Ensayos de miosina cinasa de cadena ligera cardíaca in vitro no radiactiva

Este estudio describe los protocolos para métodos no radiométricos, un ensayo de detección de ADP bioluminiscente y un SDS-PAGE de afinidad por fosfato, para determinar la actividad quinasa de la quinasa de cadena ligera de miosina cardíaca (cMLCK) y el nivel de fosforilación de su sustrato, la cadena ligera reguladora de miosina (MLC2v).

La quinasa de cadena ligera reguladora de miosina específica del corazón (cMLCK) regula la estructura y la contractilidad del sarcómero cardíaco mediante la fosforilación de la isoforma ventricular de la cadena ligera reguladora de la miosina (MLC2v). Los niveles de fosforilación de MLC2v se reducen significativamente en los corazones indecisos, lo que indica la importancia clínica de evaluar la actividad de cMLCK y el nivel de fosforilación de MLC2v para dilucidar la patogénesis de la insuficiencia cardíaca. En este artículo se describen métodos no radiactivos para evaluar la actividad de los niveles de fosforilación de cMLCK y MLC2v. Las reacciones de quinasas in vitro se realizan utilizando cMLCK recombinante con calmodulina recombinante y MLC2v en presencia de ATP y calcio a 25 °C, seguidas de un ensayo de detección de ADP bioluminiscente o un SDS-PAGE de afinidad por fosfato. En el estudio representativo, el ensayo de detección de ADP bioluminiscente mostró un aumento lineal estricto de la señal a concentraciones de cMLCK entre 1,25 nM y 25 nM. La afinidad de fosfato SDS-PAGE también mostró un aumento lineal de MLC2v fosforilado en el mismo rango de concentración de cMLCK. A continuación, se examinó la dependencia temporal de las reacciones a la concentración de 5 nM cMLCK. Un ensayo de detección de ADP bioluminiscente mostró un aumento lineal de la señal durante los 90 minutos de la reacción. De manera similar, SDS-PAGE de afinidad con fosfato mostró un aumento dependiente del tiempo de MLC2v fosforilado. Los parámetros bioquímicos de cMLCK para MLC2v se determinaron mediante un diagrama de Michaelis-Menten utilizando el ensayo de detección de ADP bioluminiscente. El V_máx fue de 1,65 ± 0,10 mol/min/mol quinasa y el K_m medio fue de alrededor de 0,5 μM de EE.UU. a 25 °C. A continuación, se midió la actividad del tipo salvaje y del mutante cMLCK asociado a miocardiopatía dilatada. El ensayo de detección de ADP bioluminiscente y el SDS-PAGE de afinidad por fosfato detectaron correctamente defectos en la actividad de cMLCK y la fosforilación de MLC2v, respectivamente. En conclusión, una combinación del ensayo de detección de ADP bioluminiscente y el SDS-PAGE de afinidad de fosfato es un método simple, preciso, seguro, de bajo costo y flexible para medir la actividad de cMLCK y el nivel de fosforilación de MLC2v.

La quinasa de cadena ligera reguladora de miosina específica del corazón (cMLCK) codificada por el gen MYLK3 es la quinasa predominantemente responsable de mantener la fosforilación de la cadena ligera reguladora de miosina ventricular cardíaca 2 (MLC2v)^1,2. Al fosforilar MLC2v en Ser-15, cMLCK promueve la organización del sarcómero¹ y potencia la contractilidad cardíaca ^2,3 como resultado del aumento de la formación de puentes cruzados y, por lo tanto, un aumento en la rigidez del brazo de palanca de la miosina II⁴. Los defectos en la actividad de cMLCK o los niveles reducidos de fosforilación de MLC2v contribuyen al desarrollo de insuficiencia cardíaca en modelos animales ^3,5,6. Por lo tanto, la actividad de cMLCK desempeña un papel crítico en la contractilidad cardíaca tanto en condiciones fisiológicas como patológicas al regular el nivel de fosforilación de MLC2v.

La miocardiopatía dilatada (MCD) se caracteriza por disfunción sistólica y un tamaño agrandado de la cámara ventricular izquierda, y es una causa importante de insuficiencia cardíaca congestiva y trasplantes de corazón. Hasta el momento, se han identificado más de 40 genes como mutaciones causantes de DCM⁷. Recientemente, se identificó una nueva mutación MYLK3 asociada a DCM (p.Pro639Valfs*15) que suprime completamente la actividad de la quinasa debido al truncamiento de la proteína cMLCK en la porción media de su dominio catalítico⁸. También se han descrito dos casos de mutaciones familiares asociadas a DCM en MYLK3 que muestran una actividad deprimida o abolida de cMLCK⁹. Por lo tanto, la actividad deprimida o abolida de cMLCK en la MCD familiar puede contribuir al desarrollo de la enfermedad al disminuir los niveles de fosforilación de MLC2v. Los niveles de fosforilación de MLC2v también se reducen significativamente en los corazones humanos que fallan, incluso sin mutaciones en MYLK3 ^10,11. Por lo tanto, la reducción de los niveles de fosforilación de MLC2v parece ser común en la insuficiencia cardíaca humana, lo que indica que la evaluación de la actividad de cMLCK y los niveles de fosforilación de MLC2v es clínicamente importante. Es necesario explicar cómo los niveles reducidos de fosforilación de MLC2v contribuyen a la contractilidad cardíaca deprimida. En consecuencia, los ensayos que miden la actividad de cMLCK y los niveles de fosforilación de MLC2v son extremadamente importantes para dilucidar la patogénesis de la insuficiencia cardíaca.

El método clásico para medir la actividad de cMLCK es un ensayo radiométrico que cuantifica la incorporación de [^γ-32P] a partir de ATP marcado radiactivamente en MLC2v². Sin embargo, debido a su naturaleza peligrosa, requiere consideraciones especiales de seguridad y medio ambiente, y el costo de la eliminación de desechos es alto. Además, la corta vida media de³² restringe la flexibilidad del ensayo radiométrico. Para superar estos inconvenientes, se han desarrollado técnicas alternativas de ensayo de proteínas quinasas no radiométricas¹². El ensayo de detección de ADP bioluminiscente desarrollado por Promega Corporation mide el ADP generado por la reacción de la proteína quinasa sin utilizar radioisótopos¹³. Muestra resultados comparables al ensayo radiométrico para proteínas quinasas con diferentes niveles de actividad¹³. Debido a que el ensayo de detección de ADP bioluminiscente mide el ADP producido por una reacción de quinasa, se utilizó SDS-PAGE de afinidad por fosfato en paralelo con el ensayo de detección de ADP bioluminiscente para verificar si MLC2v está realmente fosforilado. La SDS-PAGE de afinidad por fosfato es una técnica de electroforesis de afinidad de fosfato que puede detectar cambios en la movilidad de las proteínas del sustrato fosforilado en comparación con sus contrapartes no fosforiladas¹⁴.

En este artículo se describen los protocolos para medir la actividad de cMLCK y el nivel de fosforilación de su sustrato, MLC2v, utilizando métodos no radiactivos. Después de realizar una reacción de quinasa in vitro, se emplean tanto el ensayo de detección de ADP bioluminiscente como el SDS-PAGE de afinidad de fosfato para calcular los valores bioquímicos de MLCK y el nivel de fosforilación de MCL2v, respectivamente. En general, un protocolo que combine los dos ensayos de quinasas no radiactivas es valioso para el estudio de las quinasas.

1. Clonación y purificación de cMLCK recombinante de tipo salvaje y mutante asociado a DCM

1. Clonación de quinasa de cadena ligera de miosina cardíaca recombinante en plásmido
   1. Diseñe una secuencia continua de nucleótidos para representar el plásmido final.
   2. Amplifique un fragmento de ADN que codifica MYLK3 humano (NM_1829493.3) utilizando un método de PCR estándar. Las secuencias de cebadores son las siguientes:
      Imprimación delantera: 5'- CACCATGTCAGGAACCTCCAAGGAGAGTCTGGGG -3'
      Imprimación inversa: 5'- TTAGGGAGAAGTTGGAAATTTCCTTAACCT -3'
      La temperatura de fusión es de 60 °C.
      NOTA: La secuencia de voladizo monocatenario (CACC) es necesaria para ligar al vector de clonación TOPO.
   3. Introducción de una construcción mutante asociada a DCM mediante mutagénesis derivada de cebadores. Las secuencias de cebadores son las siguientes:
      Cebador delantero: 5'- GTACAAGCCTCGAGAGAAGCTGAAGGTGAAC -3'
      Imprimación inversa: 5'- CTTGAGGTCCAGGTGCAGGATGTAGTGCTGGT -3'
      La temperatura de fusión es de 60 °C.
   4. Ejecute un gel de agarosa al 0,8% a 135 V durante 20 min y corte las bandas correspondientes a los productos de PCR. A continuación, extraiga y purifique los productos de PCR utilizando un kit de extracción en gel (ver Materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
   5. Realice una reacción de clonación de TOPO siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Materiales) y transforme Escherichia coli (pENTR/cMLCK WT, vector mutante).
   6. Confirme la secuencia correcta por PCR utilizando los siguientes cebadores M13 universales. Las secuencias de cebadores son las siguientes:
      Imprimación delantera: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Imprimación inversa: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   7. Incorpore una etiqueta FLAG en el vector pENTR/cMLCK y realice una reacción de recombinación LR entre MYLK3 y un vector de destino GateWay (es decir, pEF-DEST51) siguiendo las instrucciones del fabricante (pEF-DEST51/FLAG-cMLCK WT, mutante).
2. Cultivo celular y transfección en células HEK293T
   1. Siembre una placa de 100 mm con células de HEK293T de 7,5 x 10⁶ y cultive con DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar a 37 °C en 5% de CO₂ durante 24 h.
   2. Prepare el reactivo de lipofección/mezcla de ADN para su transfección en células HEK293T mezclando 10 μg de ADN plasmídico en 500 μL de MEM (consulte la tabla de materiales). Al mismo tiempo, prepare la mezcla agregando 20 μL de Lipofectamine 2000 en 500 μL de MEM.
   3. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT), luego mezclar la solución de lipofectamina-ADN.
   4. Incubar durante 20 min a RT, luego agregar 1 mL de la solución de Lipofectamine-DNA a la placa de 100 mm.
      NOTA: Para evitar que se desprendan las células, agregue la mezcla de lipofectión suavemente.
   5. Incubar las células transfectadas durante un máximo de 48 h a 37 °C con 5% de CO₂.
3. Purificación de la proteína cMLCK recombinante
   1. Coloque las células transfectadas en hielo y lávelas 3 veces con 5 mL de PBS.
   2. Prepare el tampón de lisis (50 mM de Tris-HCl, 0,15 M de NaCl, 1% de NP40, 0,5 mM de EDTA, 0,5 mM de EGTA y cóctel de inhibidores de proteasa, pH = 7,5) y manténgalo en hielo.
      NOTA: Agregue el cóctel de inhibidores de proteasa justo antes del ensayo.
   3. Agregue 1 mL de tampón de lisis a las células, use un raspador para recolectar células en un tubo de 1.5 mL e incube en hielo durante 5 min.
   4. Centrifugar a 20.000 x g durante 5 min a 4 °C.
   5. Recoja el sobrenadante en un nuevo tubo de 1,5 ml e incube con 5 μl de agarosa FLAG-M2 durante 1 h a 4 °C.
   6. Centrifugar a 1.000 x g durante 1 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y lavar con agarosa FLAG-M2 3 veces con tampón de lavado (50 mM de Tris-HCl, 0,15 M de NaCl, 1% de NP40, 0,5 mM de EDTA, 0,5 mM de EGTA y cóctel de inhibidores de la proteasa, pH = 7,5).
   7. Eluir las proteínas de unión con tampón de elución (50 mM de Tris-HCl, 0,15 M de NaCl, 1% de NP40, 0,5 mM de EDTA, 0,5 mM de EGTA y cóctel de inhibidores de la proteasa, pH = 7,5) a 4 °C durante 30 min.
   8. Centrifugar a 1.000 x g a 4 °C durante 3 min y utilizar el sobrenadante como proteínas recombinantes marcadas con FLAG.

2. Clonación y purificación de calmodulina recombinante

1. Clonación de calmodulina recombinante en el plásmido
   1. Diseñe una secuencia continua de nucleótidos para representar el plásmido final.
   2. Amplificar un fragmento de ADN que codifica calmodulina humana (CALM1) (NM_006888) utilizando un método de PCR estándar. Las secuencias de cebadores son las siguientes:
      Imprimación delantera: 5'- CACCATGGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATT -3'
      Imprimación inversa: 5'- TCATTTTGCAGTCATCATCTGTACGAATTC -3'.
      La temperatura de fusión es de 60 °C.
      NOTA: Las secuencias de voladizo monocatenario (CACC) son necesarias para ligar al vector de clonación TOPO.
   3. Ejecute un gel de agarosa al 0,8% a 135 V durante 20 minutos y corte las bandas correspondientes a los productos de PCR del gel. A continuación, extraiga y purifique los productos de PCR utilizando un kit de extracción en gel (ver Materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
   4. Realice la reacción de clonación TOPO siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Materiales) y transforme en E. coli (pENTR/Calmodulin).
   5. Confirme la secuencia correcta por PCR utilizando los siguientes cebadores M13 universales. Los cebadores secuenciados son los siguientes:
      Imprimación delantera: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Imprimación inversa: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   6. Realice la reacción de recombinación LR entre la calmodulina y un vector de destino GateWay (pEF-DEST17) siguiendo las instrucciones del fabricante.
   7. Se transforma en BL21 (DE3) E. coli químicamente competente.
2. Cultivo celular e inducción de expresión
   1. Inocular 5 mL de medio LB que contenga 100 μg/mL de ampicilina con una colonia de la E. coli transformada y agitar durante la noche a 37 °C.
   2. Transferir a 200 mL de medio LB que contenga 100 μg/mL de ampicilina e incubar a 37 °C hasta que la densidad óptica del cultivo (600 nm) alcance 0,5.
   3. Añadir arabinosa hasta una concentración final del 0,2% y cultivar durante 3 h a 37 °C.
   4. Centrifugar a 5.000 x g a 4 °C durante 10 min y retirar el sobrenadante.
   5. Suspender en 10 mL de BugBuster Master Mix que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA y girar a RT durante 20 min.
   6. Centrifugar a 16.000 x g a 4 °C durante 10 min.
   7. El sobrenadante resultante, que contenía la proteína calmodulina marcada con N-terminal His, se cargó en una columna de resina de afinidad TALON equilibrada con tampón de unión de cromatografía de iones metálicos inmovilizado.
   8. Eluir la proteína de calmodulina marcada con His unida con tampón de elución (50 mM de fosfato de sodio [pH = 8,0], 0,3 M de NaCl, 0,1% de CHAPS y 0,15 M de imidazol), luego replegar y concentrar por centrifugación a 5.000 x g a 4 °C utilizando un filtro centrífugo.
   9. La concentración de proteína se ajustó a 10 μM y la solución se mantuvo a -80 °C hasta su uso.

3. Ensayo de quinasa in vitro

NOTA: Todos los pasos se realizan en hielo para evitar que continúe la reacción de la quinasa. Además, las soluciones de MLCK y sustrato se mezclan por separado para evitar una reacción demasiado rápida.

1. Prepare las siguientes soluciones y manténgalas en hielo:
   Tampón quinasa 10x (200 mM HEPES, 10 mM CaCl₂, 50 mM MgCl₂, 0,1% Tween 20, pH = 7,5)
   TDT de 100 mM
   10 mM ATP
   Calmodulina de 500 nM
   cMLCK de 100 nM etiquetado con FLAG
   MLC2v marcado con His de 24 μM
   NOTA: Las proteínas recombinantes se diluyen utilizando tampón quinasa 1x de acuerdo con las concentraciones indicadas.
2. Prepare 100 μl de la solución maestra cMLCK en hielo en tubos de 1,5 mL utilizando los siguientes ingredientes:
   10 μL de tampón quinasa 10x
   20 μL de cMLCK de 100 nM
   20 μL de 5 μM de calmodulina
   8 μL de TDT de 100 mM
   42 μL de H₂O
   NOTA: Cada muestra se diluye con tampón quinasa 10x y agua destilada y se mantiene en hielo.
3. Prepare 30 μL de solución de sustrato en el tubo de PCR de 8 tiras en hielo a cada concentración de MLC2v como se describe en la Tabla 1. Las concentraciones finales de MLC2v son 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 y 12 μM.
   NOTA: El MLC2v recombinante marcado con His se diluye con tampón quinasa 10x y agua destilada. El volumen de solución de sustrato se ajusta a 30 μL añadiendo agua para obtener la concentración adecuada de MLC2v.
4. Agregue 10 μL de la solución maestra MLCK para lograr un volumen de solución de reacción final de 40 μL. La concentración final de cada componente en la reacción de la quinasa es 20 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,01% Tween 20, 2 mM DTT, 150 μM ATP, 5 nM cMLCK, 250 nM calmodulina y 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 o 12 μM MLC2v (pH = 7,5).
5. Mezclar bien y girar.
6. Incubar las muestras de reacción a 25 °C durante el tiempo indicado.
7. Después de la incubación, mida la actividad de la quinasa mediante SDS-PAGE de afinidad de fosfato o ensayo de detección de ADP bioluminiscente.

4. SDS-PAGE de afinidad de fosfato

NOTA: La SDS-PAGE de afinidad con fosfato se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Tabla de Materiales).

1. Vierta el gel para afinidad de fosfato SDS-PAGE.
   1. Mezcle las soluciones de gel de apilamiento de la siguiente manera: 12% en peso/vol de acrilamida, 0,1% en peso/vol SDS, 125 mM de Tris-HCl (pH = 6,8), 0,1% en peso/vol de persulfato de amonio y 0,5% vol/vol N, N', N'- tetrametiletilendiamina.
   2. Mezcle las soluciones de gel resolutivo de la siguiente manera: acrilamida al 12 % en peso/vol, 30 μM de acrilamida Phos-tag, 60 μM de MnCl₂, SDS al 0,1 % en peso/vol, 375 mM de Tris-HCl (pH = 8,8), persulfato de amonio al 0,05 % en peso/vol y 0,25 % vol/vol N, N, N', N'- tetrametiletilendiamina.
2. Preparar la muestra para la electroforesis.
   1. Añadir y mezclar 1 mM MnCl₂ a la muestra de la reacción de quinasa in vitro.
3. Realizar electroforesis y Western blot.
   1. Haga funcionar el gel a 150 V durante 80 minutos en tampón de funcionamiento (SDS de 0,1 % en peso/vol, 25 mM de Tris y 192 mM de glicina).
   2. Después de la electroforesis, remoje el gel en tampón de transferencia de EDTA (+) (10 mM de EDTA, 50 mM de Tris, 380 mM de glicina, 0,000375% en peso/vol de SDS y 20% en peso/vol de etanol) durante 10 minutos y luego en tampón de transferencia durante 10 minutos.
   3. Transfiera proteínas a la membrana de PVDF a 15 V durante 30 min en tampón de transferencia.
   4. Meca la membrana continuamente con leche en polvo descremada durante 30 min en RT. Después del bloqueo, lave la membrana 3 veces con TTBS (50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 0,001% Tween).
   5. Remojar la membrana con el anticuerpo primario (anti-MLC2v, 1:4.000; Abcam ab92721) durante la noche a 4 °C.
   6. Lave la membrana 3 veces con TTBS (50 mM de Tris, 150 mM de NaCl y 0,001% de Tween).
   7. Remojar la membrana con el anticuerpo secundario (anti-conejo de cabra acoplado a HRP 1:8.000; Cappel, #55696) durante 1 h en RT.
   8. Lave la membrana 3 veces con TTBS.
4. Detectar y analizar proteínas en la membrana.
   1. Agregue el reactivo de detección ECL (reactivo de luminiscencia Chemi mejorado) a la membrana durante 1 minuto en RT.
   2. Detecte las proteínas de la membrana utilizando un LAS-4000 en el momento óptimo.
   3. Cuantifique la MLC2v fosforilada y no fosforilada, restando la densitometría de fondo mediante el software ImageQuant TL.

5. Ensayo de detección de ADP bioluminiscente

NOTA: El ensayo de detección de ADP bioluminiscente se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante.

1. Detenga la reacción de quinasa añadiendo 40 μL de reactivo de depleción de ATP en la solución de reacción de ensayo de quinasa. Mezclar bien e incubar durante 30 min a RT.
2. Añadir 80 μL de reactivo de detección ADP. Mezclar bien e incubar durante 30 min a RT.
3. Mida la luminiscencia utilizando un luminómetro con un tiempo de integración máximo sugerido de 0,5 s por pocillo.
4. Convierta la intensidad de luminiscencia en concentración ADP utilizando una curva de calibración.
5. Calcular la cantidad de fosfatos utilizados para la fosforilación de MLC2v.
   NOTA: El ADP total producido durante la reacción de la quinasa se mide como se describe anteriormente. El ADP de fondo, incluida la autofosforilación de cMLCK, se mide sobre la base de una reacción sin MLC2v, y la cantidad de ADP utilizada para la fosforilación de MLC2v se evalúa restando el ADP de fondo del ADP total.

6. Análisis de datos

1. Ajuste los datos a la ecuación de Michalis-Menten utilizando un software de análisis de datos adecuado. Los datos se expresan como media ± desviación estándar.

El método clásico para medir la actividad de la quinasa es un ensayo radiométrico que cuantifica el fosfato radiomarcado incorporado en el sustrato de la quinasa. Para el método presentado aquí, se desarrolló un ensayo de quinasa cMLCK in vitro no radiactivo utilizando cMLCK de tipo salvaje purificado (Figura 1A), MLC2v y calmodulina (Figura 1B), y la actividad de la cinasa se determinó utilizando un ensayo de detección ...

El presente estudio se llevó a cabo para evaluar si la combinación de métodos no radiactivos, el ensayo de detección de ADP bioluminiscente y el SDS-PAGE de afinidad de fosfato podría utilizarse con éxito para determinar la actividad de cMLCK. Es esencial realizar las reacciones de quinasa a la temperatura y el tiempo de reacción óptimos. El aumento de cualquiera de estos promoverá rápida y fuertemente la reacción enzimática. En el presente estudio, la reacción de quinasa in...

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado en parte por JSPS, KAKENHI, Subvención Número JP17K09578 y JP18H04050.