הפרוטוקול שלנו מציע מודל תלת-ממדי מהונדס ביולוגית המשפיע באופן הדוק על הרקמה הטבעית. זה יכול לשמש פוטנציאלית כדי לגלות טיפולים חדשים וסמנים ביולוגיים לטיפול נוירובלסטומה ואבחון. היתרון העיקרי הוא שהוא יוצר תנאי ניסוי רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות טכניקה הניתנת לשחזור המשיגה עקביות מאצווה לאצווה.
ניתן להשתמש בשיטת הפיגום שלנו ראשית, כדי לזהות טיפולים חדשניים לנוירובלסטומה, ושנית, לשלב תאים שמקורם במטופל לחיזוי טוב יותר של תגובת המטופל האינדיבידואלי. כדי להתחיל, הניחו את הפיגום המאוחסן ב-PBS לתוך מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להרים בעדינות את הפיגום מהפינה, ולחצו על הדופן כדי להסיר עודפי PBS.
לאחר מכן מניחים את הפיגום כשהשכבה המבריקה פונה כלפי מטה במרכז הבאר של צלחת לא דבקה בת 24 בארות. תייג את הלוח עם פרטים של קו התא, צפיפות הזריעה ונקודות הזמן. עבדו עם תאים בעלי צפיפות זריעה אחת בכל פעם, ושמרו על התאים הנותרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור, עד שיהיו מוכנים לשימוש.
לחיבור התא בפיגום השתמשו בפיפטת P20 עם קצוות סטריליים כדי לערבב היטב את מתלה התא, והוסיפו 20 מיקרוליטר של תרחיף התא הרלוונטי במרכז כל פיגום, כדי להבטיח שתרחיף התא יישאר על גבי הפיגום ולא על דופן או בסיס הבאר. אפשרו לתאים להיצמד במשך שלוש עד חמש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני ו-95% לחות. בסוף הדגירה, השתמשו בפיפט P1000 כדי להוסיף לאט מיליליטר אחד של מצע גידול שחומם מראש לכל באר, כדי למנוע תזוזה של הפיגומים, ולדגור על הצלחת למשך הלילה.
שימו לב לפיגומים, בתחילה, כל יומיים-שלושה לשינויי צבע של מדיום הגידול כאשר התאים מתרבים בתוך הפיגומים. השתמש אקדח פיפטה 10 מיליליטר עם מצב איטי כדי להסיר ולהשליך מיליליטר אחד של המדיום בילה מן הבאר. כאשר התווך המותנה משמש לניסוי, אספו את התווך המשומש של ההעתקים הביולוגיים בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר, ושפכו את פסולת התא באמצעות צנטריפוגה.
מעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי ומאחסנים את הצינור בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הגדרת אקדח פיפטה על מצב טפטוף, להוסיף בעדינות שני מיליליטר של מדיום צמיחה שחומם מראש לפיגומים. דוגרים על הצלחת המכילה פיגומים ומחדשים את התווך הטרי למשך תקופת הגידול הרצויה, כפי שמוכיח.
במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, יש לעקר את מגיב בדיקת הכדאיות התאית המתאים על ידי סינון דרך מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה. מחממים מראש את התמיסה הסטרילית, מצע צמיחה מלא וPBS סטרילי באמבט המים, ב 37 מעלות צלזיוס. בעזרת פינצטה סטרילית, מעבירים את הפיגומים לניתוח בצלחת טרייה בת 24 בארות, ומתייגים את הצלחת בכל הפרטים הרלוונטיים.
מוסיפים 900 מיקרוליטר של מצע הגידול המחומם מראש לכל באר. לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של מגיב קיימא התא סטרילי לכל באר. עבור בקרה שלילית, להוסיף 900 מיקרוליטר של בינוני ו 100 מיקרוליטר של מגיב קיימא התא סטרילי בבאר ללא פיגומים.
החלף את המכסה בצלחת, וניער בעדינות את הצלחת במשך כשלוש דקות כדי לפזר את מגיב הכדאיות התא המדולל ברחבי הבאר. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות. לאחר הוצאת הצלחת מהאינקובטור, נענעו בעדינות את הצלחת למשך מספר שניות ויצרו את הטריפליקטים, כפי שמודגם בכתב היד של הטקסט.
צור את הטריפליקטים הטכניים על ידי העברת 100 מיקרוליטר של התווך ומגיב המודגר מבאר אחת של צלחת 24 הקידוחים לבאר אחת של צלחת 96 בארות שקופה, ובצע שלב זה בסך הכל שלוש פעמים עבור באר אחת. כסו את הצלחת בעלת 96 הבארות ברדיד אלומיניום כדי להגן על מגיב הכדאיות של התא מפני אור. מוציאים ומשליכים את 700 המיקרוליטרים הנותרים של מדיום וריאגנט מהפיגומים בצלחת 24 הקידוחים.
שטפו כל פיגום פעמיים במיליליטר אחד של PBS סטרילי. השתמש בקורא microplate כדי למדוד את הספיגה ב 570 ו 600 ננומטר, ולחשב את אחוז ההפחתה של ריאגנטים כדאיות התא בהתאם להמלצות היצרן. נתח סטטיסטית את תוצאות כדאיות התא, באמצעות תוכנה מתאימה.
הזן את הערכים הביולוגיים המשולשים כדי ליצור קווי שגיאה ולציין את השתנות המבחן. לבצע ניתוח חד-כיווני של בדיקת שונות כדי לבחון את השינויים בכדאיות התא לאורך מסגרת הזמן של הניסוי באמצעות תוכנה ביוסטטיסטית מתאימה. ציין הבדלים משמעותיים בין נקודות הזמן בגרפים, כמתואר בכתב היד של הטקסט.
הוערכה הכדאיות של שני קווי תאי נוירובלסטומה, KellyLuc ו-IMR32, שגדלו על הפיגומים. צפיפות התאים המוגברת הביאה להפחתה רבה יותר של מגיב הכדאיות התא עם הזמן. גדילת התאים על הפיגומים נמדדה בעקיפין על ידי כימות הדנ"א שהופק מהפיגומים, וחושבו התאים לכל דגימה.
תאי IMR32 הראו צמיחה מוגברת, ולאחר מכן תאי KellyLuc, עם הזמן. מורפולוגיית הגדילה והתפלגות התאים על הפיגומים הוערכו חזותית על ידי צביעת המטוקסילין, אאוסין ואימונוהיסטוכימיה. תאי KellyCis83 גדלו מהר יותר וחדרו עמוק יותר לשני הרכבי הפיגומים, מאשר לקו תאי קלי הפחות פולשני.
IMR32 שגדל על ננו-הידרוקסיאפטיט הדגים דפוס גידול מנוגד עם צבירים גדולים וצפופים, במשך 14 יום. התכונות הספציפיות לתאים נוטרו על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית, ולאחר מכן צביעת פלואידין ו- DAPI, ושפע האקטין נצפה בתאי Kelly ו- KellyCis83 על פיגומים קולגן-גליקוזאמינוגליקן. לצורך הערכת הפעילות התאית במבחנה, נמדדו רמות מופרשות של כרומוגרנין A, והתאים שגדלו על פיגומים של קולגן-גליקוזאמינוגליקן וננו-הידרוקסיאפטיט קולגן הפיקו יותר כרומוגרנין A בהשוואה לגידול בתרבית דו-ממדית קונבנציונלית.
קו התאים העמיד לכימותרפיה KellyCis83 הפריש יותר כרומוגרנין A מאשר קו תאי קלי. לאחר התקשרות התא, תאים יכולים להיות מטופלים עם טיפולים שונים. זה יספק תוצאות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית לתגובת התאים לתרופות מאשר תרבית דו-ממדית קונבנציונלית.
טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור טוב יותר כיצד תאים סרטניים מתנהגים ומגיבים לגירוי בתוך המיקרו-סביבה של הגידול, החל מתגובה לטיפולים או אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים.
