Name: culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds
Uploaded: 2018-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

למחקר שמתבצע על ידי המחברים נתמך בחלקה על ידי מענקים מן האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם מס 229239 ומן קרן אאו, גישוש מחקר שיתופי מחקר תוכנית חריפה הסחוס פציעה/הנגע/פגם (ה-CRP ACI) תחת הפרויקט Bioactive, פיגומים ביונים עבור התחדשות הסחוס (BIOCART).

1. עצמי וההספק פפטיד לגרדום (לטמבלים) הכנה
<ol><li>להכין פתרון 0.5% של פפטיד RAD16-אני ב- 20% (w/v) סוכרוז, צינור מיקרו-צנטריפוגה. Sonicate הפתרון פפטיד עבור 20 דקות באמבט אולטראסוני-כוח מרבי, בטמפרטורת החדר (RT) כדי להבטיח ערבוב הומוגנית. הערה: הנפח של פתרון להיות מוכן יהיה תלוי המספר של בסיס הרצוי. RAD16-אני פפטידים אינם סובלים השפלות בתנאים אלה sonication.</li>
	<li>לדלל את הפתרון פפטיד מוכן בשלב 1.1 עם נפח נחוץ סוכרוז 10% (w/v) כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי. הערה: גורם חשוב שיש לקחת בחשבון הוא ההתאמה של הריכוז ההתחלתי פפטיד מאז הקשיחות מטריקס הסופי יהיה תלוי בפרמטר זה. RAD16-אני פפטיד פתרון צריך להיות 2 x יותר מרוכז יותר הריכוז הסופי הרצוי של הבונה תלת-ממד. בדרך כלל, RAD16 האחרון-אני ריכוזים פפטיד המשמש הן בין 0.15 – 0.5% (w/v).</li>
	<li>מקם את הצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את הפתרון פפטיד לתוך באמבט אולטרא-RT במשך 20 דקות כדי להבטיח ערבוב הומוגנית. הערה: הפתרון פפטיד, אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, ניתן לאחסן במשך כמה חודשים ב 4 º C.</li>
</ol>2. התא ההשעיה הכנה
<ol><li>Centrifuge התליה תא (שהושג לאחר הטיפול טריפסין) 60 x g ו- RT במשך 5 דקות.</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של פסטר חיבור לקו ואקום והשהה בגדר תא ב- 3-5 מ של 10% (w/v) סוכרוז באמצעות של micropipette. להמשיך לספור תאים באמצעות מונה תא הידנית או האוטומטית. הערה: הפתרון סוכרוז 10% (w/v) היא מדיום מול, ללא יונית זה מאפשר תחזוקה התא ומונעת פפטיד gelation במהלך תהליך ערבוב.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא 60 x g ו- RT עבור 5 דק. הסר תגובת שיקוע והשהה בגדר תא שוב בהיקף הדרוש של 10% (w/v) סוכרוז להשיג להכפיל את הריכוז תא הסופי הרצוי (recommendable כ 4 x 106 תאים / mL).</li>
	<li>הכנס מספר הרצוי של תרביות רקמה מוסיף כל טוב של צלחת 6-טוב (אחד insert לכל כימוס).</li>
	<li>Sonicate הפתרון פפטיד מוכן בשלב 1 כוח מרבי, RT במשך 5 דקות.</li>
	<li>פיפטה, המקום µL 40 של התליה תא (להשיג ב- 2.3) עבור כל כימוס הרצוי ובנוסף כ- 10 – 15% נפח נוסף לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה רגילה.</li>
</ol>3. תלת-ממד תא כימוס לתוך לטמבלים
<ol><li>לערבב של נפח שווה RAD16-אני הפתרון ב 10% סוכרוז (w/v) (40 µL לכל כימוס) עם אמצעי אחסון שווה של התליה תא (40 µL לכל כימוס) מוכן בשלב 2 כדי לקבל השעיה של תאים ירידה בריכוז פפטיד הרצוי (ב 10% סוכרוז). מערבבים על-ידי pipetting באיטיות לאורך כ 10 פעמים. למנוע היווצרות בועה במהלך ערבוב. הערה: שלב זה הוא קריטי, חייב להתבצע בזהירות רבה מאז התאים נמצאים בתנאים עוינים עקב פפטיד pH נמוך (כ 3.5-4.0).</li>
	<li>שימוש של micropipette, טען בקפידה µL 80 של ההשעיה כל הוספה.</li>
	<li>להוסיף 0.5 מ"ל של תרבות התקשורת לתחתית הבאר להרטיב את הכנס רפידה, המאפשר תקשורת דיפוזיה לקדם פפטיד הרכבה עצמית ויצירת הידרוג. תן את פפטיד ג'ל למשך כ 20 דקות בארון זרימה. הערה: המניפולציה של הדגימות במהלך הגדרת זמן יכול להסתיים שבירת ג'ל.</li>
	<li>לאט לאט להוסיף 40 µL בינוני הכנס ולתת לו להחליק החומה הפנימית לג'ל. הערה: בדרך כלל, הטעינה של אמצעי אחסון זה צריך לקחת בין 20 – 30 s.</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) במשך 20 דקות. זה שלב ותוספות בינוני רצופים יעדיפו שטיפת של סוכרוז, equilibration של תאים עם תרבות בינוני.</li>
	<li>להוסיף µL 60 בינוני החומה הפנימית של הקדמי, ולאפשר לו לזרום מטה לאורך הקיר. האחות המדיום של הבאר, שהינו עשיר סוכרוז, ולהוסיף 0.5 מיליליטר בינוני טריים.</li>
	<li>להוסיף µL 60 בינוני לאט הכנס ולמקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) למשך 10 דקות.</li>
	<li>האחות המדיום היטב ולהוסיף 2.5 מ ל בינוני טריים לתוך הבאר. להוסיף 200 µL בינוני תותב. מקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) כדי לשמור את התאים בתנאים המתאימים.</li>
	<li>לשנות את המדיום כל יום. הסר את המדיום הישן מתחתית הבאר. להוסיף 2.5 מ ל בינוני טריים µL טוב ל- 200 הכנס. הערה: אם תאית התמיינות נמשכת, התקשורת inducing ספציפיים יתווספו התרבויות, וכתוצאה מכך המחויבות סוג התא הרצוי (ראה להלן, תא בידול).</li>
</ol>4. תא הכדאיות ב- 3D-לטמבלים
<ol> <li>הערה: תא הכדאיות וזמינותו ידועה בשם המתים/Live — הכדאיות/Cytotoxicity assay גם כן.</li>
	<li>בשפופרת 15 מ"ל, להכין את אמצעי האחסון הדרושים של פתרון טריים של calcein מיקרומטר 2 בבוקר ו- 2 מיקרומטר של אתידיום homodimer-1 (EthD-1) ב- PBS מאת vortexing עבור 10 ס' לשמור בחושך. הערה: עוצמת הקול כדי לשמש עבור כל דגימה יהיה תלוי בגודל טוב על פי האפשרויות הבאות: mL 2 עבור כל טוב של צלחת 6-multiwell; 1 מ"ל לכל אחד טוב של צלחת 12-multiwell ו- 0.5 מ עבור כל טוב של צלחת 24-multiwell.</li>
	<li>שימוש של micropipette, לשטוף את הדגימות 3D-לטמבלים 3 פעמים עם 2 מ"ל ל- PBS, ואז, לכסות את זה עם הפתרון המוכן בשלב 4.1. תקופת דגירה זה ב RT של 40 דקות בחושך.</li>
	<li>שימוש של micropipette, יש לשטוף את בונה עם 2 מ של PBS 5 פעמים.</li>
	<li>דמיינו את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות באמצעות 10 X או 20 X הגדלה.</li>
</ol>5. תאית התמיינות
<ol><li>התרבות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) ב Chondrocyte הבזליים בינוני (CBM) עם צמיחה תוספי. הערה: הכנת המדיום מתואר בהוראות היצרנים (ראו טבלה חומרים).</li>
	<li>זירוז תאית התמיינות ביום 2 עם chondrogenic בינוני המכיל רקומביננטי האדם צורה של גורם גדילה-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), חומצה אסקורבית L 2-פוספט [AA2P] (25 µg/mL), דקסמתזון (100 ננומטר).</li>
	<li>לשמור על התרבות 4 שבועות באינקובטור עם אווירה humidified-CO 37 ° C ו-5%2. שינוי chondrogenic בינוני בכל יום אחר.</li>
</ol>6. טולדין כחול (TB) מכתים
<ol><li>לשטוף את התרבויות 3D-לטמבלים פעמיים על-ידי הוספה והסרה ואז 2 מ של PBS עם micropipette. לתקן אותם על-ידי הוספת 2 מ של 2% (w/v) p-פורמלדהיד ב- PBS עבור 2 h-RT.</li>
	<li>לשטוף פעמיים עם 2 מ של 0.1% X-100 Triton ב- PBS (PBST).</li>
	<li>דגירה 2 מ של טרה-בתים 0.05% במים למשך 20 דקות ב- RT.</li>
	<li>לשטוף מספר פעמים (לפחות 3 פעמים) עם 2 מ של PBS עד הפתרון PBS הוסר ברור.</li>
	<li>ניתוח דוגמאות על ידי בדיקה חזותית תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי11,13,14. הערה: טרה-בתים יוצרת קומפלקסים עם glycoconjugates anionic-מטריצה חוץ-תאית, כגון proteoglycans (עמוד), glycosaminoglycans (איסור פרסום), אשר מופרשים בעיקר על ידי תאים, כמו chondrocyte. דוגמאות חיוביות הן מוכתם כחול.</li>
</ol>7. תספיג חלבון
הערה: ההליך בשימוש פרוטוקול זה תוארה בעבר התייחסות11.
<ol><li>Lyse 3D-בונה ב ריפה מאגר המכיל פרוטאז מעכב קוקטייל על-ידי pipetting.</li>
	<li>הכנת ג'ל אקרילאמיד בהתאם לדרישות של אמצעי אחסון ג'ל (של ציוד ריצה ג'ל ספציפי) ולהפעיל את lysates תא במשך 90 דקות ב 150 V16. הערה: ג'ל אקרילאמיד מוכן בדרך כלל בריכוז של 7.5-10% (w/v), תלוי משקל מולקולרי של החלבון.</li>
	<li>העברת החלבונים הכלול את הג'ל לתוך קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene על-ידי החלת ארבעים V 2 h-RT.</li>
	<li>דגירה קרום PVDF-RT עבור 2 h במאגר חסימה (4% (w/v) ללא שומן אבקת חלב ב- PBST) במיכל נפרד עם נפח מספיק כדי לכסות את הקרום.</li>
	<li>דגירה הקרום-RT מאובטח עם נוגדנים ראשי-ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ב- PBST. עיין בטבלה חומרים.</li>
	<li>להוסיף נוגדנים משניים ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. ראו טבלת חומרים.</li>
	<li>הכינו את הקרום לגילוי hP עם המצע Chemiluminescent16. עיין בטבלה חומרים.</li>
	<li>קח תמונות chemiluminescent16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בעבר, הקבוצה שלנו ואחרים תיארו את השימוש פלטפורמות תרבות תלת מימדי (3D) עם תא מגוון מערכות3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מתארים שיטה קלה ומהימנה של קבלת התרבות 3D תאי גזע מערכות המתאימים לכל סוג של תאים בתרבית של כולל לכל סוג של תא פונקציונלי, עובריים או למבוגרים, או בסופו של דבר, תאים מתפקדות מבודד ביופסיות או גידולים, וכן הלאה. בנוסף, באופן עצמאי, אם בתאי גזע עובריים או מבוגר המקור יהיה להם קיבולת מחויבות שושלת היוחסין טוב יותר בסביבת 3D מאשר התרבות הקלאסית 2D מנות10,11,12, 13,14,15. לכן, התרבות תאים במערכת זו תוביל בידול לתוך מבנים דמויי רקמה תפקודית שיכול לשמש ביישומים שונים, מן וההתערבות תיקוני או משובי כדי רעילות פלטפורמות תרופתי.
הראו לנו רווח ברור בתפקוד התא. כי microenvironment תאית דומה לזה של רקמות טבעי מבחינת מבנה מטריצה של ביו-מכני, biophysical, ביולוגי פרמטרי. יחד עם זאת, המערכת הופך מורכב יותר, מספר הפרמטרים שצריכים להיות מוסדרים גם עליות, אשר כוללת את הצורך פלטפורמה התומכת חיצוניים (כגון מערכת זלוף פעיל כדי למנוע בעיות תופעות הקשורות בהעברת המוני ). תאים בתרבית three-dimensionally לבצע טוב יותר מבחינת וויסות פעולות חיוניות, כגון העברה, התפשטות, בידול. הם יכולים יוצרים רשתות מורכבות ומאפשר crosstalk הסלולר משופרת, וזה עד כה חיוניים תולדה של וגדל המבדילים ב- 3D. העובדה כי הורס יכול ליצור תנאים במבחנה דומה מייצג חלבונים אלה מטריצה חוץ-תאית יתרון שכן מחקר רציונלי של האפקט הפיק עבור כל רכיב המתווסף לגרדום (פקטורי גדילה, רב-סוכר או איתות פפטיד) יכולים להיות מועברים בקלות.
היתרונות ברורים של השימוש של אידיוטים בהשוואה פיגומים טבעיים אחרים, כגון קולגן מסוג I ו- Matrigel, הם הבאים: 1) לטמבלים הוא biomaterial סינתטי עם וריאציה מינימלי של אצוות ייצור אצווה; 2) לטמבלים יש את היכולת להיות functionalized עם מוטיבים פפטיד ספציפי; ו 3) מתנות לטמבלים נמוך biodegradability במבחנה, דבר המאפשר שמירה על הבונה 3D עם אותם מאפיינים biophysical, ביו-מכני, מבניים לאורך זמן. עם זאת, המגבלה של שימוש הורס לעומת אחרים פיגומים נמצאו במהלך השלב כימוס, שבו התאים נמצאים סביבה עוינת בשל ה-pH נמוך. לכן, זה צעד קריטי המתודולוגיה המתוארת. יתר על כן, חשוב לקבוע ריכוז לטמבלים עבור כל סוג תאים מסוים לפני התחלת כל ניסוי. זה חיוני, למעשה, כאשר תאים מתורבתים או לתוך אלה biomaterials, מאז כל סוג לתא מסוים יציגו תנאי הגידול biomechanical אופטימלית.
לבסוף, אנו מאמינים פבריקציה נוספת לסוג זה של biomaterial לגרדום ועיצוב לשפר את פיתוח מודלים 3D רקמות פיזיולוגיים ואמין יותר כדי לעזור תעשיית התרופות לפתח גישות טיפוליות טוב יותר עבור רפואה רגנרטיבית, סרטן או כל טיפול רפואי.

במשך עשורים רבים, תרבית תאים בתרבית של בוצעה בתנאים ניסיוני באמצעות מערכות התרבות הקלאסית דו-ממדית (2D) עקב בעיות מעשיות וכלכליים בין ההיבטים הלא-פיזיולוגיים. למרות מערכת תרבות זו מסייעת ללמוד ולהבין מנגנונים מולקולריים וסלולריות ביותר, אנו יודעים היום פרדיגמות חדשות של התרבות תאים נדרשים ללמוד מערכות סלולריות מורכבים יותר. לכן, מערכות תלת מימד (3D) התרבות הן במקרה הצורך, כדי לשחזר את microenvironment biophysically, biomechanically וביולוגית דומה יותר לזה של רקמות טבעי. בשנים האחרונות, מערכות התרבות תלת-ממד, באופן כללי, הפכו להיות נפוץ יותר בקרב חוקרים והתעשייה מאז שהם מייצגים, מודל חדש של מחקר או הקרנה אילו תאים יכולים לגדול בחלל, ליצור לתא או תא-כדי-מטריקס אינטראקציות, העברה, בסופו של דבר להבדיל לתוך שושלות תאים מסוים.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לשחזר במבחנה הסלולר microenvironment כי הוא קרוב יותר microenvironment ויוו . בפרט, לגרדום פפטיד עצמית וההספק סינתטי (לטמבלים) הוא סוג של biomaterial עם מאפיינים ייחודיים; היא יוצרת רשת של נקבוביות בגודל ננומטר עשוי חלש אינטראקציות בין פפטידים בעלי תכונות מכניות ומבניים דומים לאלה של מטריצה חוץ-תאית טבעיים. במילים אחרות, הרציונליות מאחורי השימוש בחומר זה הוא שיוצר באמת 3D-סביבה זה הינו אידיאלי עבור קבלת מדומה 3D הרקמות או האיברים יחידות. עם זאת, והכי חשוב, ההקשר 3D מאפשר את מבנה תלת-ממד להשיג תפקודים ביולוגיים חדשים שאינם בדרך כלל נוכח התרבות 2D פלטפורמות, כגון מאפיינים הקשורים רקמות אדריכלות, תופעות העברה המונית, תא המתבנת ובסופו של דבר מורפוגנזה רקמות, אשר הם גורמי מפתח להמשך המחקר ופיתוח של רקמות פונקציונלי ואת האיברים1,2. יתר על כן, היתרון לטמבלים מעל עמיתיהם טבעי (קולגן, Matrigel) הוא שהם יציבים מאד בטמפרטורת החדר ו אינם דורשים תנאים מיוחדים עבור פוסט-פרודקשן, הפצה או אחסון3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. לטמבלים קל לטפל, בעת הצורך; ג'לים 3D ניתן להשיג בפשטות על ידי הגדלת כוח יונית, או על-ידי התאמת רמת ה-pH נייטרליות1,2. לבסוף, המתודולוגיה המתוארת כאן כבר בשימוש נרחב במבחנה לקידום וצמיחה, תחזוקה, של בידול של מספר סוגי תאים, כולל chondrocytes, hepatocytes, תאי אנדותל, תאי העצם, כמו גם תאים עצביים תאי גזע עובריים וגופניות3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מתארים את השימוש של מערכת תלת-ממד-תרבות להבדיל בין האדם chondrocytes במפרק המורחב (הע ח) לתוך רקמות הסחוס דמוי כפי שתואר לעיל11.
כאן, מתוארת שיטה התרבות תאים במערכת תלת-ממד באמצעות אידיוטים. ב הזה biomaterial סינתטי, התאים מעורבבים קודם עם פתרון פפטיד, אשר כתוצאה מכך מושרה להרכיב עצמית, יצירת רשת של מידות nanometric מסביב לתאים, ולכן יצירת סביבת 3D באמת (איור 1). חשוב לקחת בחשבון כי התנהגות הסלולר מושפע ערכים נוקשות מטריקס (קרי, הפצה, העברה ובידול). לכן, פקד מתודולוגי נפוצה היא התרבות תאים מעל לגרדום פפטיד עם אותם ערכי נוקשות (תרבות על שני ממדים).

<table><tbody><tr><td>Human articular chondrocytes (Ach)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td><td>Corning</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (tissue culture grade)</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture inserts (0.4 &amp;micro;m pore, 12 mm diameter)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3217</td><td></td></tr><tr><td>SingleQuots of Growth Supplements</td><td>Lonza</td><td>CC-4409</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D8893</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Human transforming growth factor-&amp;beta;1 (TGF-&amp;beta;1)</td><td>Millipore</td><td>GF111</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Invitrogen</td><td>LC 2005</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Actin</td><td>SCBT</td><td>sc-1615</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen I</td><td>Abcam</td><td>ab138492</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen II</td><td>Abcam</td><td>ab3092</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen X</td><td>Abcam</td><td>ab182563</td><td></td></tr><tr><td>Antigoat IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97051</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

טכניקה שימושית עבור culturing תאים עצמית וההספק nanofiber תלת מימד (3D) לפיגום מתואר. מערכת זו תרבות משחזר סביבה מקרוב מחקה את התכונות מבנית של הרקמה הלא מקוטב. יתר על כן, מבנה מסוים nanofiber מהותי לגרדום הופך שקוף לאור ויזואלי, המאפשר ויזואליזציה קל של הדגימה תחת מיקרוסקופ. יתרון זה שימש בעיקר ללמוד נדידת תאים, הארגון, התפשטות, ואת בידול ולכן כל התפתחות תפקוד התאים מסוים שלהם על ידי צביעת עם צבע מסוים או הגששים. יתר על כן, בעבודה זו, אנו מתארים את ביצועים טובים של מערכת זו ללמוד בקלות את redifferentiation של chondrocytes במפרק האנושי המורחב לתוך רקמות הסחוס. התאים היו מקופל לתוך עצמי בהרכבת פיגומים פפטיד, תרבותי בתנאים מסוימים כדי לקדם את chondrogenesis. תרבויות תלת מימדי הראו הכדאיות טוב במהלך 4 השבועות של הניסוי. כצפוי, דגימות תרבותי עם inducers chondrogenic (לעומת פקדים שאינם-induced) צבעונית מאוד חיובית טולדין כחול (אשר כתמים glycosaminoglycans (GAGs) כי הם מאוד נוכח מטריצה חוץ-תאית סחוס) והביע סמנים מולקולריים ספציפיים, לרבות קולגן סוג אני, II ו- X, על פי ניתוח המערבי כתם. פרוטוקול זה קל לבצע והוא יכול לשמש במעבדות מחקר, תעשיות, למטרות חינוכיות בקורסים מעבדה.

בשנת העבודה הנוכחית, פרוטוקול פשוט ומהיר לתאים תרבות תלת-ממד באמצעות לטמבלים מתואר כדי לקבל נתונים כמותיים אמינים. לטמבלים יוצר microenvironment תלת-ממד עם מאפיינים ייחודיים המאפשרים תאים בתרבית בתנאים הרצויים כדי להמשיך תחזוקה התא, הפצה ו/או בידול3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. בקבוצה שלנו, מספר מחקרים בוצעו באמצעות רקמת שומן אנושי הנגזר ובתאים (hAPC), chondrocytes במפרק האנושי המורחב (הע ח) ואנושי נורמלי עורי fibroblasts (hNDF) לתרבות, להרחיב, להבדיל אותם לתוך רקמת הסחוס כמו10,11,12. כאן, אנו מתארים את תרבות תלת-ממד, הבידול מחדש של האץ המורחב לתוך רקמות כמו סחוס, כפי שתואר לעיל11. לפיכך, אנו לתמצת התאים ב- 3D-לטמבלים, תרבות אותם במדיום אינדוקציה chondrogenic, כמתואר באיור 1 (ו בפרוטוקול). לאחר 24 שעות, הדגימות היו שקובעת הכדאיות עם וזמינותו הכדאיות/Cytotoxicity חי/מת. התוצאות מצביעות על אחוזים בודדים של תאים מתים (אדום) לאחר 5 ימים של כימוס, כמעט אין תאים מתים נצפו לאחר 4 שבועות של תרבות (איור 2). בשלב הבא, אנחנו מוכתם אותם גליקוזאמינוגליקן (איסור פרסום) להפקדה ב מטריצה חוץ-תאית באמצעות את טולדין כחול מכתימה את השיטה. כצפוי, הקבוצה אינדוקציה הגיב כראוי לטיפול, מראה חזק מכתים (איור 2).
לבסוף, סמנים מולקולריים של סמנים chondrogenesis ואת יתר, כולל קולגן מסוג I, II ו- X, נותחו על ידי תספיג חלבון (איור 3). סוג הקולגן שאני (COL1) נצפתה ב המערכות 2D and 3D אבל להקה התחתון של kDa ~ 130 (ייצוג החלבון COL1 בוגרת מעובד הניתנים להרכבה על מטריצות) נצפתה רק ב- 3D. תוצאה זו עולה בבירור כי תאים שעברו התמיינות בשלושה ממדים להמשיך בדרך יותר פיזיולוגית. למרבה הפלא, קולגן מסוג II (COL2) זוהה - כלהקה יחיד של מולקולרית המשקל הצפוי הנוכחי-מטריצה חוץ-תאית - רק ב מבנים תלת-ממד תרבותי בתנאים chondrogenic. לבסוף, קולגן מסוג X (COL10) התגלה ב- 2D ו- 3D בונה תרבותי בתנאים chondrogenic, המציינת מידה מסוימת של היפרטרופיה לאחר 4 שבועות של תרבות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של כימוס תא לתוך 3D-לטמבלים. ייצוג סכמטי העטיפה הע ח מתואר להשיג התאים התפזרו באופן אקראי בתוך 3D-הטיפשים. 1. הרכבה עצמית פפטיד לגרדום (לטמבלים) הכנה; 2. התא הכנה ההשעיה; 3- 3D-תא כימוס לתוך אידיוטים. שימו לב כי התרשים מראה רק צעדים 3.1 ל 3.4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> איור 2: תא chondrogenic וביצועים בידול בתרבויות 3D-לטמבלים. תא מכתים הכדאיות בנטילת 5 ימים ו- 4 שבועות של תרבות זוהה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (תאים חיים תאים מתים וירוק באדום). גודל ברים = 200 מיקרומטר. גנרל chondrogenesis מחויבות לאומדן טולדין כחולים מוכתמים (sulfated glycosaminoglycans בכחול) של מבנים תלת-ממד-לטמבלים בתרבית בתקשורת ובקרה chondrogenic. גודל ברים = 500 מיקרומטר. איור זה שונה מ- Recha ל'-סנצ'ו. et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> איור 3: קולגן, ביטוי II ו- X של האץ שעברו chondrogenesis. הע ח תרבותי של טפט-2D, 3D-לטמבלים לאחר 4 שבועות ב chondrogenic מדיה ופקדים היו שקובעת את הביטוי של קולגן מסוג I (COL1), קולגן מסוג II (COL2) ו קולגן מסוג X (COL10). הביטוי אקטין שימש של בקרה פנימית. איור זה שונה מ- Recha ל'-סנצ'ו. et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

culturing-mammalian-cells-in-three-dimensional-peptide-scaffolds

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Views.  Ramon Llull University. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.

Video: Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a complex three-dimensional (3D) microenvironment involving layers of cancerous and non-cancerous cells surrounded by an extracellular matrix (ECM). The ECM provides physical and biological support and contributes to disease progression, patient prognosis, and therapeutic response.
This paper describes a protocol for assembling a 3D scaffold-based system to mimic the neuroblastoma microenvironment using neuroblastoma cell lines and collagen-based scaffolds. The scaffolds are supplemented with either nanohydroxyapatite (nHA) or glycosaminoglycans (GAGs), naturally found at high concentrations in the bone and bone marrow, the most common metastatic sites of neuroblastoma. The 3D porous structure of these scaffolds allows neuroblastoma cell attachment, proliferation and migration, and the formation of cell clusters. In this 3D matrix, the cell response to therapeutics is more reflective of the in vivo situation.
The scaffold-based culture system can maintain higher cell densities than conventional two-dimensional (2D) cell culture. Therefore, optimization protocols for initial seeding cell numbers are dependent on the desired experimental timeframes. The model is monitored by assessing cell growth via DNA quantification, cell viability via metabolic assays, and cell distribution within the scaffolds via histological staining.
This model&#39;s applications include the assessment of gene and protein expression profiles as well as cytotoxicity testing using conventional drugs and miRNAs. The 3D culture system allows for the precise manipulation of cell and ECM components, creating an environment more physiologically similar to native tumor tissue. Therefore, this 3D in vitro model will advance the understanding of the disease pathogenesis and improve the correlation between results obtained in vitro, in vivo in&#160;animal models, and human subjects.

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

This paper lists the steps required to seed neuroblastoma cell lines on previously described three-dimensional collagen-based scaffolds, maintain cell growth for a predetermined timeframe, and retrieve scaffolds for several cell growth and cell behavior analyses and downstream applications, adaptable to satisfy a range of experimental aims.

מודל ביומימטי תלת מימדי במבחנה של נוירובלסטומה באמצעות פיגומים מבוססי קולגן

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Cancer Research

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Medicine

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo tissue repair. In these granular scaffolds, the innate porosity generated by the void space between microgels enables cell infiltration and migration. Controlling the void fraction and particle fraction is critical for MAP scaffold design, as porosity is a bioactive cue for cells. Spherical microgels can be generated on a microfluidic device for controlled size and shape and subsequently freeze-dried using methods that prevent fracturing of the polymer network. Upon rehydration, the lyophilized microgels lead to controlled particle fractions in MAP scaffolds. The implementation of these methods for microgel lyophilization has led to reproducible studies showing the effect of particle fraction on macromolecule diffusion and cell spreading. The following protocol will cover the fabrication, lyophilization, and rehydration of microgels for controlling particle fraction in MAP scaffolds, as well as annealing the microgels through bio-orthogonal crosslinking for 3D cell culture in vitro.

Minimizing the variability in the particle fraction within granular scaffolds facilitates reproducible experimentation. This work describes methods for generating granular scaffolds with controlled particle fractions for in vitro tissue engineering applications.

שליטה בשבר חלקיקים בפיגומי חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים עבור תרבית תאים תלת-ממדית

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

<meta charset="utf8"></head><body>מערכת תרבית משותפת תלת-ממדית דו-שכבתית מתקדמת לתאי אפיתל ופיברובלסטים

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: קידום מערכות קוקולטורה תלת-ממדית עם PVA-PCL ממברנות ננו-סיביות

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

מודל ביומימטי תלת מימדי במבחנה של נוירובלסטומה באמצעות פיגומים מבוססי קולגן

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

שליטה בשבר חלקיקים בפיגומי חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים עבור תרבית תאים תלת-ממדית

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות