MS2-זיקה טיהור בשילוב עם רצף RNA או MAPS פותחה כדי לזהות את היעד כולו של כל RNA של עניין בחיידקים. טכנולוגיה זו מאפשרת לזהות כל סוג של שותפי sRNA ללא תלות במנגנון הרגולציה. האפיון של רשתות רגולטוריות תלויות sRNA יעזור להבין גורמי ארסיות טובים יותר ייצור, היווצרות ביופילם, והישרדות של החיידקים בתוך התאים המארחים, ובסופו של דבר להילחם נגד זיהומים staphylococcal.
פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל חיידקים פתוגניים או לא פתוגניים גרם חיובי. מי שתדגים את ההליך תהיה נעמי מרסייה, דוקטורנטית מהמעבדה של ד"ר פסקל רומבי. כדי להתחיל, לגדל מושבה אחת של זנים הנושאים גם pCN51 P3 MS2 sRNA או pCN51 P3 MS2 פלסמידים בשלושה מיליליטר של בינוני BHI בתוספת 10 מיקרוגרם לכל אריתרומיצין מיקרוליטר בכפילויות.
לדלל כל תרבות לילה ב 50 מיליליטר של בינוני BHI טרי בתוספת אריתרומיצין להגיע OD 600 של 0.05. לגדל את התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 180 סל"ד במשך שש שעות. להעביר כל תרבות לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר וצנטריפוגה הצינורות ב 2, 900 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז להשליך את supernatant, להקפיא ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס או לשמור את כדורי על הקרח ישירות לבצע תמוגה תא מכני.
כדי לבצע תמוגה תא מכני, resuspend כדורי בחמישה מיליליטר של חיץ A ולהעביר את התאים לשימוש חוזר ל 15 מיליליטר צנטריפוגות צינורות עם 3.5 גרם של חרוזי סיליקה. הכנס את הצינורות למכשיר תמוגה תא מכני ולהפעיל מחזור של 40 שניות בארבעה מטרים לשנייה. צנטריפוגה הצינורות ב 2, 900 פעמים G במשך 15 דקות, ואז לשחזר את supernatant ולשמור אותו על הקרח.
ודא כי supernatant ברור, חוזר על הצנטריפוגה אם זה לא. הסר את קצה העמודה ולאחר מכן הצב עמודת כרומטוגרפיה בארון תקשורת של עמודים ושטוף את העמוד במים דקים במיוחד. הוסף 300 מיקרוליטרים של שרף amylose ולשטוף את העמודה עם 10 מיליליטר של מאגר A.Dilute 1, 200 picamoles של חלבון MBP-MS2 בשישה מיליליטר של חיץ A ולטעון אותו לתוך העמודה.
לשטוף את העמודה עם 10 מיליליטר של חיץ A.Next, לבצע טיהור MS2-זיקה. לטעון את התא lysate לתוך העמודה ולאסוף את השבר זרימה דרך בצינור אוסף נקי. לשטוף את הטור שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של חוצץ A ולאסוף את שבר לשטוף, ואז elute את העמודה עם מיליליטר אחד של חיץ E ולאסוף את שבר elution ב microtube שני מיליליטר.
שמור את כל השברים שנאספו על קרח עד מיצוי RNA. השתמש מיליליטר אחד של כל שבר עבור מיצוי RNA. מוסיפים נפח אחד של פנול ל- RNA ומערבבים במרץ, ואז צנטריפוגה התערובת ב 16, 000 פעמים G במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
העבר את השלב העליון למיקרו-צינור נקי של שני מיליליטר. הוסף נפח אחד של אלכוהול איזואמיל כלורופורם ולחזור על הצנטריפוגה, ולאחר מכן להעביר את השלב העליון לצינור חדש. הוסף 2.5 כרכים של 100% אתנול קר ונפח 0.1 של שלושה נתרן אצטט טוחן ב- pH 5.2 ומזרז לילה במינוס 20 מעלות צלזיוס.
למחרת, צנטריפוגה הצינורות במשך 15 דקות ב 16, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לאט להסיר את האתנול עם פיפטה, מקפיד לא להפריע גלולה. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של 80% אתנול קר וצנטריפוגה לחמש דקות.
להשליך את האתנול על ידי pipetting אותו לאט, ואז לייבש את גלולה באמצעות רכז ואקום במשך חמש דקות במצב ריצה. Resuspend גלולה בנפח המתאים של מים אולטרה-דקים. פרוטוקול זה שימש כדי ללמוד את היעד RsaC בS.aureus.
מספר mRNAs אינטראקציה ישירה עם RsaC זוהו באמצעות טכנולוגיית MAPS, חושף את תפקידה המכריע מתח חמצוני ותגובות הקשורות מתכת. כדי לאשר את מבנה ה-MS2 sRNA ולהמחיש את דפוס הביטוי שלהם, תאים נקצרו לאחר שעתיים, ארבע ושש שעות של צמיחה במדיום BHI. RNA חולץ וניתוח כתם צפון בוצע באמצעות בדיקה DIG ספציפי RsaC.
רמת RsaC אנדוגני גדל באופן משמעותי לאחר שש שעות של צמיחה. חשוב לציין, רמת MS2-RsaC 544 ו MS2-RsaC 1, 116 היו דומים RsaC אנדוגני בשש שעות. טיהור זיקה בוצע RNAs חולצו מן התמצית הגולמית, זרימה דרך, שברי elution בזן סוג פראי המבטא את תג MS2 לבד ואת זן RsaC מוטציה המבטא את MS2-RsaC 544 לבנות.
1, 116 nucleotide ארוך endogenous RsaC הועשר בשבר elution, אבל אינטראקציה לא במיוחד עם עמודת הזיקה בשל אורכו ומבנה משני מורכב. MS2-RsaC 544 היה מועשר מאוד בשבר elution המוכיח כי הוא נשמר בהצלחה על ידי חלבון היתוך MS2-MBP. ניתוח ביואינפורמטי חשף מטרות mRNA putative על פי שינוי הקיפול בין MS2 sRNA ו MS2 שליטה, המציין כי SODA היה היעד putative הראשון.
ניתוח כתם צפוני ביצע בדיקה DIG ספציפית לסודה לאחר טיהור MS2-זיקה מראה כי SODA היה מועשר ביעילות עם MS2-RsaC 544 בהשוואה לבקרת MS2. בעת ניסיון לפרוטוקול זה, זכור שהתוספת של תג MS2 יכולה להשפיע על אישור, יציבות או פונקציה של sRNA. זה צריך להיות במעקב קפדני.
MAPS מספק תמונת מצב של זיווג מטרות sRNA-RNA. אימות ניסיוני נוסף יחשוף את תפקידם. טכניקה זו מייצגת כלי רב עוצמה לבניית רשתות רגולטוריות sRNA בכל חיידק.
