Saggi non radioattivi in vitro della catena leggera della miosina cardiaca

Questo studio descrive i protocolli per metodi non radiometrici, un saggio di rilevamento ADP bioluminescente e una SDS-PAGE di affinità per il fosfato, per determinare l'attività chinasica della chinasi della catena leggera della miosina cardiaca (cMLCK) e il livello di fosforilazione del suo substrato, la catena leggera regolatoria della miosina (MLC2v).

La chinasi della catena leggera regolatoria della miosina cardioscopica (cMLCK) regola la struttura e la contrattilità del sarcomero cardiaco fosforilando l'isoforma ventricolare della catena leggera regolatoria della miosina (MLC2v). I livelli di fosforilazione di MLC2v sono significativamente ridotti nei cuori in insufficienza cardiaca, indicando l'importanza clinica di valutare l'attività di cMLCK e il livello di fosforilazione di MLC2v per chiarire la patogenesi dell'insufficienza cardiaca. Questo articolo descrive metodi non radioattivi per valutare sia l'attività dei livelli di fosforilazione di cMLCK che di MLC2v. Le reazioni chinasiche in vitro vengono eseguite utilizzando cMLCK ricombinante con calmodulina ricombinante e MLC2v in presenza di ATP e calcio a 25 °C, che sono seguite da un saggio di rilevamento di ADP bioluminescente o da una SDS-PAGE di affinità per il fosfato. Nello studio rappresentativo, il test di rilevamento dell'ADP bioluminescente ha mostrato un rigoroso aumento lineare del segnale a concentrazioni di cMLCK comprese tra 1,25 nM e 25 nM. SDS-PAGE ha anche mostrato un aumento lineare di MLC2v fosforilata nello stesso intervallo di concentrazione di cMLCK. Successivamente, è stata esaminata la dipendenza dal tempo delle reazioni alla concentrazione di 5 nM cMLCK. Un test di rilevamento ADP bioluminescente ha mostrato un aumento lineare del segnale durante i 90 minuti della reazione. Allo stesso modo, SDS-PAGE ha mostrato un aumento dipendente dal tempo di MLC2v fosforilata. I parametri biochimici di cMLCK per MLC2v sono stati determinati mediante un grafico di Michaelis-Menten utilizzando il saggio di rilevamento ADP bioluminescente. Il V_max era 1,65 ± 0,10 mol/min/mol chinasi e il K_m medio era di circa 0,5 μM USA a 25 °C. Successivamente, sono stati misurati l'attività del cMLCK mutante p.Pro639Valfs*15 associato alla cardiomiopatia dilatativa. Il saggio di rilevamento dell'ADP bioluminescente e l'SDS-PAGE di affinità per il fosfato hanno rilevato correttamente difetti rispettivamente nell'attività di cMLCK e nella fosforilazione di MLC2v. In conclusione, una combinazione del saggio di rilevazione dell'ADP bioluminescente e dell'SDS-PAGE di affinità per il fosfato è un metodo semplice, accurato, sicuro, economico e flessibile per misurare l'attività di cMLCK e il livello di fosforilazione di MLC2v.

La chinasi della catena leggera regolatoria della miosina cardiaca specifica (cMLCK) codificata dal gene MYLK3 è la chinasi principalmente responsabile del mantenimento della fosforilazione della catena leggera 2 regolatoria della miosina ventricolare cardiaca (MLC2v)^1,2. Fosforilando MLC2v a Ser-15, cMLCK promuove l'organizzazione del sarcomero¹ e potenzia la contrattilità cardiaca ^2,3 come risultato dell'aumento della formazione di ponti trasversali e quindi di un aumento della rigidità del braccio di leva della miosina II⁴. Difetti nell'attività di cMLCK o livelli ridotti di fosforilazione di MLC2v contribuiscono allo sviluppo di insufficienza cardiaca in modelli animali ^3,5,6. Pertanto, l'attività di cMLCK svolge un ruolo critico nella contrattilità cardiaca sia in condizioni fisiologiche che patologiche, regolando il livello di fosforilazione di MLC2v.

La cardiomiopatia dilatativa (DCM) è caratterizzata da disfunzione sistolica e da un aumento delle dimensioni della camera ventricolare sinistra ed è una delle principali cause di insufficienza cardiaca congestizia e trapianti di cuore. Finora sono stati identificati più di 40 geni come mutazioni che causano il DCM⁷. Recentemente, è stata identificata una nuova mutazione MYLK3 associata a DCM (p.Pro639Valfs*15) che abolisce completamente l'attività chinasica a causa del troncamento della proteina cMLCK nella porzione centrale del suo dominio catalitico⁸. Sono stati riportati anche due casi di mutazioni familiari associate a DCM in MYLK3 che mostrano un'attività depressa o abolita di cMLCK⁹. Pertanto, l'attività depressa o abolita di cMLCK nella DCM familiare può contribuire allo sviluppo della malattia diminuendo i livelli di fosforilazione di MLC2v. I livelli di fosforilazione di MLC2v sono anche significativamente ridotti nei cuori umani con insufficienza anche senza mutazioni in MYLK3 ^10,11. Pertanto, la riduzione dei livelli di fosforilazione di MLC2v sembra essere comune nell'insufficienza cardiaca umana, indicando che la valutazione dell'attività di cMLCK e dei livelli di fosforilazione di MLC2v è clinicamente importante. È necessario spiegare come i ridotti livelli di fosforilazione di MLC2v contribuiscano alla depressione della contrattilità cardiaca. Di conseguenza, i saggi che misurano l'attività di cMLCK e i livelli di fosforilazione di MLC2v sono estremamente importanti per chiarire la patogenesi dell'insufficienza cardiaca.

Il metodo classico per misurare l'attività di cMLCK è un test radiometrico che quantifica l'incorporazione di [^γ-32P] dall'ATP marcato radioattivamente in MLC2v². Tuttavia, a causa della sua natura pericolosa, richiede particolari considerazioni sulla sicurezza e sull'ambiente e il costo dello smaltimento dei rifiuti è elevato. Inoltre, la breve emivita di³² Pres limita la flessibilità del test radiometrico. Per ovviare a questi inconvenienti, sono state sviluppate tecniche alternative di dosaggio delle protein chinasi non radiometriche¹². Il test di rilevamento dell'ADP bioluminescente sviluppato da Promega Corporation misura l'ADP generato dalla reazione della proteina chinasi senza l'uso di radioisotopi¹³. Mostra risultati paragonabili al test radiometrico per protein chinasi con livelli variabili di attivit๳. Poiché il test di rilevamento dell'ADP bioluminescente misura l'ADP prodotto da una reazione chinasica, è stato utilizzato SDS-PAGE di affinità per il fosfato in parallelo con il test di rilevamento dell'ADP bioluminescente per verificare se MLC2v è effettivamente fosforilato. SDS-PAGE è una tecnica di elettroforesi di affinità fosfato in grado di rilevare cambiamenti nella mobilità delle proteine del substrato fosforilato rispetto alle loro controparti non fosforilate¹⁴.

Questo articolo descrive i protocolli per misurare l'attività di cMLCK e il livello di fosforilazione del suo substrato, MLC2v, utilizzando metodi non radioattivi. Dopo aver eseguito una reazione chinasica in vitro, per calcolare rispettivamente i valori biochimici di MLCK e il livello di fosforilazione di MCL2v, vengono utilizzati sia il saggio di rilevamento dell'ADP bioluminescente che il SDS-PAGE di affinità per fosfato. Nel complesso, un protocollo che combini i due saggi di chinasi non radioattive è prezioso per lo studio delle chinasi.

1. Clonaggio e purificazione di cMLCK ricombinante wild type e mutante DCM-associato

1. Clonaggio della chinasi della catena leggera della miosina cardiaca ricombinante in plasmide
   1. Progettare una sequenza nucleotidica continua per rappresentare il plasmide finale.
   2. Amplificare un frammento di DNA codificante MYLK3 umano (NM_1829493.3) utilizzando un metodo PCR standard. Le sequenze di primer sono le seguenti:
      Innesco in avanti: 5'- CACCATGTCAGGAACCTCCAAGGAGAGTCTGGGG -3'
      Innesco inverso: 5'- TTAGGGAGAAGTTGGAAATTTCCTTAACCT -3'
      La temperatura di fusione è di 60 °C.
      NOTA: La sequenza di sporgenza a filamento singolo (CACC) è necessaria per legare al vettore di clonaggio TOPO.
   3. Introdurre un costrutto mutante associato a DCM mediante mutagenesi derivata da primer. Le sequenze di primer sono le seguenti:
      Innesco in avanti: 5'- GTACAAGCCTCGAGAGAAGCTGAAGGTGAAC -3'
      Innesco inverso: 5'- CTTGAGGTCCAGGTGCAGGATGTAGTGCTGGT -3'
      La temperatura di fusione è di 60 °C.
   4. Eseguire un gel di agarosio allo 0,8% a 135 V per 20 minuti e ritagliare le bande corrispondenti ai prodotti PCR. Quindi estrarre e purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di estrazione del gel (vedi Materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
   5. Eseguire una reazione di clonaggio TOPO seguendo le istruzioni del produttore (vedere Materiali) e trasformare l'Escherichia coli (pENTR/cMLCK WT, vettore mutante).
   6. Confermare la sequenza corretta mediante PCR utilizzando i seguenti primer universali M13. Le sequenze di primer sono le seguenti:
      Innesco in avanti: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Innesco inverso: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   7. Incorporare un tag FLAG nel vettore pENTR/cMLCK ed eseguire una reazione di ricombinazione LR tra MYLK3 e un vettore di destinazione GateWay (ad esempio, pEF-DEST51) seguendo le istruzioni del produttore (pEF-DEST51/FLAG-cMLCK WT, mutante).
2. Coltura cellulare e trasfezione in cellule HEK293T
   1. Seminare una piastra da 100 mm con cellule 7,5 x 10^{a 6} HEK293T e coltivare con DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina. Incubare a 37 °C in CO₂ al 5% per 24 ore.
   2. Preparare la miscela di reagente/DNA Lipofection per la trasfezione in cellule HEK293T mescolando 10 μg di DNA plasmidico in 500 μL di MEM (vedere la Tabella dei materiali). Allo stesso tempo, preparare la miscela aggiungendo 20 μL di Lipofectamine 2000 in 500 μL di MEM.
   3. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT), quindi miscelare la soluzione di lipofectamina-DNA.
   4. Incubare per 20 minuti a RT, quindi aggiungere 1 mL della soluzione di Lipofectamina-DNA al piatto da 100 mm.
      NOTA: Per evitare il distacco delle cellule, aggiungere delicatamente la miscela di lipofezione.
   5. Incubare le cellule trasfettate per un massimo di 48 ore a 37 °C con il 5% di CO₂.
3. Purificazione della proteina cMLCK ricombinante
   1. Mettere le cellule trasfettate sul ghiaccio e lavare 3 volte con 5 ml di PBS.
   2. Preparare il tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1% NP40, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA e cocktail di inibitori della proteasi, pH = 7,5) e conservare in ghiaccio.
      NOTA: Aggiungere il cocktail di inibitori della proteasi appena prima del test.
   3. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi alle cellule, utilizzare un raschietto per raccogliere le cellule in una provetta da 1,5 mL e incubare su ghiaccio per 5 minuti.
   4. Centrifugare a 20.000 x g per 5 min a 4 °C.
   5. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL e incubare con 5 μL di agarosio FLAG-M2 per 1 ora a 4 °C.
   6. Centrifugare a 1.000 x g per 1 minuto a 4 °C, quindi rimuovere il surnatante e lavare in agarosio FLAG-M2 3 volte utilizzando un tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1% NP40, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA e cocktail di inibitori della proteasi, pH = 7,5).
   7. Eluire le proteine leganti con il tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1% NP40, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA e cocktail di inibitori della proteasi, pH = 7,5) a 4 °C per 30 minuti.
   8. Centrifugare a 1.000 x g a 4 °C per 3 minuti e utilizzare il surnatante come proteine ricombinanti marcate con FLAG.

2. Clonaggio e purificazione della calmodulina ricombinante

1. Clonaggio della calmodulina ricombinante nel plasmide
   1. Progettare una sequenza nucleotidica continua per rappresentare il plasmide finale.
   2. Amplificare un frammento di DNA codificante la calmodulina umana (CALM1) (NM_006888) utilizzando un metodo PCR standard. Le sequenze di primer sono le seguenti:
      Innesco in avanti: 5'- CACCATGGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATT -3'
      Innesco inverso: 5'- TCATTTTGCAGTCATCATCTGTACGAATTC -3'.
      La temperatura di fusione è di 60 °C.
      NOTA: Le sequenze di sporgenza a filamento singolo (CACC) sono necessarie per legare al vettore di clonaggio TOPO.
   3. Eseguire un gel di agarosio allo 0,8% a 135 V per 20 minuti e tagliare le bande corrispondenti ai prodotti PCR dal gel. Quindi estrarre e purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di estrazione del gel (vedi Materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
   4. Eseguire la reazione di clonaggio TOPO seguendo le istruzioni del produttore (vedi Materiali) e trasformarla in E. coli (pENTR/Calmodulina).
   5. Confermare la sequenza corretta mediante PCR utilizzando i seguenti primer universali M13. I primer sequenziati sono i seguenti:
      Innesco in avanti: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Innesco inverso: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   6. Eseguire la reazione di ricombinazione LR tra la calmodulina e un vettore di destinazione GateWay (pEF-DEST17) seguendo le istruzioni del produttore.
   7. Trasformare in BL21 (DE3) E. coli chimicamente competente.
2. Coltura cellulare e induzione dell'espressione
   1. Inoculare 5 mL di terreno LB contenente 100 μg/mL di ampicillina con una colonia di E. coli trasformato e agitare per una notte a 37 °C.
   2. Trasferire in 200 mL di terreno LB contenente 100 μg/mL di ampicillina e incubare a 37 °C fino a quando la densità ottica di coltura (600 nm) raggiunge 0,5.
   3. Aggiungere arabinosio a una concentrazione finale dello 0,2% e fermentare per 3 ore a 37 °C.
   4. Centrifugare a 5.000 x g a 4 °C per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
   5. Sospendere in 10 mL di BugBuster Master Mix contenente un cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA e ruotare a RT per 20 minuti.
   6. Centrifugare a 16.000 x g a 4 °C per 10 min.
   7. Il surnatante risultante contenente la proteina calmodulina marcata con His-terminus è stato caricato su una colonna di TALON Affinity Resin bilanciata con tampone legante per cromatografia ionica metallica immobilizzata.
   8. Eluire la proteina calmodulina legata marcata con His-tagging con tampone di eluizione (50 mM di fosfato di sodio [pH = 8,0], 0,3 M di NaCl, 0,1% di CHAPS e 0,15 M di imidazolo), quindi ripiegare e concentrare mediante centrifugazione a 5.000 x g a 4 °C utilizzando un filtro centrifugo.
   9. La concentrazione proteica è stata regolata a 10 μM e la soluzione è stata mantenuta a -80 °C fino all'uso.

3. Saggio in vitro della chinasi

NOTA: Tutti i passaggi vengono eseguiti su ghiaccio per evitare che la reazione chinasica proceda. Inoltre, le soluzioni MLCK e substrato vengono miscelate separatamente per evitare una reazione eccessivamente rapida.

1. Prepara le seguenti soluzioni e conserva in ghiaccio:
   10x tampone chinasi (200 mM HEPES, 10 mM CaCl₂, 50 mM MgCl₂, 0,1% Tween 20, pH = 7,5)
   100 mM DTT
   10 mM ATP
   500 nM di calmodulina
   100 nM cMLCK con etichetta FLAG
   MLC2v con tag His2v da 24 μM
   NOTA: Le proteine ricombinanti vengono diluite utilizzando 1x tampone chinasi secondo le concentrazioni indicate.
2. Preparare 100 μl della soluzione master cMLCK su ghiaccio in provette da 1,5 mL utilizzando i seguenti ingredienti:
   10 μL di tampone chinasi 10x
   20 μL di cMLCK da 100 nM
   20 μL di calmodulina da 5 μM
   8 μL di 100 mM DTT
   42 μL di H₂O
   NOTA: Ogni campione viene diluito con 10x tampone chinasi e acqua distillata e mantenuto in ghiaccio.
3. Preparare 30 μl di soluzione di substrato nella provetta PCR a 8 strisce su ghiaccio a ciascuna concentrazione di MLC2v, come descritto nella Tabella 1. Le concentrazioni finali di MLC2v sono 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 e 12 μM.
   NOTA: MLC2v ricombinante marcato con His viene diluito con tampone chinasi 10x e acqua distillata. Il volume della soluzione di substrato viene regolato a 30 μl aggiungendo acqua per ottenere la concentrazione MLC2v appropriata.
4. Aggiungere 10 μl della soluzione master MLCK per ottenere un volume della soluzione di reazione finale di 40 μl. La concentrazione finale di ciascun componente nella reazione chinasica è 20 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,01% Tween 20, 2 mM DTT, 150 μM ATP, 5 nM cMLCK, 250 nM calmodulina e 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 o 12 μM MLC2v (pH = 7,5).
5. Mescolare bene e centrifugare.
6. Incubare i campioni di reazione a 25 °C per il tempo indicato.
7. Dopo l'incubazione, misurare l'attività chinasica mediante SDS-PAGE di affinità per il fosfato o saggio di rilevamento ADP bioluminescente.

4. SDS-PAGE di affinità per il fosfato

NOTA: La SDS-PAGE di affinità per i fosfati è stata eseguita secondo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).

1. Versare il gel per l'affinità al fosfato SDS-PAGE.
   1. Miscelare le soluzioni di gel impilabili come segue: 12% in peso/vol di acrilammide, 0,1% in peso/vol di SDS, 125 mM di Tris-HCl (pH = 6,8), 0,1% in peso/vol di persolfato di ammonio e 0,5% in volume/vol di N, N, N', N'-tetrametiletilendiammina.
   2. Miscelare le soluzioni in gel risolutivo come segue: 12% in peso/vol di acrilammide, 30 μM di Phos-tag acrilammide, 60 μM di MnCl₂, 0,1% in peso/vol di SDS, 375 mM di Tris-HCl (pH = 8,8), 0,05% in peso/vol di persolfato di ammonio e 0,25% in volume/vol di N, N, N', N'-tetrametiletilendiammina.
2. Preparare il campione per l'elettroforesi.
   1. Aggiungere e mescolare 1 mM di MnCl₂ al campione dalla reazione chinasica in vitro.
3. Eseguire l'elettroforesi e il Western blotting.
   1. Far funzionare il gel a 150 V per 80 minuti nel tampone di corsa (0,1% in peso/vol SDS, 25 mM Tris e 192 mM di glicina).
   2. Dopo l'elettroforesi, immergere il gel nel tampone di trasferimento EDTA (+) (10 mM EDTA, 50 mM Tris, 380 mM glicina, 0,000375% in peso/vol SDS e 20% in peso/vol etanolo) per 10 minuti e quindi nel tampone di trasferimento per 10 minuti.
   3. Trasferire le proteine alla membrana in PVDF a 15 V per 30 minuti in tampone di trasferimento.
   4. Scuotere continuamente la membrana con latte scremato in polvere per 30 minuti in RT. Dopo il blocco, lavare la membrana 3 volte con TTBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,001% Tween).
   5. Immergere la membrana con l'anticorpo primario (anti-MLC2v, 1:4.000; Abcam ab92721) durante la notte a 4 °C.
   6. Lavare la membrana 3 volte con TTBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl e 0,001% Tween).
   7. Immergere la membrana con l'anticorpo secondario (capra accoppiata a HRP anti-coniglio 1:8.000; Cappel, #55696) per 1 ora a RT.
   8. Lavare la membrana 3 volte con TTBS.
4. Rileva e analizza le proteine sulla membrana.
   1. Aggiungere il reagente di rilevamento ECL (reagente di luminescenza chimica migliorata) alla membrana per 1 minuto a RT.
   2. Rilevare le proteine sulla membrana utilizzando un LAS-4000 al momento ottimale.
   3. Quantificare l'MLC2v fosforilato e non fosforilato, sottraendo la densitometria di fondo utilizzando il software ImageQuant TL.

5. Saggio di rilevamento dell'ADP bioluminescente

NOTA: Il test di rilevamento dell'ADP bioluminescente è stato eseguito secondo il protocollo del produttore.

1. Arrestare la reazione chinasica aggiungendo 40 μl di reagente di deplezione dell'ATP nella soluzione di reazione del saggio chinasi. Mescolare bene e incubare per 30 minuti a RT.
2. Aggiungere 80 μl di reagente di rilevamento ADP. Mescolare bene e incubare per 30 minuti a RT.
3. Misurare la luminescenza utilizzando un luminometro con un tempo di integrazione massimo suggerito di 0,5 s per pozzetto.
4. Converti l'intensità della luminescenza in concentrazione ADP utilizzando una curva di calibrazione.
5. Calcolare la quantità di fosfati utilizzata per la fosforilazione MLC2v.
   NOTA: L'ADP totale prodotto durante la reazione chinasica viene misurato come descritto sopra. L'ADP di fondo, inclusa l'autofosforilazione di cMLCK, viene misurata sulla base di una reazione senza MLC2v e la quantità di ADP utilizzata per la fosforilazione di MLC2v viene valutata sottraendo l'ADP di fondo dall'ADP totale.

6. Analisi dei dati

1. Adattare i dati all'equazione di Michalis-Menten utilizzando un software di analisi dei dati appropriato. I dati sono espressi come media ± deviazione standard.

Il metodo classico per misurare l'attività della chinasi è un test radiometrico che quantifica il fosfato radiomarcato incorporato nel substrato della chinasi. Per il metodo qui presentato, è stato sviluppato un saggio non radioattivo, in vitro della chinasi cMLCK (Figura 1A), MLC2v e calmodulina purificato (Figura 1B) e l'attività della chinasi è stata determinata utilizzando un saggio di rilevamento dell'ADP bioluminescen...

Il presente studio è stato intrapreso per valutare se la combinazione di metodi non radioattivi, il saggio di rilevamento dell'ADP bioluminescente e l'SDS-PAGE di affinità per il fosfato possa essere utilizzata con successo per determinare l'attività di cMLCK. È essenziale eseguire le reazioni chinasici alla temperatura e al tempo di reazione ottimali. L'aumento di uno di questi promuoverà rapidamente e fortemente la reazione enzimatica. Nel presente studio, la reazione chinasica in...

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato in parte sostenuto da JSPS KAKENHI Grant Number JP17K09578 e JP18H04050.