用于肌腱研究的双光子显微镜

本文概述了使用多光子显微镜制备、设置和成像肌腱的过程。此外，它还涵盖了 SHG 在分析胶原纤维排列和创建肌腱 3D 表示中的应用。该方法被证明在表征损伤和发育过程中的肌腱细胞及其 ECM 方面非常有价值。

双光子显微镜已成为评估深层组织细胞和表征各种生物系统中细胞外基质 （ECM） 排列的有力工具。该技术依靠非线性光-物质相互作用来检测两个不同的信号：二次谐波产生 （SHG） 扩散信号，有助于胶原纤维及其取向的可视化，以及用于成像紫外线激发自荧光的近红外激发信号。

由于 Fibrillar 胶原蛋白 I 的非中心对称晶体结构，SHG 成像被证明在可视化胶原纤维方面特别有效。鉴于肌腱是富含基质的组织，细胞数量有限，其高胶原蛋白含量使其成为使用双光子显微镜进行分析的理想选择。因此，双光子显微镜为分析和表征肌腱中的胶原蛋白异常提供了一种有价值的方法。其应用扩展到研究肌腱发育、损伤、愈合和衰老，能够使用双光子显微镜工具全面表征各种条件下的肌腱细胞及其与 ECM 的相互作用。该协议概述了双光子显微镜在肌腱生物学中的使用，并提出了一种适应性方法，以实现发育过程中和损伤后肌腱细胞的有效成像和表征。该方法允许利用薄的微观切片来创建肌腱内 ECM 以及与该基质相互作用的细胞的全面图像。最值得注意的是，这篇文章展示了一种在动物模型中使用双光子显微镜生成 3D 图像的技术。

为了正常运作并将力从肌肉传递到骨骼¹，肌腱依赖于胶原纤维之间的分子间和分子内键。胶原纤维错综复杂的自组装、交联和排列导致建立高度组织化的基质，有助于肌腱组织的生物力学强度和柔韧性 ^2,3,4。尽管其他 ECM 蛋白也有助于肌腱纤维网络的稳定性⁵，但肌腱干质量约为 86% 的胶原蛋白⁶，其中胶原蛋白 I 占总胶原蛋白含量的 96% ^7,8。这最终使胶原蛋白结构成为正常肌腱健康和功能的关键输出。

一些用于肌腱的临床影像学检查是 MRI 和/或超声。虽然超声技术提供了肌腱束状结构的图像并揭示了组织中的一些纤维状结构⁹，但分辨率对于量化来说并不理想。MRI 比超声成像具有更好的空间分辨率，但仍然有限。然而，这些方法在通过组织的潜在成像深度方面也受到限制。在更微观的尺度上，小角和广角光散射和共聚焦显微镜可用于评估胶原纤维的结构和任何潜在的异常。

相比之下，二次谐波产生 （SHG） 显微镜与其他成像方法不同，因为它可以捕获胶原纤维的外壳。肌腱中的胶原蛋白 I 原纤维通过肌腱 ECM 以单轴平行方式组织，本质上是非中心对称的 ^4,10。这些特性可用于使用多光子显微镜进行成像，多光子显微镜可以产生比共聚焦成像 2-3 倍深的清晰图像¹¹。这也使我们能够生成质量更好的肌腱光学切片。当光投射到目标样品中时，会产生 SHG 信号，并且可以捕获这种光散射。在肌腱中，这会产生胶原结构和排列的图像，从而使我们能够评估肌腱病、损伤等的潜在形态学和病理学后果。

由于胶原蛋白构成了肌腱干质量的大部分并有助于肌腱功能 ^6,12，^因此胶原蛋白结构的破坏会影响肌腱的生物力学特性。因此，分析其结构可以帮助我们更好地了解损伤的影响和严重程度，并创建愈合效果的指标。本文综述了一种使用多光子和 SHG 显微镜分析发育和损伤如何影响胶原蛋白 I 原纤维的结构和排列，并在动物模型中生成肌腱 ECM 的 3D 图像的方法。因此，我们对肌腱进行成像的方法可能有助于研究人员在发育过程中或受伤后表征肌腱细胞和 ECM。

所有动物实验均按照马萨诸塞州总医院的机构动物护理和使用委员会 （IACUC）（协议 #2013N0000062）和 AAALAC 指南进行。本研究使用 BHLHE40 Scx-GFP 背景下的 30 日龄无效敲除或杂合雌性小鼠。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 组织制备和固定

1. 为了准备组织，在 CO₂ 室中对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案），然后进行颈椎脱位。
2. 为了帮助减少可能粘附在组织样本上的皮毛数量，请用 70% 乙醇喷洒小鼠，直到皮毛饱和。给后肢剥皮，然后用剪刀在髋关节处剪开，去除两个后肢。
3. 将两个后肢放入 20 mL 闪烁小瓶中，并将它们浸入 4% PFA 中，使小瓶装满。将小瓶置于 4 °C 搅拌过夜。
4. 在室温 （RT） 下用 1x PBS 搅拌洗涤后肢 10 分钟，然后重复总共 3 次。将后肢浸入 4 °C 的 0.5 M EDTA （pH 8.0） 中搅拌长达 2 周，每 2-3 天更换一次新鲜的 EDTA。
5. 在 RT 下用 1x PBS 洗涤后肢，搅拌 10 分钟，重复洗涤总共 3 次。
6. 将肢体浸入新鲜的 1x PBS 中并储存在 4 °C 直至用于成像。

2. 解剖肌腱并准备成像组织

1. 用镊子握住脚，将弹簧剪刀刀片的一端（见 材料表）滑到跟腱下方，并确保尽可能靠近肌腱交界处切割。
2. 用镊子握住肌腱切断的肌腱端，用弹簧剪刀尽可能靠近骨骼剪掉肌腱。
   注意：如果需要，在第一次切割期间，使用镊子帮助将跟腱与后肢的其余部分保持距离。确保不要挤压或损坏组织，因为它会影响成像过程中的胶原蛋白排列。
3. 为了透化并获得核复染剂，将解剖的肌腱浸入含有 0.1% Draq5（原液浓度，5 mM，参见 材料表）的 PBT（PBS 中的 1% Triton-X）中。将肌腱放入 2 mL 微量离心管中，并将 1 μL Draq5 添加到 1 mL PBT 中。在 RT 上在摇杆上孵育过夜。由于 Draq5 对光敏感，因此请用铝箔覆盖微量离心管并保护样品避光。
4. 成像前，去除 Draq5 溶液并用 dPBS 替换。确保继续保护样品避光。
   注意：Draq5 具有 3 类毒性，OSHA 危险通报标准认为是危险的。避免接触并将其丢弃在贴有标签的废物容器中。
5. 使用内径为 6 mm 的活检打孔工具，切出一块凝胶泡沫（参见 材料表）并将其放入 60 x 15 mm 的小培养皿中。在培养皿中加入 ddH₂O，使凝胶泡沫膨胀。
6. 将解剖的跟腱放在凝胶泡沫上。使用粘在垫圈上的盖玻片，小心地将垫圈放在肌腱上，直到盖玻片与组织接触。为避免成像时出现问题，请确保样品和盖玻片之间没有气泡。如果需要，在培养皿中加入更多的 ddH₂O，以覆盖样品和用盖玻片清洗机。

3. 使用多光子显微镜成像

1. 使用 FVMPE-RS 多光子激光显微镜、可浸入水中的25倍物镜、HPDS-O IR脉冲激光器和IR脉冲激光器（参见 材料表），定位将使用 EPI 光路成像的样品和感兴趣区域。找到样本后，将相机对准跟腱的肌腱端或内端。
2. 将光路切换到 LSH，将 Laser 2 的 IR Laser 设置调整为 840 nm，然后主动对准。调整 HV 强度，以便能够看到组织和 SHG 信号，不超过 20%。不要调整增益并保持偏移等于 0。
3. 然后，配置 z 堆栈参数以获取示例图像。使用 1024 x 1024 扫描大小，并将步长设置为 0.4 微米。Z 堆栈平均约为 150 个切片，它们从外鞘开始向肌腱中心移动，直到 SHG 信号不再清晰，产生矢状光学切片¹³。
4. 将激光功率调整为 Bright Z 模式，以实现信号检测标准化。建立 Z 堆栈开始/停止参数后，将激光强度设置为成像开始时的 4 和成像结束时的 6。这有助于在示波器成像深入组织时保持 SHG 信号转导的一致性。
5. 生成 z 堆栈后，在 ImageJ/FIJI 中进一步处理它们，以创建横向光学切片的电影。为此，请打开 ImageJ/FIJI 软件¹⁴ 并单击 Image > Stacks > 重新切片.这将使我们能够获得跟腱的横向视图，揭示肌腱细胞的星状形态及其在胶原蛋白基质中的方向。

该方案可用于表征损伤后、发育过程中或突变条件下的肌腱细胞及其细胞外基质 （ECM）。通过仔细解剖和制备样品，可以通过组织以矢状方向生成 z 堆栈视频（视频 1 和 视频 2）。通过使用 ImageJ/FIJI 处理和重新切片图像，可以创建跟腱的横向视图（视频 3 和 视频 4）。这揭示了肌腱细胞的星状形态，并使我们能够观察?...

本文介绍了一种利用肌腱 ECM 的非中心对称结晶特性制备、解剖和成像小鼠跟腱的方法。组织制备的关键步骤包括复染的透化，以及确保在成像过程中将组织正确放置在培养皿中。Hoechst 33258 可以以 1：100,000 的稀释度代替 Draq5¹³，但 Draq5 因其高渗透性、光稳定性和最小的光漂白而更受欢迎。正确的组织放置对于避免盖玻片和肌腱之间出现气泡至关重要，?...

作者没有什么可披露的。

作者感谢 Jenna Galloway 和 Galloway 实验室的成员对这些协议的开发和故障排除的支持和鼓励。