שיטה זו שימושית כדי לנתח את התפקיד של מולקולות מסוימות בהדרכה אקסונאלית הגירה עצבית במהלך פיתוח מערכת נוירו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתוח התוצאות הוא מהיר ופשוט ולא דורש תוכנה מורכבת אשר מרמזת על הכשרה רבה לחוקרים. הדגימה של ההליך תהיה מיריאן סאגורה-פליו, טכנאית מהמעבדה שלנו וממיתי.
כדי להתחיל צלחת 200, 000 COS-1 תאים לתוך 35 מילימטר מנות פטרי דגירה עם מדיום תרבות מלאה באינקובטור תרבות התא כדי לקרוא 70 עד 80% confluency לילה. ביום שלמחרת, כדי לשנות את תאי COS-1 עם DNA קידוד המולקולה המועמדת באמצעות שיטת transfection מבוסס ליפוזום. ראשית לערבב 250 microliters של מדיום ללא סרום ואחד עד 2 מיקרוגרם DNA בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
להכנת צינור ליפוזומלי, הוסיפו 240 מיקרוליטרים של המדיום החופשי בסרום ו-10 מיקרוליטרים של רגנט ליפוזומלי, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים את התוכן של צינור ה- DNA לצינור השפתיים. מערבבים בעדינות ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
החלף את המדיום בתאים מתורבתים עם 1.5 מיליליטר של המדיום ללא סרום. מוסיפים את תערובת ליפוזומים DNA לאט טיפה חכם לתאים. דגירה באינקובטור תרבות תא דו תחמוצת הפחמן במשך שלוש שעות.
לאחר החממה הושלמה, להחליף את המדיום עם מדיום תרבות מלאה דגירה לילה באינקובטור. למחרת, לשטוף את התאים עם 0.1 PBS של Dulbecco טוחן. מוסיפים 800 מיקרוליטרים טריפסין EDTA לכל מנה וחנקובה במשך חמש עד 15 דקות באינקובטור פחמן דו חמצני.
לאסוף תאים מנותקים עם שני מיליליטר של מדיום תרבות מלאה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ולהוסיף 10 מיליליטר של אותו מדיום. צנטריפוגה התאים בארבע מעלות צלזיוס ב 130 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את supernatant ולשמר את גלולה המכילה תאי COS-1 על קרח.
לאחר הכנת תערובת העבודה של הקולגן, מוסיפים 100 עד 150 מיקרוליטרים של תערובת הקולגן לכדור התאים המרובים ומערבבים בעדינות על ידי צינורות למעלה ולמטה. מורחים 45 עד 50 מיקרוליטרים של תערובת גלולות של תאי קולגן על צלחת פטרי 35 מ"מ כדי ליצור תחבושת אחידה של תאי קולגן, באורך של כ-1 עד 1.5 ס"מ. מניחים את המנה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עד gelation הוא ציין.
מכינים רצועה שנייה המכילה תאי בקרה בצלחת תרבות שנייה ומ מניחים אותה באינקובטור. כאשר gelation הושלם, להוסיף שלושה עד ארבעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מחומם COS-1 מדיום תרבות מלאה לכל מנה המכילה את רצועות תא קולגן מסוננים למקם אותם באינקובטור. השתמש אזמל דק או מסוק רקמות לחתוך את רצועות תא קולגן כדי ליצור חתיכות מרובעות קטנות, 400 עד 500 מיקרומטר אורך.
מעבירים את כל החלקים מאותו מצב transfection לצלחת פטרי המכילה שלושה עד 3.5 מיליליטר של תקשורת תרבות עצבית. בדוק תחת מיקרוסקופ ניתוח את איכות החלקים והצב את הכלים באינקובטור. השתמש במספריים כדי לחתוך קרני עובר ביום עוברי 16.5 מן חלל הבטן של חולדה נקבה בהריון הקריב למקם אותם לתוך צלחת פטרי גדולה המכילה חיץ HBSSg קר.
מניחים את המנה במכסה המנוע לזרימת למינאר ולהשתמש מדפים ישרים כדי לחלץ את העוברים ומניחים אותם לתוך צלחת חדשה המכילה HBBSg קר. עם מטלפים קטנים, להסיר את העור, ולאחר מכן עם מדפים מעוגלים וישרים, בזהירות לנתח את המוח ואת המקום לתוך צלחת המכילה HBSSg קר. תחת מיקרוסקופ מנתח, באמצעות אזמל או מספריים עדין, לחתוך את המוח לשניים לאורך קו האמצע כדי להפריד בין שתי ההמיספרות.
לאחר מכן, להסיר את diencephalon ועם מ forceps בסדר, להסיר קרום המוח וכלי הדם מן חלקי המוח. השתמש 100% אתנול כדי לנקות את כל החלקים של מסוק הרקמות, במיוחד צלחת חיתוך PTFE ואת סכין הגילוח ולשמור את מסוק הרקמה במכסה המנוע שטף למינאר תחת תאורת UV במשך 15 דקות. מעבירים כל חתיכת רקמה לצלחת החיתוך של מסוק הרקמות.
לאחר הרקמה כבר קצוץ, להעביר את החלקים מן 35 מילימטר צלחות פטרי מלא שלושה עד ארבעה מיליליטר של NCM מלא. באמצעות מחטי טונגסטן בסדר, לסיים את ניתוח הרקמה NCM מלא. בדוק את איכות הפרוסות המתקבלות תחת המיקרוסקופ המ לנתח, לוודא כי השכבות ניתנות לזיהוי בבירור באופטיקה השדה הכהה לנתח את האזור של עניין עם מחטי טונגסטן.
שמור על חתיכות באיכות טובה במדיום NCM שלם באינקובטור פחמן דו חמצני. הדגמה חזותית היא קריטית בצעדים הקשורים להכנת התרבויות המקלות על המילים להבין את התהליך. מניחים כמה צלחות תרבות סטריליות ארבע היטב במכסה המנוע לזרימת למינאר ולהכין תערובת קולגן עובד כמו קודם לכן.
מוסיפים 15 עד 20 מיקרוליטרים של תערובת ההידרוגל לתחתית כל באר כדי לייצר בסיס קולגן עגול. מניחים את הכלים באינקובטור עד ג'לציה מלאה נצפתה. ותבדוק את האיכות של הקולגן עם הג'ל.
עם פיפטה, להעביר חתיכה קטנה של COS-1 תא צבירה על בסיס הידרוג'ל, ולאחר מכן להשתמש פיפטה למקם חתיכת רקמה על אותו בסיס, קרוב לחתיכת התאים לצבור במרחק של גודל explant אחד. לאחר הכנת תערובת קולגן עובדת חדשה על קרח, בעדינות pipette 15 כדי 20 microliters של תערובת חדשה זו כדי לכסות את explant ואת הצבירה התא, מה שהופך כריך כמו תרבות הידרוג'ל. השתמש מחט טונגסטן בסדר לכוון מחדש את explant כך שהוא פונה הצבירה התא ב 500 כדי 600 מיקרומטר.
מחזירים את הצלחת לאנקובטור עד שהג'לציה נצפית ולאחר מכן מוסיפים 0.5 מיליליטר של NCM שלם בתוספת 2%B27 תוספת ולשמור תרבויות במשך 36 עד 48 שעות באינקובטור. כאשר האקסונים ההיפוקמפוסיים התעמתו עם Netrin-1, הם גדלו באופן מועדף כלפי המקור של Netrin-1, המציין כי Netrin-1 פועל כמו מולקולה אטרקטיבית כימותרפיה עבור אקסונים אלה. במצב הבקרה, או transfection מדומה, כל האקסונים גדלו באופן רדיסטי, ללא כל העדפה כיוונית.
כאשר אקסונים ההיפוקמפוס התעמתו עם תאי הפרשת Sema3E, רובם גדלו מול צבירת התא, המציין כי Sema3E פועל כמו מולקולה דוחה כימותרפיה עבור אקסונים אלה. ייצוג סכמטי זה של שיטת התגובה והכימות האקסונאלית מראה כי בתנאי בקרה, האקסונים חולקו באופן שווה הן ברביעים הפרוקסימליים והן ברבעים הדיסטליים, המוצגים עם תרביות רדיאליות. זה הצביע על יחס דיסטלי או PD פרוקסימלי של אחד.
כאשר explants הראו מספר גדל של אקסונים ברביע הפרוקסימלי בהשוואה דיסטלי, המציין משיכה כימותרפיה, יחס PD היה גדול יותר מאחד. כאשר מספר האקסונים היה גבוה יותר ברביע הדיסטלי מאשר ברביע הפרוקסימלי, מה שמצביע על דחייה בכימותרפיה, יחס ה- PD היה נמוך מאחד. בעקבות שיטה זו, חוקרים יכולים להשיג מידע חיוני על התפקיד של מולקולות מסוימות במהלך התפתחות עצבית, אשר מאפשר לנו להקים נקודת התחלה כדי לחקור עוד יותר את הפונקציות.
למרות טכניקה זו שימושית בהתפתחות עצבית כמו זה, זה יכול להיות מיושם גם הקרנה תרופתית, אנגיוגנזה, הנדסת רקמות כמו אסטרטגיות.
