非放射性体外心肌肌球蛋白轻链激酶检测

本研究描述了非辐射方法、生物发光 ADP 检测测定和磷酸盐亲和力 SDS-PAGE 的方案，以确定心肌肌球蛋白轻链激酶 （cMLCK） 的激酶活性及其底物肌球蛋白调节轻链 （MLC2v） 的磷酸化水平。

心脏特异性肌球蛋白调节轻链激酶 （cMLCK） 通过磷酸化肌球蛋白调节轻链 （MLC2v） 的心室亚型来调节心脏肌节结构和收缩力。衰竭心脏中的 MLC2v 磷酸化水平显著降低，表明评估 cMLCK 活性和 MLC2v 磷酸化水平以阐明心力衰竭发病机制的临床重要性。本文介绍了评估 cMLCK 活性和 MLC2v 磷酸化水平的非放射性方法。在 ATP 和钙存在下，在 25 °C 下使用重组 cMLCK 与重组钙调蛋白和 MLC2v 进行体外激酶反应，然后进行生物发光 ADP 检测测定或磷酸盐亲和力 SDS-PAGE。在代表性研究中，生物发光 ADP 检测测定显示，当 cMLCK 浓度在 1.25 nM 至 25 nM 之间时，信号严格线性增加。磷酸盐亲和力 SDS-PAGE 也显示磷酸化 MLC2v 在相同的 cMLCK 浓度范围内呈线性增加。接下来，在 5 nM cMLCK 的浓度下检查反应的时间依赖性。生物发光 ADP 检测测定显示，在反应的 90 分钟内，信号呈线性增加。同样，磷酸盐亲和力 SDS-PAGE 显示磷酸化 MLC2v 的时间依赖性增加。使用生物发光 ADP 检测法通过 Michaelis-Menten 图确定 MLC2v 的 cMLCK 生化参数。 V_max 为 1.65 ± 0.10 mol/min/mol 激酶，平均 K_m 在 25 °C 时约为 0.5 USA μM。 接下来，测量野生型和扩张型心肌病相关 p.Pro639Valfs*15 突变型 cMLCK 的活性。生物发光 ADP 检测测定和磷酸盐亲和力 SDS-PAGE 分别正确检测了 cMLCK 活性和 MLC2v 磷酸化的缺陷。总之，生物发光 ADP 检测测定和磷酸盐亲和力 SDS-PAGE 的组合是一种简单、准确、安全、低成本且灵活的方法来测量 cMLCK 活性和 MLC2v 的磷酸化水平。

由 MYLK3 基因编码的心脏特异性肌球蛋白调节轻链激酶 （cMLCK） 是主要负责维持心肌室肌球蛋白调节轻链 2 （MLC2v） 磷酸化的激酶^1,2。通过在 Ser-15 位点磷酸化 MLC2v，cMLCK 促进肌节组织¹ 并增强心脏收缩力 ^2,3，^这是由于交叉桥形成增加，从而增加肌球蛋白 II 的杠杆臂刚度⁴。在动物模型中，cMLCK 活性缺陷或 MLC2v 磷酸化水平降低会导致心力衰竭的发展 ^3,5,6。因此，cMLCK 活性通过调节 MLC2v 的磷酸化水平，在生理和病理条件下的心脏收缩性中起关键作用。

扩张型心肌病 （DCM） 的特征是收缩功能障碍和左心室腔增大，是充血性心力衰竭和心脏移植的主要原因。到目前为止，已有 40 多个基因被确定为导致 DCM 的突变⁷。最近，发现了一种新的 DCM 相关 MYLK3 突变 （p.Pro639Valfs*15），由于 cMLCK 蛋白在其催化结构域⁸ 的中间部分截短，该突变完全消除了激酶活性。还报道了两例 MYLK3 家族性 DCM 相关突变，显示 cMLCK 活性降低或消除⁹。因此，家族性 DCM 中抑制或消除的 cMLCK 活性可能通过降低 MLC2v 磷酸化水平来促进疾病的发展。即使 MYLK3 没有突变，衰竭的人类心脏中 MLC2v 磷酸化水平也会显著降低 ^10,11。因此，MLC2v 磷酸化水平降低似乎在人心力衰竭中很常见，表明 cMLCK 活性和 MLC2v 磷酸化水平的评估在临床上很重要。有必要解释降低的 MLC2v 磷酸化水平如何导致心脏收缩力降低。因此，测量 cMLCK 活性和 MLC2v 磷酸化水平的检测对于阐明心力衰竭的发病机制极为重要。

测量 cMLCK 活性的经典方法是基于放射性的测定法，该测定法定量 [^γ-32P] 从放射性标记的 ATP 掺入 MLC2v² 中。然而，由于其危险性，它需要特殊的安全和环境考虑，并且废物处理的成本很高。此外，³² 的短半衰期限制了放射性测定的灵活性。为了克服这些缺点，已经开发了替代的非放射性蛋白激酶测定技术¹²。Promega Corporation 开发的生物发光 ADP 检测测定法可在不使用放射性同位素的情况下测量蛋白激酶反应产生的^{ADP 13}。它显示出与具有不同活性水平的蛋白激酶的放射性测定相当的结果¹³。由于生物发光 ADP 检测测定测量激酶反应产生的 ADP，因此磷酸盐亲和力 SDS-PAGE 与生物发光 ADP 检测测定平行用于验证 MLC2v 是否真的被磷酸化。磷酸盐亲和力 SDS-PAGE 是一种磷酸盐亲和电泳技术，可以检测磷酸化底物蛋白与非磷酸化底物蛋白相比的迁移率变化¹⁴。

本文介绍了使用非放射性方法测量 cMLCK 活性及其底物 MLC2v 磷酸化水平的方案。进行体外激酶反应后，采用生物发光 ADP 检测测定和磷酸盐亲和力 SDS-PAGE 分别计算 MLCK 的生化值和 MCL2v 的磷酸化水平。总体而言，结合两种非放射性激酶测定的方案对于激酶的研究很有价值。

1. 重组野生型和 DCM 相关突变体 cMLCK 的克隆和纯化

1. 将重组心肌肌球蛋白轻链激酶克隆到质粒中
   1. 设计一个连续的核苷酸序列来代表最终的质粒。
   2. 使用标准 PCR 方法扩增编码人 MYLK3 （NM_1829493.3） 的 DNA 片段。引物序列如下：
      正向引物：5'- CACCATGTCAGGAACCTCCAAGGAGAGTCTGGGG -3'
      反向引物：5'- TTAGGGAGAAGTTGGAAATTTCCTTAACCT -3'
      熔融温度为 60 °C。
      注：单链突出序列 （CACC） 是连接到 TOPO 克隆载体所必需的。
   3. 通过引物衍生的诱变引入 DCM 相关突变体构建体。引物序列如下：
      正向引物：5'- GTACAAGCCTCGAGAGAAGCTGAAGGTGAAC -3'
      反向引物：5'- CTTGAGGTCCAGGTGCAGGATGTAGTGCTGGT -3'
      熔融温度为 60 °C。
   4. 在 135 V 下运行 0.8% 琼脂糖凝胶 20 分钟，并切出与 PCR 产物相对应的条带。然后按照制造商的说明使用凝胶提取试剂盒（参见 材料）提取和纯化 PCR 产物。
   5. 按照制造商的说明进行 TOPO 克隆反应（参见 材料）并转化 大肠杆菌 （pENTR/cMLCK WT，突变载体）。
   6. 使用以下通用 M13 引物通过 PCR 确认正确的序列。引物序列如下：
      正向引物：5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      反向引物：5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   7. 将 FLAG 标签掺入 pENTR/cMLCK 载体中，并按照制造商的说明（pEF-DEST51/FLAG-cMLCK WT，突变体）在 MYLK3 和 GateWay 目标载体（即 pEF-DEST51）之间进行 LR 重组反应。
2. 细胞培养和转染到 HEK293T 细胞中
   1. 用 7.5 x 10⁶ HEK293T 细胞接种 100 mm 培养皿，并用补充有 10% FBS 和 1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM 培养。在 37 °C 的 5% CO₂ 中孵育 24 小时。
   2. 通过在 500 μL MEM 中混合 10 μg 质粒 DNA，制备用于转染到 HEK293T 细胞中的 Lipofection 试剂/DNA 混合物（参见 材料表）。同时，通过在 500 μL MEM 中加入 20 μL Lipofectamine 2000 来制备混合物。
   3. 在室温 （RT） 下孵育 5 分钟，然后混合 Lipofectamine-DNA 溶液。
   4. 在 RT 中孵育 20 分钟，然后将 1 mL Lipofectamine-DNA 溶液添加到 100 mm 培养皿中。
      注：为避免细胞分离，请轻轻加入脂质转染混合物。
   5. 将转染的细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育长达 48 小时。
3. 重组 cMLCK 蛋白的纯化
   1. 将转染的细胞置于冰上，用 5 mL PBS 洗涤 3 次。
   2. 准备裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、1% NP40、0.5 mM EDTA、0.5 mM EGTA 和蛋白酶抑制剂混合物，pH = 7.5）并保持在冰上。
      注：在测定前添加蛋白酶抑制剂混合物。
   3. 向细胞中加入 1 mL 裂解缓冲液，使用刮刀将细胞收获到 1.5 mL 试管中，并在冰上孵育 5 分钟。
   4. 在 4 °C 下以 20,000 x g 离心 5 分钟。
   5. 在新的 1.5 mL 试管中收集上清液，并与 5 μL FLAG-M2 琼脂糖在 4 °C 下孵育 1 小时。
   6. 在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 1 分钟，然后去除上清液并使用洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、1% NP40、0.5 mM EDTA、0.5 mM EGTA 和蛋白酶抑制剂混合物，pH = 7.5）在 FLAG-M2 琼脂糖中洗涤 3 次。
   7. 在 4 °C 下用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、1% NP40、0.5 mM EDTA、0.5 mM EGTA 和蛋白酶抑制剂混合物，pH = 7.5）洗脱结合蛋白 30 分钟。
   8. 在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 3 分钟，并使用上清液作为重组 FLAG 标记蛋白。

2. 重组钙调蛋白的克隆和纯化

1. 将重组钙调蛋白克隆到质粒中
   1. 设计一个连续的核苷酸序列来代表最终的质粒。
   2. 使用标准 PCR 方法扩增编码人钙调蛋白 （CALM1） （NM_006888） 的 DNA 片段。引物序列如下：
      正向引物：5'- CACCATGGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATT -3'
      反向引物：5'- TCATTTTGCAGTCATCATCATCTGTACGAATTC -3'。
      熔融温度为 60 °C。
      注：单链突出序列 （CACC） 是连接到 TOPO 克隆载体所必需的。
   3. 在 135 V 下运行 0.8% 琼脂糖凝胶 20 分钟，然后从凝胶中切下与 PCR 产物相对应的条带。然后按照制造商的说明使用凝胶提取试剂盒（参见 材料）提取和纯化 PCR 产物。
   4. 按照制造商的说明进行 TOPO 克隆反应（参见 材料）并转化到 大肠杆菌 （pENTR/钙调蛋白） 中。
   5. 使用以下通用 M13 引物通过 PCR 确认正确的序列。引物测序如下：
      正向引物：5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      反向引物：5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   6. 按照制造商的说明在钙调蛋白和 GateWay 目标载体 （pEF-DEST17） 之间进行 LR 重组反应。
   7. 转化为化学感受态 BL21 （DE3） 大肠杆菌。
2. 细胞培养和表达诱导
   1. 用转化 的大肠杆菌 菌落接种 5 mL 含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基，并在 37 °C 下振荡过夜。
   2. 转移至 200 mL 含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中，并在 37 °C 下孵育，直至培养光密度 （600 nm） 达到 0.5。
   3. 加入阿拉伯糖至终浓度为 0.2%，并在 37 °C 下培养 3 小时。
   4. 在 4 °C 下以 5,000 x g 离心 10 分钟并去除上清液。
   5. 悬浮在 10 mL 含有不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物的 BugBuster 预混液中，并在室温下旋转 20 分钟。
   6. 在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 10 分钟。
   7. 将含有 N 末端 His 标签钙调蛋白的上清液上样到用固定化金属离子色谱结合缓冲液平衡的 TALON 亲和树脂柱上。
   8. 用洗脱缓冲液（50 mM 磷酸钠 [pH = 8.0]、0.3 M NaCl、0.1% CHAPS 和 0.15 M 咪唑）洗脱结合的 His 标记的钙调蛋白，然后重新折叠并使用离心过滤器在 4 °C 下以 5,000 x g 离心浓缩。
   9. 将蛋白质浓度调节至 10 μM，溶液保持在 -80 °C 直至使用。

3. 体外激酶测定

注：所有步骤均在冰上进行，以防止激酶反应继续进行。此外，MLCK 和底物溶液分别混合，以避免反应过快。

1. 准备以下溶液并保持在冰上：
   10x激酶缓冲液（200 mM HEPES，10 mM CaCl 2,50 mM MgCl_2,0.1%吐温20，pH = 7.5）
   100 毫米 DTT
   10 毫米 ATP
   500 nM 钙调蛋白
   100 nM FLAG 标记的 cMLCK
   24 μM His 标记的 MLC2v
   注：根据指定浓度，使用 1x 激酶缓冲液稀释重组蛋白。
2. 使用以下成分在 1.5 mL 试管中制备 100 μL 冰上 cMLCK 主溶液：
   10 μL 10x 激酶缓冲液
   20 μL 100 nM cMLCK
   20 μL 5 μM 钙调蛋白
   8 μL 100 mM DTT
   42 μL H₂O
   注：每个样品用 10x 激酶缓冲液和蒸馏水稀释并保存在冰上。
3. 如 表 1 所述，在冰上的 8 条 PCR 管中以每种 MLC2v 浓度制备 30 μL 底物溶液。最终的 MLC2v 浓度为 0、0.25、0.5、1、2、4、8 和 12 μM。
   注：重组 His 标记的 MLC2v 用 10x 激酶缓冲液和蒸馏水稀释。通过加水将底物溶液的体积调节至 30 μL 以获得适当的 MLC2v 浓度。
4. 加入 10 μL MLCK 主溶液，使最终反应溶液体积达到 40 μL。激酶反应中每种组分的最终浓度为 20 mM HEPES、1 mM CaCl₂、5 mM MgCl₂、0.01% Tween 20、2 mM DTT、150 μM ATP、5 nM cMLCK、250 nM 钙调蛋白和 0、0.25、0.5、1、2、4、8 或 12 μM MLC2v （pH = 7.5）。
5. 充分混合并旋转。
6. 将反应样品在 25 °C 下孵育指定时间。
7. 孵育后，通过磷酸盐亲和力 SDS-PAGE 或生物发光 ADP 检测测定法测量激酶活性。

4. 磷酸盐亲和剂 SDS-PAGE

注：磷酸盐亲和性 SDS-PAGE 根据制造商的方案进行（参见 材料表）。

1. 倒入磷酸盐亲和性 SDS-PAGE 的凝胶。
   1. 按如下方式混合堆积凝胶溶液：12% wt/vol 丙烯酰胺、0.1% wt/vol SDS、125 mM Tris-HCl （pH = 6.8）、0.1% wt/vol 过硫酸铵和 0.5% vol/vol N、N、N'、N'-四甲基乙二胺。
   2. 按如下方式混合分离凝胶溶液：12% wt/vol 丙烯酰胺、30 μM Phos-tag 丙烯酰胺、60 μM MnCl₂、0.1% wt/vol SDS、375 mM Tris-HCl（pH = 8.8）、0.05% wt/vol 过硫酸铵和 0.25% vol/vol N、N、N'、N'-四甲基乙二胺。
2. 准备用于电泳的样品。
   1. 将 1 mM MnCl₂ 加入并混合到体外激酶反应的样品中。
3. 进行电泳和 Western 印迹。
   1. 在运行缓冲液（0.1% wt/vol SDS、25 mM Tris 和 192 mM 甘氨酸）中，在 150 V 下运行凝胶 80 分钟。
   2. 电泳后，将凝胶浸泡在 EDTA （+） 转印缓冲液（10 mM EDTA、50 mM Tris、380 mM 甘氨酸、0.000375% wt/vol SDS 和 20% wt/vol 乙醇）中 10 分钟，然后在转印缓冲液中浸泡 10 分钟。
   3. 将蛋白质转印到 PVDF 膜上，在 15 V 下在转印缓冲液中放置 30 分钟。
   4. 在 RT 中用脱脂奶粉连续摇动膜 30 分钟。封闭后，用 TTBS（50 mM Tris、150 mM NaCl、0.001% Tween）洗涤膜 3 次。
   5. 用一抗（抗 MLC2v，1：4,000;Abcam ab92721）在 4 °C 下过夜。
   6. 用 TTBS（50 mM Tris、150 mM NaCl 和 0.001% Tween）洗涤膜 3 次。
   7. 用二抗（HRP 偶联的山羊抗兔 1：8,000;Cappel，#55696）在 RT 下 1 小时。
   8. 用 TTBS 洗涤膜 3 次。
4. 检测和分析膜上的蛋白质。
   1. 在 RT 下将 ECL（增强型 Chemi 发光试剂）检测试剂添加到膜上 1 分钟。
   2. 在最佳时间使用 LAS-4000 检测膜上的蛋白质。
   3. 使用 ImageQuant TL 软件定量磷酸化和非磷酸化 MLC2v，减去背景光密度测定。

5. 生物发光 ADP 检测试验

注意：生物发光 ADP 检测测定是根据制造商的方案进行的。

1. 向激酶测定反应溶液中加入 40 μL ATP 去除试剂，终止激酶反应。充分混合并在 RT 下孵育 30 分钟。
2. 加入 80 μL ADP 检测试剂。充分混合并在 RT 下孵育 30 分钟。
3. 使用光度计测量发光，建议每孔的最大积分时间为 0.5 秒。
4. 使用校准曲线将发光强度转换为 ADP 浓度。
5. 计算用于 MLC2v 磷酸化的磷酸盐量。
   注：如上所述测量激酶反应过程中产生的总 ADP。基于不含 MLC2v 的反应测量背景 ADP，包括 cMLCK 自磷酸化，并通过从总 ADP 中减去背景 ADP 来评估用于 MLC2v 磷酸化的 ADP 量。

6. 数据分析

1. 使用适当的数据分析软件将数据拟合到 Michalis-Menten 方程。数据表示为平均值±标准差。

测量激酶活性的经典方法是基于放射性的测定，可定量掺入激酶底物中的放射性标记磷酸盐。对于此处介绍的方法，开发了一种使用纯化的野生型 cMLCK（图 1A）、MLC2v 和钙调蛋白的非放射性体外 cMLCK 激酶测定法（图 1B），并使用生物发光 ADP 检测测定法测定激酶活性。对于用于建立 cMLCK 测定的实验，使用从 HEK293T 细胞中纯化?...

本研究旨在评估非放射性方法、生物发光 ADP 检测测定和磷酸盐亲和力 SDS-PAGE 的组合是否可以成功用于确定 cMLCK 的活性。必须在最佳温度和反应时间下进行激酶反应。增加其中任何一个都会迅速而强烈地促进酶反应。在本研究中，在 25 °C 下用 5 nM 的 cMLCK 进行体外激酶反应，确保至少 90 分钟的信号线性。生物发光 ADP 检测测定使用三步过程来定量蛋白激酶反应过程中产?...

作者没有什么可披露的。

这项工作部分得到了 JSPS KAKENHI Grant Number JP17K09578 和 JP18H04050 的支持。