Name: novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology at JoVE.com

אנו מודים פרופ &#39;ג&#39;ף Gerst ובוריס Slobodin עבור העצות המועילות שלהם בהקמת הפרוטוקול המהיר ומתן פלסמידים הדרושים. כמו כן, אנו מודים לד&quot;ר אביגיל עתיר-לנדה על עזרתה בהקמת פרוטוקול זה וד&quot;ר תמר זיו ממרכז פרוטאומיקה סמולר על עזרתה עם ניתוח LC-MS / MS. אנו מודים פרופ TG Kinzy (Rutgers) עבור נוגדן YEF3. עבודה זו נתמכה על ידי מענק 2011013 מהקרן הדו-לאומית למדע.

הערה: הכנס רצף המורכב 12 אתרים MS2 מחייב (MS2 לולאות; MS2L) לתוך מוקד גנומית הרצוי, בדרך כלל בין מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) ואת 3 &#39;UTR. פרוטוקול מפורט לצורך שילוב זה מסופק במקום אחר 22. אמת בנוגע להרכבה ביטוי הולם על ידי PCR, ניתוח הצפוני או RT-PCR 20,23. חשוב לוודא כי השילוב לא התערב עם הסינתזה של 3&#39;UTR. בנוסף, MS2-CP-לבטא פלסמיד התמזגו SBP תחת הביטוי של האמרגן מושרה (דלדול מתיונין) צריך גם להיות מוחדר לתאים 24. זן זהה, למעט לולאות MS12 הציגו, אמור לשמש כביקורת לצורך זיהוי של אותות שאינם ספציפיים. 1. טיהור מהירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 500 מ&quot;ל של תאי שמרים (השתמש 250-1,000 מ&quot;ל של תאי שמרים בהתאם לרמת הביטוי של הגן של עניין) המבטא mRNA מתויג MS2 20MS2-CP-GFP-SBP היתוך חלבון 24 עד OD 600 0.8 - 1.0 ב 30 o C במדיום הגידול המתאים (למשל, דקסטרוז סינתטי (SD) מצע סלקטיבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 4 דקות ב RT וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף התאים בופר פוספט 1x (PBS), צנטריפוגות כמו קודם (שלב 1.2), resuspend בנפח שווה (שלב 1.1) של SD ללא מתיונין, דגירה במשך 45 - C 60 דקות ב 30 o להשרות ביטוי של MS2 -CP-GFP-SBP חלבון היתוך. הערה: זמן אינדוקציה ארוך עלול לגרום צבירה של GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצד 10 מ&quot;ל של תאים ולחלץ RNA ממדגם זה על פי השיטה פשוטה &quot;פנול חם&quot; 25. זהירות: פנול הוא רעיל מאוד, יש לטפל בהתאם להוראות הבטיחות שלו. הערה: RNA זוהי התייחסות טובה איכות RNA הבודד (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 500 מ&quot;ל תאים, להוסיף 1.35 מ&quot;ל 37% פורמלדהיד ג הסופיoncentration של 0.1% ל crosslink מתחמי-חלבון RNA. המשך דגירה על 30 מעלות צלסיוס למשך 10 דקות. זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל מאוד, יש לטפל בהתאם להוראות הבטיחות שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 26.5 מ&quot;ל של 2.5 מ &#39;גליצין לריכוז סופי של 0.125 M דגירה במשך 3 דקות כדי לעצור crosslinking. משלב זה ואילך, לשים את הכל על קרח כדי למזער השפלה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 3000 XG במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלסיוס ולשטוף עם 45 מ&quot;ל קר 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 1 מ&quot;ל חיץ תמוגה מהירה לכל 100 מ&quot;ל של תרבית תאים ראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפצלה aliquots של 500 μl צינורות microfuge בורג הכתיר ולהוסיף ~ 400 מ&quot;ג של חרוזי זכוכית מקורר לכל aliquot (בערך צינור PCR מלא 0.2 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים חרוז מקצף במשך 3 דקות. מיד לשים את lysate על הקרח. הערה: משחרר תמוגה Cell RNases הסלולר, אשר הם הגורם העיקרי לפגיעה חמורה RNA. חיץ תמוגה מהירה מכיל ריכוז גבוה של RNase inhibitors, כגון הפרין המעכב RNase הספציפי ומעכבים ספציפיים. עבודה במהירות ושמירת הכל קר מומלץ גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את lysate צינורות חדשים. פירס חור קטן בתחתית כל צינור microfuge במחט חמה (0.8 מ&quot;מ x 40 מ&quot;מ) והמקום צינורות microfuge על גבי 15 צינורות מ&quot;ל. השתמש ראש מזרק 5 מ&quot;ל כמו מתאם בין צינורות microfuge ו -15 מ&quot;ל צינורות. צנטריפוגה הרכבת הצינורות ב 3000 XG דקות 1 ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זרם דרך מהצינור 15 מ&quot;ל לצינור צנטריפוגות 1.5 מ&quot;ל חדש ב XG 10,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלסיוס כדי לנקות פסולת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants בריכה מכל צינורות 1.5 מ&quot;ל לתוך צינור 15 מ&quot;ל יחיד, ומניחים בצד 1/50 ו 1/100 נפח של lysate עבור RNA ובידוד חלבון, בהתאמה. הערה: אלה ישמשו את הדגימות &quot;קלט&quot; לניתוח שלאחר מכן (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 מיקרוגרם של avidin לכל 500 מ&quot;ל של iתרבית שמרי nitial דגירה למשך 30 דקות (זה יכול להיות מופחת עד 10 דק &#39;) בשעה 4 מעלות צלסיוס מתחת זמן התגלגל (10 סל&quot;ד). הערה: ביוטין בלוקים avidin וחלבונים biotinylated מלהיקשר החרוזים streptavidin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לשטוף את החרוזים streptavidin לפני הדגירה עם lysate התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כ -300 μl של streptavidin חרוזים בלועה לצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל ולהסיר את supernatant העליון. זה יגרום 250 μl של חרוזים. שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה. צנטריפוגה חרוזים streptavidin ב 660 XG במשך 2 דקות ב 4 o בין כל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את החרוזים על ידי דוגרים במשך שעה 1 עם 0.5 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה, 0.5 מ&quot;ל של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BSA ו -10 μl של 10 מ&quot;ג / tRNA שמרים מ&quot;ל. חרוזים ניתן להשאיר O / N בחסימת פתרון ב 4 o C עם רוטציה במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה. הערה: חרוזים מגנטיים גם יכול לשמש כדי להפחית את זמן background. יש אלה, עם זאת, קיבולת נמוכה יותר מאשר חרוזים sepharose. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חרוזים streptavidin מראש שטף אל lysate המכיל avidin (משלב 1.14) ו דגירה שעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה קבועה (10 סל&quot;ד). הערה: זמן דגירה זוהי פשרה בין מתן זמן מחייב מספיק ומזעור סיכויים שפל RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 660 XG במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלסיוס כדי לנקות את החרוזים streptavidin ולהעביר את supernatant לצינור 15 מ&quot;ל חדש. מניחים בצד 1/50 ו 1/100 נפח של lysate עבור בידוד RNA וחלבון, בהתאמה. הערה: אלה יהיו הדגימות &quot;המאוגדות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה מהירה, לנער בעדינות, להעביר צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge חדש, צנטריפוגות כמו בשלב 1.17. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של חיץ מהירה לשטוף, וסיבוב הפעם (10 סל&quot;ד) במשך 5 דקות ב 4 °. חזור על פעולה זו פעמיים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של PBS ו צנטריפוגות 1x כנ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים שוב עם 120 μl של 1x PBS. צנטריפוגה כנ&quot;ל, ולקחת את supernatant כולו עבור רנ&quot;א מיצוי חלבון כמו המדגם &quot;לשטוף&quot;. הערה: מדגם לשטוף אחרון זה יציין את ההחמרה של הכביסות וצריך להיות של אותו נפח כמו מדגם Elution. זה יפשט עיבוד וטעינה מבחני הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי elute רנ&quot;א וחלבונים הקשורים RNA מהעמודה, להוסיף 120 μl של ביוטין 6 מ&quot;מ 1x PBS ו דגירה במשך 45 דקות ב 4 ° C עם רוטציה קבועה (10 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוז כנ&quot;ל ולהעביר את חומר eluted לצינור 1.5 מיליליטר חדש. ספין מדגם eluted שוב ולהעביר את השלב העליון לצינור 1.5 מיליליטר חדש על מנת להבטיח שום שריד של חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דגימות עבור RNA או מיצוי חלבון. הערה: הנפח נלקח להסתמך על נחות היסוד ברמת assay והביטוי הבאה של RNA או חלבון העניין. כקו מנחה, לניתוח הצפוני 26, לקחת 80% מהמדגם, עבור כתם המערבי 23,27 או RT-PCR 28, לקבל 20%, ועבור ספקטרומטריית מסה 29 לגלות חלבונים חדשים, לקחת את המדגם כולו. </li></ol> 2. RNA הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של הצפת היפוך 2x Crosslinking דגירה במשך 45 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. המשך ישירות להפקת RNA. הערה: היפוך Crosslinking ההצפה מכיל חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), אשר משפרת באופן משמעותי מיצוי RNA 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פנול סטנדרטי: שיטת כלורופורם 26 לחלץ RNA מן &quot;הקלט&quot; דגימות &quot;מאוגדות&quot; (שלבי 1.13 ו 1.17). הערה: דגימות אלה מכילות כמות גדולה של הפרין המעכב RNase, אשר יכול לעכב Transcriptase- הפוך עוקבים (RT) מבחני ניצול (למשל, RT-PCR), ולכן, LiCl משקע 30 מומלצת להסיר אותו. את &quot;wash &quot;ו&quot; elution &quot;דגימות (שלבי 1.21 ו -1.24) מכילות כמויות נמוכות של רנ&quot;א הם זרזו באמצעות השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של 8M guanidinium-HCl (GuHCl) ושני כרכים של אתנול 100% על &quot;לשטוף&quot; דגימות &quot;elution&quot;. דגירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 2. הערה: guanidinium יהיה לפגל חלבונים ביעילות ובכך לעכב RNases ו פרוטאזות במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 20,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות וזורקים supernatant. שטוף את הכדור עם אתנול ו צנטריפוגות 80% קרים שוב ב -20,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס את גלולת רנ&quot;א 400 μl מים חינם RNase המשקע שוב כדי להסיר כל שאריות GuHCl או מזהמים אחרים. הוסף 40 μl של 3 M נתרן אצטט, pH 5.2 ו 800 μl של אתנול 100%, דגירה ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ולשטוף כמו בשלב 2.4 ולהסיר כל אתנול עם טיפ 10 μl. Resuspend את פל RNAet ב 10 מים חינם μl RNase. לטפל נוסף כמו גלולת RNA היא בדרך כלל לא נראה לעין. הערה: דוגמאות ניתן להשתמש לצורך ניתוח הצפוני כמתואר 23 (איור 1). </li></ol> 3. חלבון הכנה כתם המערבי או ניתוח ספקטרומטריית מסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1/3 נפח של חיץ מדגם 4x Laemmli (LSB) כדי דגימות חלבון דגירה 45 דקות ב 65 מעלות צלזיוס כדי להפוך את crosslinking של רנ&quot;א וחלבונים. הערה: דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים לרוץ על ג&#39;ל polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) 31. התאם את אחוז הג&#39;ל בהתאם לגודל של חלבונים להיות מנותח. הערה: 10% ג&#39;ל acrylamide נותן מגוון רחב של נפרד והוא טוב כמו קירוב ראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר חלבונים בקרום כמו בניתוח immunoblot תקן 27 על שליטה יעילה בידוד (התרשים 1C). כתם עם או Coomassie הכחול Rכתם 250 או כסף לפני ניתוח ספקטרומטריית מסה. הערה: כתם כסף הוא הבחירה המועדפת, כי זה יותר רגיש ומאפשר זיהוי טוב יותר (איור 1 ב). מכתים ניתן לעשות עם באופן ידני פתרונות מוכנים או ערכות מסחריות. זמן הדגירה של ג&#39;ל הפתרון לצבוע הסופי צריך להיקבע באופן ניסיוני. דגירה ארוכה עשויה לחשוף חלבונים נמוכים בשפע, אבל יכולה לגרום חלבונים מבוטאים בכמות גבוהה כגון MS2-CP-SBP-GFP להיצבע שוב עלול להסוות חלבונים שמסביב בקרבתם. בנוסף, רקע גבוה עלול לגרום. בצע את התגובה בקפידה, ולהוסיף להפסיק פתרון בזמן המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור להקות מן הג&#39;ל ולהעבירם 1.5 מ&quot;ל צינורות. חנות דגימות ב -20 ° C, או לשלוח להפקת חלבונים העיכול טריפסין ואחריו LC-MS / MS ניתוח 32. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כגישה proteomic אלטרנטיבה שולל את הצעד ההפרדה ג&#39;ל, לעכל חומר eluted משלב 1.24 ב כךlution באמצעות טריפסין ובכפוף LC-MS / MS ניתוח 33. הערה: השמטת הפרדה SDS-PAGE מפשט את פרוטוקול ומגבירה התשואה. עם זאת, דגימות עשויות להכיל עקבות של חומר הניקוי NP-40, אשר מעכב ניתוח ספקטרומטריית מסה. כדי להתגבר על בעיה זו, בצע את הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל חלבון על SDS-PAGE 31 במשך 10 - 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלק כולו של השביל (כלומר, שבו חלבונים נמצאים). הערה: מדגם החלבון עשוי לכלול כמות משמעותית של חלבון MS2-CP-SBP שעשוי לטשטש אותות של חלבונים בשפע נמוכים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs,+suggesting+an+extensive+regulatory+system.">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6, e255 (2008).</li><li>Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+search+reveals+unexpected+RNA-binding+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> PloS One. 5, (2010).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149, 1393-1406 (2012).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46, 674-690 (2012).</li><li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs.">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol Cell. 54, 547-558 (2014).</li><li>Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+processing+and+its+regulation:+global+insights+into+biological+networks.">RNA processing and its regulation: global insights into biological networks.</a> Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).</li><li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria.">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li><li>Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-disciplinary+methods+to+define+RNA-protein+interactions+and+regulatory+networks.">Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).</li><li>Denman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNPs+take+shape+by+CLIPPING+and+PAIRING.">mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING.</a> BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).</li><li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15, 203 (2014).</li><li>Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+mRNA-protein+complexes+using+a+yeast+three-hybrid+system.">Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system.</a> Methods. 26, 123-141 (2002).</li><li>SenGupta, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-hybrid+system+to+detect+RNA-protein+interactions+in+vivo.">A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).</li><li>Yosefzon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+RNA+binding+specificity+of+yeast+Puf2p.">Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p.</a> RNA. 17, 1479-1488 (2011).</li><li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+yeast+mRNPs.">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).</li><li>Zielinski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+ribonucleoprotein-RNA+interactions.">In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).</li><li>Bell, T. J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Genomics:+RNA+Exon-Specific+RNA-Binding+Protein+Isolation.">Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation.</a> Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).</li><li>Leppek, K., Stoecklin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+streptavidin-binding+RNA+aptamer+for+purification+of+ribonucleoprotein+complexes+identifies+novel+ARE-binding+proteins.">An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins.</a> Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).</li><li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+interacting+proteins+and+transcripts+in+ribonucleoprotein+complexes.">A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes.</a> RNA. 16, 2277-2290 (2010).</li><li>Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elongation+factor+eEF3+(Yef3)+interacts+with+mRNA+in+a+translation+independent+manner.">The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner.</a> BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).</li><li>Loya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3'-UTR+mediates+the+cellular+localization+of+an+mRNA+encoding+a+short+plasma+membrane+protein.">The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein.</a> RNA. 14, 1352-1365 (2008).</li><li>Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+integration+method+for+the+simultaneous+visualization+of+endogenous+mRNAs+and+their+translation+products+in+living+yeast.">A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast.</a> RNA. 17, 2249-2255 (2011).</li><li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3'-UTRs+and+their+ORFs.">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).</li><li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RaPID:+an+aptamer-based+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+RNA+and+protein+factors+present+in+ribonucleoprotein+complexes.">RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes.</a> Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>Eldad, N., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ribosomal+density-mapping+procedure+to+explore+ribosome+positions+along+translating+mRNAs.">A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs.</a> Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).</li><li>Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRFbeta,+a+novel+regulator+of+calcium+signaling,+is+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+brain.">GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain.</a> J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).</li><li>Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+gene+expression+in+pancreatic+beta-cells:+cloning+and+characterization+of+differentially+expressed+genes.">Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes.</a> Diabetes. 48, 552-556 (1999).</li><li>Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+eukaryotic+initiation+factor+5+rescues+the+translational+defect+of+tpk1w+in+a+manner+that+necessitates+a+novel+phosphorylation+site.">Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site.</a> FEBS J. 282, 504-520 (2015).</li><li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria.">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(1D+SDS-PAGE).">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li><li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow.">Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).</li><li>Medzihradszky, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-solution+digestion+of+proteins+for+mass+spectrometry.">In-solution digestion of proteins for mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).</li><li>Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StreptoTag:+a+novel+method+for+the+isolation+of+RNA-binding+proteins.">StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1509-1516 (1999).</li><li>Oeffinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+steps+forward--one+step+back:+advances+in+affinity+purification+mass+spectrometry+of+macromolecular+complexes.">Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes.</a> Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).</li><li>Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+beta-actin+mRNA+zipcode-binding+protein.">Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein.</a> Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).</li><li>Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Xenopus+Vg1+mRNA+by+Vera+protein+and+the+endoplasmic+reticulum.">Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum.</a> Science. 276, 1128-1131 (1997).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Aizer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+mRNA+targeting+to+P-bodies+in+living+human+cells+reveals+their+dual+role+in+mRNA+decay+and+storage.">Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage.</a> J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).</li><li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li><li>Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications+:+a+comparison+of+yeast+lysis+methods.">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5, 14 (2004).</li><li>Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+in+CHO+cells+mediated+by+CRISPR/Cas9+and+homology-directed+DNA+repair+pathway.">Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway.</a> Sci Rep. 5, 8572 (2015).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li><li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantitation+of+protein+expression+and+site-specific+phosphorylation.">Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).</li><li>de Godoy, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SILAC+yeast:+from+labeling+to+comprehensive+proteome+quantification.">SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification.</a> Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

שיטות שונות להשתמש הבידוד של mRNAs ספציפי לזהות חלבונים הקשורים בהם 11,34 35. שיטות אלה חלות במבחנה אסטרטגיות vivo לחקור אינטראקציות RNA-חלבון. שיטות חוץ גופית דגירה עיבד אקסוגני RNA עם lysate התא כדי ללכוד RBPs ולבודד מתחמי RNP 36,37. גישה יעילה מסו?...

חלבונים קושרי RNA (RBPs) מייצגים כ -10% של ס חלבוני cerevisiae 1,2 וכ -15% של חלבונים יונקים 3-5. הם מעורבים תהליכים תאיים רבים כגון mRNA שלאחר תעתיק עיבוד ורגולציה, תרגום, biogenesis הריבוזום, tRNA aminoacylation ושינוי, שיפוץ הכרומטין, ועוד. בפלח חשוב של RBPs הוא חלבונים קושרי mRNA (mRNPs) 6,7. במהלך ההבשלה mRNA, RBPs שונים לקשור את התמליל ואת לתווך עיבוד הגרעין שלה, לייצא מתוך הגרעין, לוקליזציה הסלולר, תרגום והשפלה 6-8. לפיכך, הקבוצה הנפרדת של RBPs כבול תעתיק מסוים בכל נקודת זמן קובעת העיבוד שלו, ובסופו של דבר את גורלה. זיהוי של RBPs קשור mRNA עשוי לשפר באופן משמעותי את הבנתנו התהליכים שבבסיס תקנה שלאחר התעתיק שלהם. מגוונים גנטיים, מיקרוסקופי, שימשו שיטות ביוכימיות ביואינפורמטיקה לזהות חלבונים המעורבים בוויסות mRNA (הנסקרת ב 9-11). עם זאת, רק כמה שיטות אלה מאפשרים זיהוי של חלבונים הקשורים עם mRNA יעד מסוים. מן ראוי לציין כי הוא המערכת ההיברידית שמרים שלוש (Y3H), אשר מנצלת את ה- mRNA של עניין כפיתיון כדי להקרין ספריית ביטוי בתאי שמרים. שיבוטים חיוביים בדרך כלל הם נצפו באמצעות ביטוי בחירה או כתב צמיחת 12-14. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא מספר רב של חלבונים כי ניתן לסרוק בסביבה הסלולר והיכולת למדוד את עוצמת האינטראקציה RNA-חלבון. חסרונות כוללים מספר הגדול יחסית של תוצאות חיוביות שגויות עקב מחייב הלא ספציפי, ואת הפוטנציאל הגבוה תוצאות שליליות שגויות נובעות, בין שאר, כדי misfolding של טרף חלבון היתוך או RNA הפיתיון. חלופה לגישה הגנטית purifi זיקהקטיון של RNA עם החלבונים הקשורים שלה. פולי A-המכיל mRNAs ניתן לבודד באמצעות השימוש בעמודים dT אוליגו, וחלבונים הקשורים בהם מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה. האינטראקציה RNA חלבון נשמרת בהקשר הסלולר שלה על ידי crosslinking, מה שהופך קשרים קוולנטיים קצר-טווח. השימוש בעמודה אוליגו dT מניב בראיה גלובלית של proteome כולו המשויך כל פולי A-המכיל mRNA 3,5,15. עם זאת, זה אינו מספק רשימה של חלבונים הקשורים עם mRNA מסוים. מעט מאוד שיטות זמינות להשיג הזדהות כזאת. שיטת הזוג כרוכה transfection של חומצות גרעין עם השלמה ליעד mRNA 16,17. חומצת גרעין גם מחוברת פפטיד, אשר מאפשר crosslinking כדי RBPs באזור קרוב לאתר אינטראקציה. לאחר crosslinking, חומצת RBP-פפטיד-גרעין ניתן לבודד נתון ניתוח פרוטאומיקה. לאחרונה, מתודולוגיה מבוססת aptamer הייתהבהצלחה להחיל שואבת מן שורות תאים יונקות 18. Aptamer RNA עם זיקה משופרת streptavidin פותח התמזג רצף של עניין (אלמנט עשיר AU (ARE) במקרה זה). Aptamer-ARE RNA צורף חרוזים streptavidin ו מעורבב עם lysate התא. חלבונים כי קשור ההשתלשלות אינה טוהרו וזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). אמנם שיטה זו זוהתה עמותות המתרחשות מחוץ הגדרות הסלולר (כלומר, במבחנה), היא עשויה להיות שונה בעתיד כדי להציג את aptamers לתוך הגנום ובכך לאפשר את הבידוד של חלבונים הקשורים mRNA בעוד המילייה הסלולר (כלומר, in vivo). בשמרים, שבו מניפולציות גנטיות מבוססות היטב, את השיטה המהירה (שפותחה במעבדתו של פרופ &#39;ג&#39;ף Gerst) מספקת תצוגה של עמותות vivo ב -19. מהירה משלב הכריכה ספציפי וחזק של חלבון מעיל MS2 (MS2-CP) אל רצף הרנ&quot;א MS2, ושל תחום מחייב streptavidin (SBP) streptavidin בשילוב חרוזים מצומדות. זה מאפשר טיהור יעילה של mRNAs מתויג MS2 באמצעות חרוזי streptavidin. יתר על כן, הביטוי של 12 עותקים של MS2 לולאות מאפשר עד שישה MS2-CPS להיקשר בו זמנית אל RNA ולהגדיל את יעילות הבידוד שלה. פרוטוקול זה ולכן הוצע לאפשר זיהוי של חלבונים הקשורים mRNA הרומן פעם דגימות eluted חשופים ניתוח proteomics ידי ספקטרומטריית מסה. אנחנו לאחרונה מנוצלים מהירים לזהות חלבונים חדשים קשורים שמרים PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA הוצגה בעבר יקושר עם קרום ER וסביבתה 3 &#39;המתורגמת (UTR) נמצאה להיות קובע עיקרי בשיתוף זה 21. לפיכך, RBPs אשר נקלט PMP1 3 &#39;UTR צפוי לשחק תפקיד חשוב הלוקליזציה שלה. מהיר ובעקבותיו כרומטוגרף נוזליy-המוני ספקטרומטריית / ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) גרמה לזיהויו של חלבונים חדשים רבים כי אינטראקציה עם PMP1 20. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של המתודולוגיה המהירה, שולטים חשוב שצריכים להיעשות, וטיפים טכניים שעלולות לשפר את התשואה וספציפית.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol (pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Glass Beads</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0.4-0.6mm diameter&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.</td></tr><tr><td>Hot phenol lysis buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3 M Sodium Acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% and 70% Ethanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RaPID lysis buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 &amp;micro;g/ml Leupeptin, 10 &amp;micro;g/ml Aprotinin, 10 &amp;micro;g/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 &amp;micro;g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor.</td></tr><tr><td>2x Cross-linking reversal buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr><td>RaPID wash buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&amp;nbsp; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>161-0449</td><td>For detecting proteins in polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>SD selective medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)</td><td>Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td><td>1:5,000</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFP antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3,000</td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG-HRP conjugated</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10,000</td></tr></tbody></table>

novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

מהיר מאפשר הבידוד של רנ&quot;א יעד ספציפי עם החלבונים הקשורים שלה. ההצלחה קריטית שלה הוא שמירה על רנ&quot;א ללא פגע ככל האפשר, ועל ידי כך הושגה כמות של חלבונים מספיק. כדי לקבוע את יעילות הבידוד ואיכות RNA, ניתוח צפון מתבצע (איור 1 א). יש ניתוח צפון הית...

Watch this Scientific Journal Video about Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology at JoVE.com

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

novel-rna-binding-proteins-isolation-by-the-rapid-methodology

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K Views.  Technion - Israel Institute of Technology. RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell. 

Video: Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin-Streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של RNA-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Cancer Research

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biology

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

RNA-Protein Pull-Down Assay to Isolate RNA-Binding Proteins via Affinity Extraction

Source: Kresoja-Rakic, J., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57516">Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an in vitro RNA pull-down assay to identify RNA-binding proteins (RBPs), which interact with the adenylate-uridylate-rich element (ARE) sequences in mRNA. The target RBPs from a cell lysate are mixed with an RNA probe to form RNA-protein complexes. The complexes are isolated via affinity purification utilizing the affinity of the desthiobiotin label of the RNA probe to a streptavidin-labeled magnetic bead.

RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

Source: Kresoja-Rakic, J., et al. Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells. J. Vis. ...