnamento. Questo protocollo spiega l'iniezione per topi e ratti neonatali al giorno postnatale (P) 0-1 e per topi e ratti giovani P21, con risultati rappresentativi da un'iniezione di IT lombare riuscita e non riuscita a P1 nei topi. Nella discussione, vengono affrontati i passi falsi comuni e i dettagli specifici che richiedono un'attenta attenzione durante l'esecuzione di questa procedura, nonché le raccomandazioni su come praticare queste iniezioni prima di iniziare uno studio preclinico.

Le procedure qui descritte sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Southwestern Medical Center dell'Università del Texas. Topi maschi e femmine C57BL6/J wild-type, di età P1-P28, sono stati utilizzati per i protocolli che coinvolgono i topi. I ratti maschi e femmine di Sprague-Dawley wild-type, di età P1-P56, sono stati utilizzati per i protocolli che coinvolgono i ratti. A parte la chirurgia di sopravvivenza descritta nel paragrafo 3, si ritiene che tutte le altre procedure causino solo un disagio momentaneo e non richiedano l'uso di anestetici o analgesici. Gli individui dovrebbero monitorare gli animali da laboratorio per qualcosa di più di un disagio momentaneo e chiedere consiglio al loro personale IACUC e veterinario sulla necessità di anestetici e analgesici. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Iniezione IT lombare di topi >P21

1. Preparazione
   1. Preparare le soluzioni per iniezione, compreso il vettore di terapia genica alla concentrazione o alle concentrazioni desiderate e una soluzione di controllo (di solito il tampone di formulazione utilizzato nella produzione del vettore). Le soluzioni iniettabili devono essere sterili e devono rimanere sterili per tutta la durata della procedura.
      NOTA: Tutte le soluzioni devono essere mantenute in ghiaccio per tutta la durata della procedura.
   2. Raccogli e disinfetta tutti i materiali, inclusi siringa e ago, pipetta e soluzione per iniezione. Seguire le linee guida istituzionali relative all'uso di cappe di biosicurezza e all'esposizione agli iniettori. Le procedure qui descritte sono state condotte in una cabina di biosicurezza di classe 2.
   3. Utilizzando una pipetta da microlitro, misurare il volume desiderato di soluzione iniettabile e trasferirlo in un film di paraffina sterile. Un volume di iniezione di 5 μl è comunemente usato ed è trattato come il volume target per i topi adulti >P21 (Tabella 1).
      NOTA: Se necessario, è possibile aumentare il volume; Tuttavia, gli animali devono essere attentamente monitorati per rilevare eventuali reazioni avverse a volumi di iniezione maggiori. Vedere la sezione Discussione per i dettagli sul volume di iniezione e sulle reazioni avverse. La soluzione può anche essere trasferita direttamente dal puntale della pipetta a una siringa, oppure possono essere utilizzate siringhe da microlitri calibrate a tenuta di gas per misurare direttamente il volume della soluzione iniettabile.
   4. Aspirare la soluzione in una siringa da microlitro con un ago da 30 G 0,5", facendo attenzione a non aspirare bolle d'aria.
      NOTA: Il calibro e la lunghezza dell'ago possono influire sulla penetrazione della pelle. Quando si considera la dimensione della siringa da utilizzare, il volume di iniezione non deve essere inferiore al 10% della capacità della siringa. Per volumi superiori al 50% della capacità della siringa, assicurarsi che lo stantuffo possa essere facilmente premuto con il dito indice. Se non è possibile premere facilmente lo stantuffo, utilizzare una siringa di capacità maggiore.
2. Trattenente
   1. Usando la mano dominante, tieni il topo cosciente (non anestetizzato) per la coda su un tovagliolo di carta. Il tovagliolo di carta aiuterà a trattenere, calmare e impedire al topo di mordere. Il mouse deve essere in posizione prona neutra con l'aspetto laterale del corpo rivolto verso di te.
      NOTA: Non è necessario addestrare o abituare i topi a questa contenzione prima della procedura. I topi possono avere difficoltà a causa della contenzione, ma non dovrebbero suscitare una risposta specifica al dolore. Se si osservano risposte al dolore più che momentanee, può essere necessaria la somministrazione di analgesici; consultare un veterinario.
   2. Con la mano non dominante, piega una parte del tovagliolo di carta sopra la testa e la parte superiore del corpo del topo e afferra saldamente la cintura pelvica tra il pollice non dominante e l'indice. Assicurati che il palmo sia a coppa, appoggiato intorno alla testa del mouse. La cresta iliaca del topo dovrebbe essere palpabile e posizionata al centro della falange distale di ciascun dito (Figura 1A, B).
      NOTA: L'irruzione da mani o tovaglioli di carta non deve compromettere la respirazione.
   3. Ruotare delicatamente la base della coda per garantire il corretto allineamento della colonna vertebrale. Il bacino del topo dovrebbe essere quadrato, in modo tale che i processi vertebrali della colonna lombare siano perpendicolari alla superficie di lavoro.
   4. Tamponare la regione lombare dorsale del topo con un tampone per la preparazione di alcol al 70%.
   5. Separare i capelli da ~2-6 mm cranialmente alla cresta iliaca per aiutare a visualizzare la posizione dell'iniezione.
   6. Sentire lo spazio intervertebrale L4-L5 o L5-L6, ~2-6 mm dal cranio alla cresta iliaca.
      NOTA: La distanza esatta è variabile a seconda delle dimensioni e dell'età del mouse.
3. Iniezione
   1. Usando la mano dominante, tenere il centro della siringa da microlitro e posizionarla perpendicolarmente alla colonna vertebrale del topo nello spazio intervertebrale L4-L5 o L5-L6. Assicurarsi che lo stantuffo della siringa possa essere premuto con il dito indice senza movimenti eccessivi della mano. Con lo smusso dell'ago rivolto verso la testa del topo, perforare la pelle sullo spazio intervertebrale.
   2. Quando i bordi dell'osso attorno allo spazio intervertebrale si avvertono sulla punta dell'ago, ridurre l'angolo della siringa a 30-45 gradi (Figura 1A).
   3. L'ago dovrebbe scivolare nello spazio intervertebrale provocando un improvviso movimento della coda e dovrebbe essere stretto saldamente tra le vertebre.
   4. Facendo attenzione a non spostare la siringa, premere costantemente lo stantuffo per erogare la soluzione entro 10 s.
   5. Tenere la siringa in posizione per 15-30 s dopo aver premuto completamente lo stantuffo per consentire la dissipazione della soluzione e prevenire il riflusso.
   6. Estrarre dolcemente e lentamente la siringa dal mouse con lo stesso angolo di ingresso di 30-45 gradi. Quando l'ago viene estratto, ruotare la siringa per evitare il riflusso.
      NOTA: Prestare attenzione a non far avanzare l'ago quando si ruota la siringa, poiché ciò potrebbe causare danni fisici al midollo spinale.
   7. Libera il mouse dal sistema di ritenuta e rimettilo nella gabbia di casa.
   8. Monitorare il topo dopo l'iniezione per deambulazione anormale, compromissione motoria, anomalie respiratorie e coordinazione. Vedere la Discussione per ulteriori dettagli sulle reazioni avverse.
   9. Pulire l'attrezzatura seguendo le raccomandazioni del produttore. Per iniezioni multiple, si raccomandano siringhe diverse per ogni vettore di terapia genica e soluzione di controllo.
      NOTA: Gli aghi rimovibili possono essere puliti, sterilizzati e riutilizzati più volte; Tuttavia, gli aghi smussati non devono essere utilizzati in quanto possono danneggiare l'animale e aumentare la probabilità di iniezioni mancate. Un ago smussato non perfora facilmente la pelle e deve essere scartato in modo appropriato. Se le siringhe sono limitate, si consiglia di completare tutte le iniezioni del veicolo prima di procedere al vettore di terapia genica e di iniettare la dose più bassa di terapia genica prima di somministrare dosi più elevate.
   10. Seguire le linee guida istituzionali per la sterilizzazione delle attrezzature tra gli animali.

Figura 1: Schema del posizionamento del dito e della siringa per l'iniezione intratecale lombare in topi e ratti. (A) Vista laterale di un >P21 di topo che mostra il posizionamento dell'ago e la transizione dell'angolo della siringa durante un'iniezione IT lombare. L'ovale rosso tratteggiato indica il posizionamento delle dita sulla cresta iliaca del topo. Una vista ingrandita della colonna vertebrale mostra lo spazio intratecale (blu) con il posizionamento approssimativo dell'ago (freccia verde) e il midollo spinale (rosa). Vista dorsale di (B) un topo >P21), (C) un topo D) un ratto >P21, con punti di riferimento per il posizionamento dell'ago (cerchio verde), la cintura pelvica (ovale giallo tratteggiato) e il posizionamento delle dita (ovale rosso tratteggiato). Anche il sito di incisione e i divaricatori sono raffigurati in (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Iniezione IT lombare di topi e ratti

Sebbene molti fattori possano influenzare la trasduzione del vettore della terapia genica, la colorazione istologica del tessuto rimane il metodo più accurato per determinare il successo delle iniezioni intratecali lombari (IT). La distribuzione ampia e uniforme del vettore della terapia genica all'interno del sistema nervoso centrale (SNC) dopo l'iniezione è indicativa di una procedura di successo. La Figura 2C rappresenta un'iniezione riuscita di una terapia genica autocomplementare mediata da AAV9 che guida l'espressione di transgeni ubiquitari deboli sotto il promotore JeT alla dose di 1,3 × 10¹¹ vg/topo in topi neonatali (P1), 4 mesi dopo l'iniezione. L'analisi dell'RNAscope, utilizzando una sonda mirata al transgene fornito dalla terapia genica, rivela un'ampia distribuzione nel midollo spinale lombare, nel midollo spinale cervicale e nel cervello. È inclusa una sezione del fegato e del cuore per evidenziare che, anche con l'iniezione diretta di liquido cerebrospinale (CSF), il vettore della terapia genica può ancora essere distribuito ai tessuti periferici.

Figura 2: Sezioni di tessuto colorate da 5 micron del SNC e del tessuto periferico di topo 4 mesi dopo l'iniezione a P1. La colorazione rossa indica l'espressione del transgene tramite RNAscope e la controcolorazione blu dei nuclei viene eseguita tramite ematossilina. (A) Iniezione con un tampone di formulazione di controllo. (B) Iniezione intraparenchimale non riuscita con un vettore AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). (C) Iniezione di IT lombare riuscita con un vettore AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). Il vettore di terapia genica utilizzato in (B) e (C) è stato somministrato a una dose traslazionalmente rilevante di 1,3E11 vg/topo. Barra della scala: pannello superiore (5 mm); Pannello inferiore (1 mm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'espressione concentrata nel midollo spinale lombare abbinata a una mancanza di espressione nel cervello, come mostrato nella Figura 2B, può indicare un'iniezione intraparenchimale del midollo spinale e deve essere considerata un'iniezione fallita. Ciò accade quando l'ago viene inserito troppo in profondità nella colonna vertebrale, oltre lo spazio intratecale e nel midollo spinale. Inoltre, un'espressione molto bassa o assente nel midollo spinale e nel cervello (non mostrata) dovrebbe essere considerata un'iniezione fuori bersaglio fallita, supponendo che un vettore e una dose vengano utilizzati dove è prevista un'ampia distribuzione del SNC. Ciò può essere dovuto al fatto che l'ago non è inserito abbastanza lontano o che è laterale alla linea mediana.

I modelli di espressione osservati dalle iniezioni riuscite possono differire a causa dei seguenti otto fattori come esempi: (1) età all'iniezione, (2) immunità preesistente, (3) velocità di infusione, (4) vettore di terapia genica, (5) dose di terapia genica, (6) proteine della superficie cellulare, (7) tropismo e (8) se applicabile, una scelta appropriata del promotore per guidare l'espressione transgenica⁶. Sebbene i modelli di espressione possano differire, la distribuzione ampia, uniforme e diffusa sarà universale purché la dose sia sufficientemente alta con un vettore efficace, come AAV9.

I principali limiti dell'utilizzo dell'analisi istologica per confermare il successo dell'iniezione di IT lombare sono i lunghi tempi di attesa - attendere fino alla fine di uno studio, dopo che le necroscopie sono state eseguite e il tessuto è stato raccolto - e le ampie risorse necessarie per l'elaborazione del tessuto di tutti i topi in un ampio studio di terapia genica. Purtroppo, la nostra esperienza è stata che gli indicatori immediati e diretti di un'iniezione positiva o negativa possono essere inaffidabili; Tuttavia, il riflesso del colpo di coda quando l'ago entra nello spazio intratecale è un buon indicatore di posizionamento riuscito in tempo reale e probabilmente indica un'iniezione riuscita. Non confondere una contrazione poiché l'ago perfora la pelle in un topo/ratto non anestetizzato con una risposta del colpo di coda all'ago che entra nello spazio intratecale. È stato riportato che l'uso di agenti farmacologici come NMDA, sostanza P e lidocaina, sia in allenamento che miscelati con la soluzione sperimentale per iniezione, fornisce un'indicazione più immediata del successo dell'iniezione ^9,11,24. Se si considerano questi agenti, è importante valutare la loro compatibilità con il vettore di terapia genica.

L'iniezione di IT lombare è una procedura rapida e minimamente invasiva che rilascia in modo affidabile un vettore di terapia genica nel liquido cerebrospinale per il trattamento delle malattie del SNC ^5,6. La procedura è rilevante dal punto di vista della traduzione e il protocollo qui descritto descrive in dettaglio come eseguire questa via di somministrazione in topi e ratti di tutte le età, dai neonati agli adulti. È importante definire questo protocollo per topi e ratti di tutte le età, oltre a fornire video di supporto, per aiutare i ricercatori nell'adozione di questo metodo per la somministrazione della terapia genica. L'esperienza del nostro laboratorio è che questo protocollo può essere implementato in modo coerente su più utenti e studia nel tempo 18,25,26,27,28,29,30.

Ci sono importanti differenze quando si esegue l'iniezione di IT lombare nei topi/ratti più giovani rispetto ai topi/ratti più anziani, in particolare l'angolo con cui l'ago viene inserito nella colonna vertebrale e il volume raccomandato che viene iniettato. I volumi di iniezione di IT lombare riportati variano considerevolmente tra gli studi e tra le specie³¹. La considerazione del volume di iniezione è importante per evitare aumenti duraturi della pressione intracranica (ICP), che possono compromettere il flusso del liquido cerebrospinale e del sangue cerebrale, causare disagio e portare a complicanze neurologiche croniche, tra cui idrocefalo, ischemia, danno cellulare e morte^32,33. L'ICP è determinato dal volume del liquido cerebrospinale, del sangue cerebrale e del tessuto del SNC, che non può essere direttamente correlato al peso corporeo. Al normale funzionamento, l'ICP è autoregolato da molti fattori, tra cui il volume del liquido cerebrospinale, il volume del sangue cerebrale, la respirazione, la posizione del corpo, il tasso di produzione del liquido cerebrospinale e il tasso di drenaggio del liquido cerebrospinale nel sangue^33,34. I volumi di iniezione di IT dovrebbero quindi essere determinati in base alle proprietà del liquido cerebrospinale (Tabella 1) anziché al peso corporeo 25,27,28,30. I volumi raccomandati da iniettare ad ogni età in ciascuna specie sono indicati in grassetto.

Tabella 1: Riepilogo dei volumi di iniezione di IT lombare per topi e ratti di età diverse. I valori in grassetto sono consigliati e sono stati consegnati in modo sicuro. I volumi massimi possibili non sono stati valutati formalmente. Ulteriori informazioni sui parametri noti del liquido cerebrospinale - volume totale, velocità di produzione, turnover e pressione intracranica - nei topi e nei ratti sono incluse come riferimento.

C'è una mancanza di conoscenza in tutto il campo per quanto riguarda la soglia superiore per i volumi di iniezione IT in bolo una tantum. Nell'uomo adulto, nei ratti e nei topi in cui il volume del liquido cerebrospinale è noto, un aumento del 30% del volume totale del liquido cerebrospinale non sembra causare lesioni croniche o malattie 31,33,35,36. La mancanza di volumi noti di liquido cerebrospinale nei topi giovani o neonati rende impossibile un'estrapolazione simile. Alcuni gruppi stanno iniziando a esaminare il volume e la produzione di liquido cerebrospinale negli animali più giovani³⁷. Fino a quando non saranno comprovate ulteriori indagini in queste aree, il volume di iniezione continuerà a essere soggetto ai valori riportati dallo sperimentatore.

Topi e ratti, specialmente se trattati in giovane età o con alti volumi di iniezione, possono provocare flessione dei muscoli, estensione degli arti, respirazione rapida o paralisi temporanea degli arti posteriori che dovrebbe risolversi da sola entro pochi minuti. In casi estremi, gli aumenti acuti dell'ICP possono causare anomalie cardiovascolari e respiratorie, che possono essere mortali^32,33. Se eventuali anomalie post-procedurali persistono dopo 24 ore, i topi/ratti devono essere rimossi dallo studio e sottoposti a eutanasia umana. La paralisi persistente degli arti posteriori può verificarsi se l'ago viene inserito troppo in profondità, colpendo il midollo spinale. Ciò può essere dovuto a un errore comune durante l'esecuzione dell'iniezione IT lombare: movimento della siringa dopo il colpo di coda mentre si preme lo stantuffo. Il movimento della siringa e dell'ago deve essere evitato. Se non è possibile acquisire la posizione corretta con la puntura iniziale, è possibile effettuare un secondo tentativo nella stessa posizione. Se anche il secondo tentativo non ha successo, prova a modificare la posizione dell'ago per mirare allo spazio intervertebrale successivo. Si noti che più punture di ago possono causare la fuoriuscita di un'iniezione successivamente riuscita.

Diventare esperti nell'iniezione di informatica lombare può richiedere tempo. Per praticare le iniezioni come procedura terminale, seguire il protocollo di cui sopra utilizzando una soluzione colorante approvata, come il blu di Evans o il colorante verde McCormick filtrato a 0,2 micron (Figura 3) o con gli agenti farmacologici trattati nella sezione Risultati rappresentativi. Si consiglia di utilizzare il colorante per risolvere i problemi e padroneggiare l'iniezione perché è facile capire se un'iniezione è stata un successo o un fallimento entro 1 minuto. La pratica con il colorante è solo per le procedure di non sopravvivenza, poiché gli animali possono sviluppare una reazione al colorante quando somministrato direttamente al SNC. Questa reazione può verificarsi entro un minuto da un'iniezione riuscita ed è caratterizzata da rapidi movimenti di prurito e contorsione. Gli animali dovrebbero essere immediatamente soppressi una volta osservata questa reazione per ridurre al minimo il disagio. Dopo un'iniezione di colorante praticata con successo, il colorante rimarrà localizzato nella colonna vertebrale (nessun colorante nel tessuto periferico vicino) e si sposterà lungo la colonna vertebrale fino al cervelletto, al cervello e ai bulbi olfattivi. A P1, la pelle è abbastanza trasparente da poter vedere il colorante muoversi lungo la colonna vertebrale nella coda. Se il colorante non raggiunge il cervello entro pochi minuti, l'iniezione fallisce.

Figura 3: Colorante verde McCormick nel cervello dopo iniezioni di IT lombare di successo. Tutti i cervelli provengono da topi P21 iniettati con 5 μL di colorante e sono mostrati nella vista ventrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per ulteriori informazioni sui parametri associati rilevanti per la progettazione della sperimentazione preclinica, come il titolo virale e le dosi, vedere le revisioni precedentemente pubblicate ^3,6,31.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Desideriamo ringraziare l'UT Southwestern AAV Viral Vector Core Facility per la produzione del vettore AAV9 e Yuhui Hu, ricercatore presso il Gray Lab, per l'elaborazione e la colorazione del tessuto presentato nella Figura 2.