이 방법은 신경 시스템 개발 중 축 상 안내 및 신경 이동에서 일부 분자의 역할을 분석 하기 위해 유용. 이 기술의 주요 장점은 결과의 분석이 빠르고 간단하며 연구원을위한 많은 교육을 암시하는 복잡한 소프트웨어가 필요하지 않다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실과 나 자신에서 기술자 인 Mirian Segura-Feliu가 될 것입니다.
플레이트(200)를 시작하기 위해, 000 COS-1 세포는 35mm 페트리 접시로 배양하고 세포 배양 인큐베이터에서 완전한 배양 배지를 배양하여 하룻밤 사이에 70~80%의 인플루언스를 판독한다. 다음 날, 지방성 기반 형질 전환 방법을 사용하여 후보 분자를 코딩하는 DNA를 가진 COS-1 세포를 횡단한다. 먼저 혈청 프리 배지 250 마이크로리터와 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 1~2마이크로그램 DNA를 혼합하고 실온에서 5분간 배양합니다.
리포소말 튜브를 준비하려면 혈청 프리 배지 240 마이크로리터와 10 마이크로리터의 리포소말 트랜스펙트 시약을 추가하고 실온에서 5분간 배양합니다. 잠복 후, 입술 관에 DNA 튜브의 함량을 추가합니다. 실온에서 15분간 부드럽게 혼합하고 배양합니다.
배양된 세포의 배지를 혈청 프리 배지의 1.5 밀리리터로 교체한다. DNA 리포솜 혼합물을 천천히 추가하고 세포에 현명하게 떨어뜨립니다. 이산화탄소 세포 배양 인큐베이터에서 3시간 동안 배양한다.
인큐베이션을 완료한 후 배지를 완전한 배양 매체로 교체하고 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 0.1 어금니 덜벡코의 PBS로 세포를 헹구는 다. 각 접시당 800개의 마이크로리터 트립신 EDTA를 추가하고 이산화탄소 인큐베이터에 5~15분 동안 배양합니다.
완전한 배양 배지의 2밀리리터를 가진 분리된 세포를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 수집하고 동일한 배지의 10밀리리터를 추가합니다. 원심 분리는 5 분 동안 130 배 g에서 섭씨 4도에서 세포를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 얼음에 COS-1 세포를 포함하는 펠릿을 보존합니다.
콜라겐 작동 혼합물을 준비한 후, 콜라겐 혼합물의 100~150마이크로리터를 트랜스감염된 세포의 펠릿에 넣고 위아래로 배관하여 부드럽게 섞는다. 콜라겐 세포 펠릿 혼합물의 45 내지 50 마이크로리터를 35mm 페트리 접시에 퍼뜨리면 약 1 내지 1.5센티미터 길이의 콜라겐 세포의 균일한 밴드를 형성한다. 젤레이션이 관찰될 때까지 인큐베이터에 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 놓습니다.
제2 배양 접시에 제어 세포를 포함하는 두 번째 스트립을 준비하고 인큐베이터에 놓습니다. 겔화가 완료되면, 겔화 콜라겐 세포 스트립을 포함하는 각 접시에 3-4 밀리리터를 37섭씨 37도 의 완전한 COS-1 완전한 배양 배지를 추가하고 인큐베이터에 놓습니다. 미세 한 메스 또는 조직 헬기를 사용하여 콜라겐 세포 스트립을 잘라 작은 사각형 조각, 길이 400 ~ 500 마이크로 미터를 생성합니다.
동일한 경질 상태에서 모든 섹션을 뉴런 배양 배지의 3~3.5밀리리터를 함유한 페트리 접시로 옮는다. 해부 현미경으로 조각의 품질을 확인하고 인큐베이터에 요리를 배치하십시오. 가위를 사용하여 배아 날에 배아 뿔을 절단 16.5 희생 임신 한 여성 쥐의 복강에서 그들을 차가운 HBSSg 버퍼를 포함하는 큰 페트리 접시에 배치.
라미나르 플로우 후드에 접시를 놓고 직선 집게를 사용하여 배아를 추출하고 차가운 HBBSg가 함유 된 새로운 접시에 넣습니다. 작은 집게로 피부를 제거한 다음 곡선과 직선 집게로 조심스럽게 뇌를 해부하고 차가운 HBSSg가 함유 된 접시에 넣습니다. 해부 현미경에서, 메스 또는 미세 가위를 사용하여, 두 반구를 분리하는 중간 라인을 따라 반으로 뇌를 잘라.
그런 다음, 디엔셀론과 미세 한 집게로 제거, 뇌 조각에서 수막과 혈관을 제거. 100% 에탄올을 사용하여 티슈 헬기의 모든 부분, 특히 PTFE 절단 플레이트와 면도날의 모든 부분을 청소하고 15 분 동안 UV 조명 아래 라미나르 플럭스 후드에 조직 헬기를 유지합니다. 각 티슈 조각을 티슈 헬기의 절단 판으로 옮기다.
조직을 다진 후, 완전한 NCM의 3 ~ 4 밀리리터로 가득 35 밀리미터 페트리 접시에서 조각을 전송합니다. 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 완전한 NCM에서 조직 해부를 완료하십시오. 해부 현미경하에서 얻은 조각의 품질을 확인하여, 층이 어두운 필드 광학에서 명확하게 식별 할 수 있는지 확인하고 텅스텐 바늘로 관심 영역을 해부하십시오.
이산화탄소 인큐베이터에서 완전한 NCM 배지에 좋은 품질의 조각을 보관하십시오. 시각적 데모는 단어를 용이하게 하는 공동 문화권 준비와 관련된 단계에서 중요합니다. 여러 멸균 4 개의 잘 배양 플레이트를 라미나르 흐름 후드에 넣고 이전과 같이 콜라겐 작동 혼합물을 준비합니다.
하이드로겔 혼합물15~20마이크로리터를 각 웰의 바닥에 첨가하여 원형 콜라겐 베이스를 생성합니다. 완전한 젤레이션이 관찰 될 때까지 인큐베이터에 요리를 놓습니다. 그리고 겔화 콜라겐의 품질을 확인합니다.
파이펫을 사용하면 하이드로겔 베이스에 COS-1 셀 골재의 작은 조각을 옮은 다음 파이펫을 사용하여 동일한 베이스에 조직 조각을 배치하고, 하나의 절제 된 크기의 거리에서 집계되는 세포의 조각에 가깝습니다. 얼음에 새로운 작업 콜라겐 혼합물을 준비 한 후, 부드럽게 이 새로운 혼합물의 15 ~ 20 마이크로 리터를 피펫하여 엑사플랜트와 세포 골재를 덮어 하이드로겔 배양과 같은 샌드위치를 만듭니다. 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 500 ~ 600 마이크로 미터의 세포 골재에 직면하도록 식소를 재배치하십시오.
젤레이션이 관찰될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 반환한 다음 2%B27 보충제로 보충된 완전한 NCM의 0.5 밀리리터를 추가하고 인큐베이터에서 36~48시간 동안 배양을 유지합니다. 해마 축축이 Netrin-1에 직면했을 때 Netrin-1의 근원을 선호하게 성장시켰으며, 이는 Netrin-1이 이 축축을 위한 화학 요법 매력적인 분자역할을 한다는 것을 나타냅니다. 제어 조건 또는 모의 형질전환에서 모든 축축은 방향 적 선호없이 빛날 정도로 증가했습니다.
해마 축축이 세마3E 분비 세포와 마주쳤을 때, 그들 대부분은 세포 골재의 반대로 성장하여 Sema3E가 이 축종을 위한 화학 요법 분자로 작용한다는 것을 나타냅니다. 축 축 반응 및 정량화 방법의 이러한 회로도 표현은 제어 조건에서 축축이 방사형 아웃성장과 함께 표시된 근위 및 단발 사분면 모두에서 균등하게 분포되었다는 것을 보여줍니다. 이것은 하나의 근위 실산 또는 PD 비율을 나타냈다.
이출시 약탈에 비해 근해 사분면에서 축삭의 수가 증가하여 화학요법을 나타내는 경우, PD 비율이 하나 이상이었다. 축축물의 수가 근면에서보다 탈구 사분면에서 높았을 때, 화학요법을 나타내는 PD 비율은 1개보다 낮았다. 이 방법에 따라, 연구원은 우리가 기능을 더 탐구하는 출발점을 확립 할 수 있도록 신경 발달 중 일부 분자의 역할에 대한 필수 정보를 얻을 수 있습니다.
이 기술은 이기와 같이 신경 발달에 유용하더라도, 그것은 또한 전략으로 약리학 검열, 혈관 신생 및 조직 공학에 적용될 수 있었습니다.
