Microscopia a due fotoni per lo studio dei tendini

Questo articolo descrive il processo di preparazione, impostazione e imaging dei tendini utilizzando la microscopia multifotone. Inoltre, copre l'applicazione di SHG per l'analisi dell'allineamento delle fibrille di collagene e la creazione di una rappresentazione 3D dei tendini. Questa metodologia si rivela molto preziosa nella caratterizzazione delle cellule tendinee e della loro ECM durante la lesione e lo sviluppo.

La microscopia a due fotoni è emersa come un potente strumento per valutare le cellule dei tessuti profondi e caratterizzare l'allineamento della matrice extracellulare (ECM) in vari sistemi biologici. Questa tecnica si basa su interazioni luce-materia non lineari per rilevare due segnali distinti: il segnale di diffusione generato dalla seconda armonica (SHG), che facilita la visualizzazione delle fibre di collagene e il loro orientamento, e il segnale di eccitazione nel vicino infrarosso per l'imaging dell'autofluorescenza eccitata dai raggi ultravioletti.

L'imaging SHG si dimostra particolarmente efficace nella visualizzazione delle fibre di collagene grazie alla struttura cristallina non centrosimmetrica del collagene fibrillare I. Dato che i tendini sono tessuti ricchi di matrice con un numero limitato di cellule, il loro alto contenuto di collagene li rende candidati ideali per l'analisi mediante microscopia a due fotoni. Di conseguenza, la microscopia a due fotoni offre un mezzo prezioso per analizzare e caratterizzare le anomalie del collagene nei tendini. La sua applicazione si estende allo studio dello sviluppo dei tendini, delle lesioni, della guarigione e dell'invecchiamento, consentendo la caratterizzazione completa delle cellule tendinee e delle loro interazioni con la MEC in varie condizioni utilizzando strumenti di microscopia a due fotoni. Questo protocollo delinea l'uso della microscopia a due fotoni nella biologia dei tendini e presenta una metodologia adattata per ottenere un imaging e una caratterizzazione efficaci delle cellule tendinee durante lo sviluppo e dopo la lesione. Il metodo consente l'utilizzo di sottili sezioni microscopiche per creare un'immagine completa della ECM all'interno dei tendini e delle cellule che interagiscono con questa matrice. In particolare, l'articolo mostra una tecnica per generare immagini 3D utilizzando la microscopia a due fotoni in modelli animali.

Per funzionare correttamente e trasmettere la forza dal muscolo all'osso¹, i tendini si basano sui legami intermolecolari e intramolecolari tra le fibre di collagene. L'intricato autoassemblaggio, la reticolazione e l'allineamento delle fibre di collagene provocano la creazione di una matrice altamente organizzata che contribuisce alla resistenza biomeccanica e alla flessibilità del tessuto tendineo ^2,3,4. Sebbene anche altre proteine della MEC contribuiscano alla stabilità della rete fibrillare nei tendini⁵, la massa secca del tendine è composta per circa l'86% da collagene⁶, con il collagene I che costituisce fino al 96% del contenuto totale di collagene ^7,8. Questo in definitiva rende la struttura del collagene un output chiave per la normale salute e funzione dei tendini.

Alcune modalità di imaging clinico utilizzate per i tendini sono la risonanza magnetica e/o l'ecografia. Sebbene la tecnologia a ultrasuoni fornisca immagini della struttura fascicolare del tendine e riveli parte della struttura fibrillare nel tessuto⁹, la risoluzione non è ideale per la quantificazione. La risonanza magnetica ha una risoluzione spaziale migliore rispetto all'ecografia, ma è ancora limitata. Tuttavia, questi metodi sono anche limitati nella loro potenziale profondità di imaging attraverso un tessuto. Su scala più micrometrica, la diffusione della luce a piccolo e grandangolo e la microscopia confocale possono essere utilizzate per valutare la struttura delle fibrille di collagene e qualsiasi potenziale anomalia.

Al contrario, la microscopia a generazione di seconda armonica (SHG) differisce da altri metodi di imaging in quanto può catturare il guscio esterno delle fibrille di collagene. Le fibrille di collagene I nei tendini sono organizzate in modo parallelo uniassiale attraverso l'ECM tendineo e sono di natura non centrosimmetrica ^4,10. Queste proprietà possono essere sfruttate per l'imaging utilizzando un microscopio multifotone, che può produrre immagini nitide fino a 2-3 volte più profonde rispetto all'imaging confocale¹¹. Questo ci permette anche di generare sezioni ottiche del tendine di migliore qualità. Quando la luce viene proiettata nel campione di interesse, viene prodotto un segnale SHG e questa dispersione della luce può essere catturata. Nei tendini, questo produce un'immagine della struttura e dell'allineamento del collagene, permettendoci così di valutare le potenziali conseguenze morfologiche e patologiche di tendinopatie, lesioni, ecc.

Poiché il collagene costituisce la maggior parte della massa secca del tendine e contribuisce alla funzione tendinea ^6,12, l'interruzione della struttura del collagene può influenzare le proprietà biomeccaniche dei tendini. Pertanto, l'analisi della sua struttura può aiutarci a comprendere meglio l'impatto e la gravità delle lesioni, oltre a creare una metrica per l'efficacia della guarigione. Questo articolo esamina un metodo che utilizza la microscopia multifotone e SHG per analizzare come lo sviluppo e le lesioni influenzano la struttura e l'allineamento delle fibrille di collagene I e per generare immagini 3D della ECM tendinea in modelli animali. Pertanto, il nostro metodo per l'imaging dei tendini può aiutare i ricercatori a caratterizzare le cellule tendinee e la MEC durante lo sviluppo o dopo una lesione.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Protocollo #2013N0000062) e le linee guida AAALAC presso il Massachusetts General Hospital. Per il presente studio sono stati utilizzati BHLHE40 topi femmina knockout nulli o eterozigoti in un background Scx-GFP, dell'età di 30 giorni. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione e fissazione dei tessuti

1. Per preparare il tessuto, sopprimere i topi in una camera di CO₂ (seguendo protocolli approvati istituzionalmente) seguita da lussazione cervicale.
2. Per ridurre la quantità di pelo che può attaccarsi al campione di tessuto, spruzzare il topo con il 70% di EtOH fino a quando il pelo non è saturo. Spellare gli arti posteriori e poi, usando le forbici, rimuovere i due arti posteriori tagliando l'articolazione dell'anca.
3. Posizionare i due arti posteriori in un flaconcino di scintillazione da 20 ml e immergerli in PFA al 4% in modo che il flaconcino sia pieno. Posizionare i flaconcini a 4 °C agitando per una notte.
4. Lavare gli arti posteriori in 1x PBS a temperatura ambiente (RT) agitando per 10 minuti e ripetere per un totale di 3 volte. Immergere gli arti posteriori in EDTA 0,5 M (pH 8,0) a 4 °C agitando per un massimo di 2 settimane, sostituendo con EDTA fresco ogni 2-3 giorni.
5. Lavare gli arti posteriori in 1x PBS a RT con agitazione per 10 minuti, ripetendo i lavaggi per un totale di 3 volte.
6. Immergere gli arti in 1x PBS fresco e conservare a 4 °C fino a quando non vengono utilizzati per l'imaging.

2. Dissezione del tendine e preparazione del tessuto per l'imaging

1. Tenendo il piede con una pinza, far scorrere un'estremità della lama delle forbici a molla (vedi Tabella dei materiali) sotto il tendine d'Achille e assicurarsi di tagliare il più vicino possibile alla giunzione miotendinea.
2. Tenere l'estremità miotendinea recisa del tendine con una pinza e utilizzare le forbici a molla per tagliare il tendine il più vicino possibile all'osso.
   NOTA: Se necessario, utilizzare una pinza per tenere il tendine d'Achille lontano dal resto dell'arto posteriore durante il primo taglio. Assicurarsi di non schiacciare o danneggiare il tessuto, poiché ciò influenzerà l'allineamento del collagene durante l'imaging.
3. Per permeabilizzare e avere una controcolorazione nucleare, immergere il tendine sezionato in PBT (1% Triton-X in PBS) con 0,1% di Draq5 (concentrazione madre, 5 mM, vedi Tabella dei materiali). Posizionare il tendine in una provetta da microcentrifuga da 2 mL e aggiungere 1 uL di Draq5 a 1 mL di PBT. Incubare per una notte a RT su un bilanciere. Poiché Draq5 è sensibile alla luce, coprire le provette per microcentrifuga con un foglio di alluminio e proteggere i campioni dalla luce.
4. Prima dell'imaging, rimuovere la soluzione Draq5 e sostituirla con dPBS. Assicurarsi di continuare a proteggere il campione dalla luce.
   ATTENZIONE: Draq5 ha una tossicità di categoria tre ed è considerato pericoloso dallo standard OSHA per la comunicazione dei pericoli. Evitare il contatto e smaltirlo in un contenitore per rifiuti etichettato.
5. Utilizzando un punzone per biopsia con un diametro interno di 6 mm, ritagliare un pezzo di schiuma gel (vedi Tabella dei materiali) e posizionarlo in una piccola piastra di Petri da 60 x 15 mm. Aggiungere ddH₂O al piatto per consentire alla schiuma di gel di espandersi.
6. Posizionare il tendine d'Achille sezionato su schiuma di gel. Utilizzando un vetrino coprioggetti incollato a una rondella, posizionare con cura la rondella sul tendine fino a quando il vetrino coprioggetti non entra in contatto con il tessuto. Per evitare problemi durante l'imaging, assicurarsi che non vi siano bolle d'aria tra il campione e il vetrino coprioggetti. Se necessario, aggiungere altro ddH₂O al piatto per coprire il campione e la lavatrice con il vetrino coprioggetti.

3. Imaging con un microscopio multifotone

1. Utilizzando un microscopio laser multifotone FVMPE-RS, un obiettivo 25x che può essere immerso in acqua, un laser pulsato IR HPDS-O e un laser pulsato IR (vedere la tabella dei materiali), individuare il campione e la regione di interesse che verranno ripresi utilizzando il percorso della luce EPI. Una volta individuato il campione, posizionare la telecamera sull'estremità miotendinea o entesale del tendine d'Achille.
2. Cambia il percorso della luce su LSH, regola l'impostazione del laser IR di Laser 2 su 840 nm e allinea attivamente. Regolare l'intensità HV per essere in grado di vedere il tessuto e il segnale SHG, senza superare il 20%. Non regolare il guadagno e mantenere l'offset uguale a 0.
3. Quindi, configura i parametri z-stack per acquisire le immagini di esempio. Utilizzare una dimensione di scansione 1024 x 1024 e impostare la dimensione del passo su 0,4 micron. Gli Z-stack sono, in media, circa 150 fette e partono dalla guaina esterna e si spostano verso il centro del tendine fino a quando il segnale SHG non è più chiaro, producendo sezioni ottiche sagittali¹³.
4. Regolare la potenza del laser sulla modalità Z luminosa per consentire la standardizzazione del rilevamento del segnale. Una volta stabiliti i parametri di avvio/arresto Z-stack, impostare l'intensità del laser da 4 all'inizio dell'imaging e 6 alla fine dell'imaging. Questo aiuta a mantenere la coerenza nella segnalazione SHG mentre l'endoscopio immagini più in profondità nel tessuto.
5. Una volta generati gli z-stack, elaborateli ulteriormente in ImageJ/FIJI per creare un filmato delle sezioni ottiche con orientamento trasversale. A tale scopo, aprire il software ImageJ/FIJI¹⁴ e fare clic su Image > Stacks > Reslice. Questo ci permetterà di avere una visione trasversale del tendine d'Achille, rivelando la morfologia stellata dei tenociti e il loro orientamento nella matrice di collagene.

Questo protocollo è utile per caratterizzare le cellule tendinee e la loro matrice extracellulare (ECM) dopo una lesione, durante lo sviluppo o in una condizione mutante. Con un'attenta dissezione e preparazione del campione, i video z-stack possono essere generati attraverso il tessuto in orientamento sagittale (Video 1 e Video 2). Utilizzando ImageJ/FIJI per elaborare e sezionare le immagini, viene creata una vista trasversale del tendine d'Achille (<...

Questo articolo presenta un metodo per preparare, sezionare e visualizzare il tendine d'Achille del topo, utilizzando le proprietà cristalline non centrosimmetriche della ECM tendinea. Le fasi chiave della preparazione dei tessuti riguardano la permeabilizzazione delle controcolorazioni e il corretto posizionamento dei tessuti in una capsula di Petri durante l'imaging. Al posto di Draq5, Hoechst 33258 può essere utilizzato con una diluizione 1:100.000¹³, ma Draq...

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli autori ringraziano Jenna Galloway e i membri del Galloway Lab per il loro supporto e incoraggiamento nello sviluppo e nella risoluzione dei problemi di questi protocolli.