מיקרוסקופיה דו-פוטונית לחקר גידים

מאמר זה מתאר את תהליך ההכנה, ההגדרה וההדמיה של גידים באמצעות מיקרוסקופיה מרובת פוטונים. בנוסף, הוא מכסה את היישום של SHG לניתוח יישור סיבי קולגן ויצירת ייצוג תלת מימדי של גידים. מתודולוגיה זו מוכיחה את עצמה כבעלת ערך רב באפיון תאי הגיד וה-ECM שלהם במהלך פציעה והתפתחות.

מיקרוסקופיה דו-פוטונית התגלתה ככלי רב עוצמה להערכת תאי רקמות עמוקות ולאפיון יישור המטריצה החוץ-תאית (ECM) במערכות ביולוגיות שונות. טכניקה זו מסתמכת על אינטראקציות אור-חומר לא ליניאריות כדי לזהות שני אותות נפרדים: אות הדיפוזיה השני שנוצר בהרמוניה (SHG), המאפשר הדמיה של סיבי קולגן וכיוונם, ואות העירור הקרוב לאינפרא אדום להדמיית אוטופלואורסצנציה נרגשת אולטרה סגול.

הדמיית SHG הוכיחה את עצמה כיעילה במיוחד בהדמיית סיבי קולגן בשל המבנה הגבישי הלא צנטרו-סימטרי של קולגן סיבי I. בהתחשב בכך שהגידים הם רקמות עשירות במטריקס עם מספר מוגבל של תאים, תכולת הקולגן הגבוהה שלהם הופכת אותם למועמדים אידיאליים לניתוח באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית. כתוצאה מכך, מיקרוסקופיה דו-פוטונית מציעה אמצעי רב ערך לניתוח ואפיון חריגות קולגן בגידים. יישומו משתרע על חקר התפתחות גידים, פציעות, ריפוי והזדקנות, ומאפשר אפיון מקיף של תאי גידים והאינטראקציות שלהם עם ה-ECM בתנאים שונים באמצעות כלי מיקרוסקופיה דו-פוטונית. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיה דו-פוטונית בביולוגיה של הגידים ומציג מתודולוגיה מותאמת להשגת הדמיה ואפיון יעילים של תאי גידים במהלך ההתפתחות ולאחר הפציעה. השיטה מאפשרת שימוש בחתכים מיקרוסקופיים דקים ליצירת תמונה מקיפה של ה-ECM בתוך הגידים והתאים המקיימים אינטראקציה עם מטריצה זו. בעיקר, המאמר מציג טכניקה ליצירת תמונות תלת מימד באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית במודלים של בעלי חיים.

כדי לתפקד כראוי ולהעביר כוח מהשריר לעצם¹, הגידים מסתמכים על הקשרים הבין-מולקולריים והתוך-מולקולריים בין סיבי הקולגן. ההרכבה העצמית המורכבת, ההצלבה והיישור של סיבי הקולגן מביאים להקמת מטריצה מאורגנת ביותר התורמת לחוזק ולגמישות הביומכנית של רקמת הגיד ^2,3,4. למרות שחלבוני ECM אחרים תורמים גם הם ליציבות הרשת הסיבית בגידים⁵, המסה היבשה של הגיד היא כ-86% קולגן⁶, כאשר קולגן I מהווה עד 96% מכלל תכולת הקולגן ^7,8. זה בסופו של דבר הופך את מבנה הקולגן לתפוקה מרכזית של בריאות ותפקוד תקינים של הגידים.

כמה שיטות הדמיה קליניות המשמשות לגידים הן MRI ו/או אולטרסאונד. בעוד שטכנולוגיית אולטרסאונד מספקת תמונות של המבנה הפאסיקולרי של הגיד וחושפת חלק מהמבנה הסיבי ברקמה⁹, הרזולוציה אינה אידיאלית לכימות. ל-MRI יש רזולוציה מרחבית טובה יותר מאשר הדמיית אולטרסאונד, אך היא עדיין מוגבלת. עם זאת, שיטות אלו מוגבלות גם בעומק ההדמיה הפוטנציאלי שלהן דרך רקמה. בקנה מידה מיקרו יותר, ניתן להשתמש בפיזור אור בזווית קטנה ורחבה ובמיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך את מבנה סיבי הקולגן וכל חריגה פוטנציאלית.

לעומת זאת, מיקרוסקופ דור הרמוני שני (SHG) שונה משיטות הדמיה אחרות מכיוון שהוא יכול ללכוד את המעטפת החיצונית של סיבי הקולגן. סיבי קולגן I בגידים מאורגנים בצורה מקבילה חד-צירית דרך הגיד ECM והם לא צנטרו-סימטריים באופיים ^4,10. ניתן למנף את המאפיינים הללו להדמיה באמצעות מיקרוסקופ רב-פוטוני, שיכול לייצר תמונות ברורות עמוקות עד פי 2-3 מהדמיה קונפוקלית¹¹. זה גם מאפשר לנו לייצר חלקים אופטיים באיכות טובה יותר של הגיד. כאשר אור מוקרן לתוך הדגימה המעניינת, נוצר אות SHG, וניתן ללכוד את פיזור האור הזה. בגידים, זה מייצר תמונה של מבנה הקולגן והיישור, ובכך מאפשר לנו להעריך את ההשלכות המורפולוגיות והפתולוגיות הפוטנציאליות של גידים, פציעות וכו '.

מכיוון שקולגן מהווה את רוב המסה היבשה של הגידים ותורם לתפקוד הגידים ^6,12, הפרעה במבנה הקולגן יכולה להשפיע על התכונות הביומכניות של הגידים. לפיכך, ניתוח מבנהו יכול לעזור לנו להבין טוב יותר את ההשפעה והחומרה של פציעות, כמו גם ליצור מדד ליעילות ריפוי. מאמר זה סוקר שיטה המשתמשת במיקרוסקופ מולטיפוטון ו-SHG כדי לנתח כיצד התפתחות ופציעות משפיעות על המבנה והיישור של סיבי קולגן I וליצור תמונות תלת מימד של ECM בגידים במודלים של בעלי חיים. לכן, השיטה שלנו להדמיית גידים עשויה לסייע לחוקרים לאפיין תאי גידים ו-ECM במהלך ההתפתחות או לאחר פציעה.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) (פרוטוקול #2013N0000062) ו-AAALAC בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס. BHLHE40 עכברי נוקאאוט אפסיים או הטרוזיגוטיים על רקע Scx-GFP, בני 30 יום, שימשו למחקר הנוכחי. בעלי החיים הושגו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת רקמות וקיבוע

1. כדי להכין את הרקמה, המתת חסד של עכברים בתא CO₂ (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד) ואחריו פריקת צוואר הרחם.
2. כדי לסייע בהפחתת כמות הפרווה שעלולה להידבק לדגימת הרקמה, רססו את העכבר ב-70% EtOH עד שהפרווה רוויה. עור את הגפיים האחוריות, ולאחר מכן בעזרת מספריים, הסר את שתי הגפיים האחוריות על ידי חיתוך במפרק הירך.
3. הניחו את שתי הגפיים האחוריות בבקבוקון נצנוץ של 20 מ"ל, וטבלו אותן ב-4% PFA כך שהבקבוקון יתמלא. מניחים את הבקבוקונים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ערבוב למשך הלילה.
4. שטפו את הגפיים האחוריות ב-1x PBS בטמפרטורת החדר (RT) עם תסיסה למשך 10 דקות וחזרו על הפעולה בסך הכל 3 פעמים. טבלו את הגפיים האחוריות ב-0.5 מ' EDTA (pH 8.0) ב-4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עד שבועיים, והחליפו ב-EDTA טרי כל 2-3 ימים.
5. שטפו את הגפיים האחוריות ב-1x PBS ב-RT עם תסיסה למשך 10 דקות, וחזרו על השטיפות בסך הכל 3 פעמים.
6. טבלו את הגפיים ב-PBS טרי 1x ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שישמשו להדמיה.

2. דיסקציה של הגיד והכנת רקמה להדמיה

1. תוך כדי החזקת כף הרגל עם מלקחיים, החלק קצה אחד של להב המספריים הקפיץ (ראה טבלת חומרים) מתחת לגיד אכילס והקפד לחתוך קרוב ככל האפשר לצומת המיוטנדיני.
2. החזק את הקצה המיוטנדיני הקטוע של הגיד בעזרת מלקחיים והשתמש במספריים הקפיציים כדי לחתוך את הגיד קרוב ככל האפשר לעצם.
   הערה: במידת הצורך, השתמש במלקחיים כדי לעזור להרחיק את גיד אכילס משאר הגפה האחורית במהלך החתך הראשון. הקפד לא לרסק או לפגוע ברקמה, מכיוון שזה ישפיע על יישור הקולגן במהלך ההדמיה.
3. כדי לחלחל ולקבל כתם נגד גרעיני, טבלו את הגיד המנותח ב-PBT (1% Triton-X ב-PBS) עם 0.1% Draq5 (ריכוז מלאי, 5 מ"מ, ראה טבלת חומרים). הנח את הגיד בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל, והוסף 1 uL של Draq5 ל-1 מ"ל PBT. דגירה למשך הלילה ב-RT על נדנדה. מכיוון ש-Draq5 רגיש לאור, כסו את צינורות המיקרו-צנטריפוגה בנייר אלומיניום והגנו על הדגימות מפני אור.
4. לפני ההדמיה, הסר את תמיסת Draq5 והחלף אותה ב-dPBS. הקפד להמשיך להגן על הדגימה מפני אור.
   זהירות: ל-Draq5 יש רעילות בקטגוריה שלוש והוא נחשב למסוכן על פי תקן OSHA Hazard Communication Standard. הימנע ממגע והשליך אותו למיכל פסולת מסומן.
5. בעזרת כלי ניקוב ביופסיה בקוטר פנימי של 6 מ"מ, חותכים חתיכת קצף ג'ל (ראו טבלת חומרים) ומניחים אותה בצלחת פטרי קטנה בגודל 60X15 מ"מ. הוסיפו ddH₂O לתבשיל כדי לאפשר לקצף הג'ל להתרחב.
6. מניחים את גיד אכילס המנותח על קצף ג'ל. בעזרת כיסוי המודבק למכונת כביסה, הניחו בזהירות את מכונת הכביסה מעל הגיד עד שהכיסוי יוצר מגע עם הרקמה. כדי למנוע בעיות בעת הדמיה, ודא שאין בועות אוויר בין הדגימה לכיסוי. במידת הצורך, הוסף עוד ddH₂O לכלי כדי לכסות את הדגימה ואת מכונת הכביסה עם הכיסוי.

3. הדמיה במיקרוסקופ מולטיפוטון

1. באמצעות מיקרוסקופ לייזר רב-פוטוני FVMPE-RS, אובייקט פי 25 שניתן לטבול במים, לייזר פועם HPDS-O IR ולייזר פועם IR (ראה טבלת חומרים), אתר את הדגימה ואזור העניין שיצולמו באמצעות נתיב האור של EPI. לאחר איתור הדגימה, כוון את המצלמה על הקצה המיוטנדיני או האנתזאלי של גיד אכילס.
2. העבר את נתיב האור ל-LSH, כוונן את הגדרת לייזר ה-IR של לייזר 2 ל-840 ננומטר ויישר באופן פעיל. התאם את עוצמת ה-HV כדי שתוכל לראות את הרקמה ואת אות ה-SHG, מבלי לחרוג מ-20%. אל תתאים את הרווח ותשמור על ההיסט שווה ל-0.
3. לאחר מכן, הגדר את הפרמטרים של z-stack כדי לרכוש את התמונות לדוגמה. השתמש בגודל סריקה של 1024 x 1024 והגדר את גודל המדרגה ל-0.4 מיקרון. ערימות Z הן, בממוצע בסביבות 150 פרוסות, והן מתחילות מהמעטפת החיצונית ונעות לכיוון מרכז הגיד עד שאות ה-SHG כבר לא ברור, ומייצרות קטעים אופטיים סגיטליים¹³.
4. כוונן את עוצמת הלייזר למצב Bright Z כדי לאפשר סטנדרטיזציה של זיהוי אותות. לאחר קביעת פרמטרי ההתחלה/עצירה של Z-stack, הגדר את עוצמת הלייזר מ-4 בתחילת ההדמיה ו-6 בסוף ההדמיה. זה עוזר לשמור על עקביות באיתות SHG כאשר הסקופ מצלם עמוק יותר לתוך הרקמה.
5. לאחר יצירת ערימות ה-z, עבד אותן עוד יותר ב-ImageJ/FIJI כדי ליצור סרט של מקטעים אופטיים בכיוון רוחבי. לשם כך, פתח את תוכנת ImageJ/FIJI¹⁴ ולחץ על Image > Stacks > Reslice. זה יאפשר לנו לקבל מבט רוחבי על גיד אכילס, ולחשוף את המורפולוגיה הכוכבית של הטנוציטים ואת אוריינטציה שלהם במטריצת הקולגן.

פרוטוקול זה שימושי לאפיון תאי גיד והמטריצה החוץ-תאית שלהם (ECM) לאחר פציעה, במהלך ההתפתחות או במצב מוטנטי. עם חיתוך והכנה קפדנית של הדגימה, ניתן ליצור סרטוני z-stack דרך הרקמה בכיוון סגיטלי (וידאו 1 ווידאו 2). על ידי שימוש ב-ImageJ/FIJI כדי לעבד ולפרוס מחדש את התמונו?...

מאמר זה מציג שיטה להכנה, ניתוח והדמיה של גיד אכילס של העכבר, תוך שימוש בתכונות הגבישיות הלא-צנטרו-סימטריות של ה-ECM של הגיד. השלבים העיקריים בהכנת רקמות כוללים חדירה לכתמים נגדיים והבטחת מיקום נכון של רקמות בצלחת פטרי במהלך ההדמיה. במקום Draq5, ניתן להשתמש ב-Hoechst 33258 בדילול של 1...

למחברים אין מה לחשוף.

המחברים מודים לג'נה גאלוויי ולחברי מעבדת גאלוויי על תמיכתם ועידודם בפיתוח ובפתרון בעיות של פרוטוקולים אלה.