עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH (HL118532, HL120142, CA187692), דוד &amp; לוסיל פקארד קרן, קמיל &amp; הנרי דרייפוס קרן, ואת בורוז ברוך הבא הקרן. ASP נתמכה בחלקה על ידי מלגת כבוד שרלוט אליזבת פרוקטר.

1. הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל של אינסולין, לדלל את המניות אינסולין אבקת עם חומצה הידרוכלורית 5 מ&quot;מ (HCl) ב DH 2 O (500 אינסולין מ&quot;ג ב 100 מ&quot;ל ממס). הכן 100 מ&quot;ל ממס על ידי הוספת 50 μl של מרוכז HCl ל -100 מ&quot;ל מים מזוקקים (DH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את פתרון 1x של PBS, לדלל 10x המלוח שנאגר-פוספט (PBS) פתרון מניות 1X עם DH 2 O בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את polydimethylsiloxane (PDMS) אלסטומר פתרון כדלקמן: מערבבים את prepolymer PDMS יחד עם הסוכן ריפוי בתוך 10: 1 (w: w) יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום תרבית תאים כדלקמן: עד 500 מ&quot;ל של מדיום הנשר שונה של המניות Dulbecco: תערובת מזין F-12 (DMEM / F-12), להוסיף 10 מ&quot;ל של סרום שור העובר סטרילי (FBS), 500 μl של מגיב גנטמיצין, ו 500 μl של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את אלבומין 1% שור (BSA) בתמיסה 1x PBS, להוסיף 1% (w: פתרון v) של אבקת BSA כדי 1X PBS ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של סוג שור לנטרל שאני קולגן, להוסיף 50 μl 10x תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) חיץ, 30 μl 0.1 N נתרן הידרוקסידי (NaOH), 30 μl המדיום הסלולרי תרבות, ו -400 μl של קולגן המניות כדי צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge צונן. מערבבים לאט על ידי pipetting למעלה ולמטה; למנוע החדרת בועות. כדי להסיר בועות, בקצרה צנטריפוגות את התערובת על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מקבע על ידי דילול 16% paraformaldehyde 1: 4 (v: v) ב 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון תיוג גרעינים על ידי דילול פתרון תיוג גרעיני מנייה 1: 1,000 (v: v) ב 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מלוח 0.3% פוספט שנאגר והדטרגנטים (PBST) פתרון על ידי ערבוב PBS 1x עם 0.3% (v: v) חומר ניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ חסימת ידי דילול עז בסרום 01:10 (v: v) 0.3% PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון נוגדן ראשוני של חלבון מסוים של עניין על ידי דילול הפרימרי נוגדן (למשל, קינאז נגד מוקדי הדבקה ארנב (FAK)) 1: 200 (v: v) בחסימת המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון נוגדנים משני על ידי דילול נוגדן פלורסנט מצומדות-בדיקה (למשל, עז נגד ארנב) 1: 1,000 (v: v) בחסימת המאגר. </li></ol> 2. הכנת חותמות אלסטומרי עבור 3D micropatterning הערה: בולי אלסטומרי נעשים עם PDMS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון PDMS באותו יחס כפי שמתואר בשלב 1.3 ומערבבים היטב. מניחים את התערובת בתא ואקום למשך 15-30 דקות כדי להסיר בועות אוויר אשר הוצגו במהלך תהליך ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון degassed לתוך פלסטיק לשקול סירה או צלחת פטרי המכילה מאסטר סיליקון כי הוא בדוגמת lithographically עם תכונות של הגיאומטריה הרצויה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לרפא פתרון PDMS ב 60 מעלות צלזיוס במשך ~ 12 שעות. הערה: המאסטרים סיליקון הם להתאמה אישית; פרוטוקול זה משתמש מבנים מלבניים עם ממדים של 50מיקרומטר x 200 מיקרומטר x 50 מיקרומטר במרווחים 200 מיקרומטר. מאסטרי סיליקון יכולים להתבצע באמצעות טכניקות photolithography סטנדרטיות. בקצרה, גידול photoresist מבוסס אפוקסי הוא ספין מצופה על גבי פרוסות סיליקון. מסכה המפרט את התכונות חותמת הרצוי מושם על גבי פרוסות סיליקון מצופה photoresist, אשר נחשף אז לאור UV. התכונות הרצויות לא חוסמות את המסכה נחשפות האור photoresist במקומות אלה הופך crosslinked, והשאר של ציפוי photoresist הוא מסיס וניתן נשטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר PDMS ריפא סביב התכונות הרצויות על המאסטר סיליקון, להסיר את PDMS ואדון ממיכל פלסטיק. פרד בזהירות את PDMS מן פרוסות סיליקון ולהסיר PDMS העודף מרחבי התכונות המוטבעות באמצעות סכין גילוח נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לחתוך את PDMS בדוגמת עם תכונות מוטבעות לתוך בולים מלבנים פרט (~ 8 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ) עם סכין גילוח. אחסן תכונה בצד למעלה הללו CLEצלחת פטרי 100 מ&quot;מ קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף לכך, השתמש פתרון PDMS כמתואר בשלב 1.3 לעשות תומך עבור בולים מלבני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות coater ספין, להפיץ ~ 2-3 גרם של הפתרון PDMS באופן שווה על צלחת 100 מ&quot;מ קוטר פטרי לרפא את PDMS עבור ~ 12 שעות ב 60 ° C כמו בשלב 2.1. לאחר מכן, באמצעות סכין גילוח, לחתוך את השכבה הדקה של PDMS למלבנים (~ 5 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ). הערה: שני תומך נדרש עבור כל חותמת PDMS עשתה צעד 2.3. התומך ניתן לאחסן בצלחת 100 מ&quot;מ קוטר פטרי שמכילה את חותמות PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הבולים ותומכים PDMS יכולים לשמש תרבית תאים, לעקר על ידי טבילה 70% אתנול ויבש באמצעות aspirator בתוך ארון בטיחות ביולוגי (מכסה מנוע תרבית תאים). </li></ol> 3. הכנת רקמות אפיתל 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגית, להוסיף טיפה של כ 50 μl של BSA 1% ב PBS בראש כל חותמת. מניח את האגל מכוסה בולים ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מיניאמא של 4 שעות על מנת להבטיח כי BSA adsorbs אל פני השטח של הבול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון BSA לשאוב מן בולי PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את פני השטח של בולים פעמיים עם תרבית תאים בינוניים (50 μl לכל לשטוף לכל חותמת צריך להספיק), aspirating אחרי כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפול בולי PDMS מעוקר תומך באמצעות פינצטה נירוסטה מעוקלת. בארון בטיחות ביולוגי, להוציא אחד 35 מ&quot;מ קוטר צלחת בתרבית רקמה לכל PDMS חותם. בכל צלחת, נשכב שתי תמיכות PDMS מופרדים על ידי מרחק מעט פחות מאורך של בולים PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה, לעקר coverslips זכוכית עגול כמו רבים (15 מ&quot;מ קוטר, # 1) כפי שיש בולים PDMS באמצעות אתנול 70%. לשאוב את הנוזלים העודפים coverslips תוך החזקת אותם בפינצטה. אחסן את coverslips שטף בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ קוטר נפרדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר ~ 50 μl של תערובת קולגן שווה לצפות את פני השטח של כל PDMS חותמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוףכל PDMS מצופה קולגן להחתים עם פינצטה ו להפוך אותם בעדינות. מנמיכים את הבולים הפוכה על גבי PDMS תומך ערוכים בתרבית רקמה 35 מ&quot;מ קוטר השביעו כך קולגן הוא בין חותמת והחלק התחתון של המנה בתרבית רקמה. דגירת המנות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר ~ 50 μl של תערובת קולגן הנותרים על כל אחד coverslips עגול (מאוחר יותר, אלה יוצבו על גבי רקמות מהונדסות כדי לתמצת אותם לחלוטין קולגן) דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג צלחת בתרבית רקמת 100 מ&quot;מ קוטר המכילה תאי אפיתל (לשעבר. EpH4 עכבר חלב תא אפיתל) ב ~ 40% confluency. לשאוב את המדיום תרבית תאים ולשטוף פעם עם 10 מ&quot;ל 1x PBS. הוסף 2 מ&quot;ל של טריפסין אל התאים לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מ&quot;ל של מדיום תרבות טרי כדי בצלחת בתרבית רקמה המכילה תאים trypsinized, ניתוק תאים חסיד הנותרים כל מצלחת. מערבבים בעדינות על ידי pipetting ולהעביר את התערובת לתא צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ&quot;ל ב 100 × גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מהצינור חרוטי ו resuspend התא גלולה במדיום תרבית תאים. באמצעות hemocytometer, לספור את התאים כדי לקבוע את הריכוז של השעיה. התאם את עוצמת ההשעיה לקבל ריכוז סופי של ~ 10 6 -10 7 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את דגימות קולגן בג&#39;ל מן החממה. באמצעות פינצטה, בעדינות להרים את בולי PDMS ישר כלפי מעלה כדי לנתק אותם מן קולגן היצוק וזורק אותן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר ~ 30 μl של השעית התא המרוכזת על פני השטח של כל ג&#39;ל המכיל קולגן חללים יצוקים של גיאומטריה רצויה. שים את התאים תחת מיקרוסקופ brightfield עם מטרת NA 10X / 0.25 ואילו צד טלטול המנות בעדינות לצד כדי לקדם תא שיקוע בתוך החללים. החללים צריכים להתמלא בתוך דקות ~ 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי rסר תאים עודפים מרחבי החללים, להטות כל מנה בתרבית רקמה על צידו בעדינות לוותר ~ 400 μl תרבית תאים בינוניים על פני השטח של ג&#39;ל קולגן. לשאוב את הנוזל וחזור על לשטוף 1-2 פעמים יותר, לבדוק את ג&#39;ל קולגן מתחת למיקרוסקופ בין כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים העודפים נוקו מכל רחבי החללים מלאי תא עובש קולגן, למקם את הכלים בתרבית הרקמה לתוך תרבית תאי חממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, באמצעות פינצטה, בעדינות להפוך את coverslips בכיתה מצופה קולגן ומניח אותם על גבי תבניות קולגן מלאת תא כזה כי קולגן מן coverslips טפסי כובע מעל החללים מלאי תא. דגירת הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כמוסות קולגן דבקו עובש קולגן מלא התא, לוותר ~ 2-2.5 מ&quot;ל תא בינוני תרבות באיטיות על coverslip זכוכית על גבי ג&#39;לים. תרבות הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 ימים. הערה:24 שעות לאחר זריעה הראשונית, ניתן לטפל ברקמות האפיתל עם גורמי גדילה כגון גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) או גורם גדילה hepatocyte (HGF) כדי לגרום הסתעפות. </li></ol> 4. Immunofluorescence וניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום תרבית תאים מן המנות בתרבית רקמה ולהוסיף פתרון מקבע מספיק כדי לכסות את הג&#39;לים המכיל תא. דגירה מנות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על שייקר ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מקבע, למלא את הכלים בתרבית רקמה עם PBS 1x, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על שייקר ב 200 סל&quot;ד. חזור פעמים עבור שלושה שוטף כולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתייג גרעינים: לשאוב את PBS מצלחת בתרבית רקמה ולהחליף עם פתרון Hoechst. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15-20 דקות. כדי להכתים עבור FAK או סמן אחר כי ניתן לזהות עם נוגדנים, דלג לשלב 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון התיוג הגרעיני ולשטוף את הגרם המכיל תאיםאלס שלוש פעמים עם 1x PBS כמו בשלב 4.2. ניתן לאחסן דגימות ויטראז ב PBS 1x ב 4 ° C עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים עבור החלבון של עניין: לשאוב את PBS מנות בתרבית רקמה, להוסיף 300 μl של 0.3% PBST, דגירה מדגם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS, לכסות את הג&#39;לים עם חסימת חיץ, דגירה על שייקר (200 סל&quot;ד) בטמפרטורת החדר למשך כ -4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את חיץ החסימה, לכסות את הג&#39;לים עם פתרון נוגדן ראשוני, דגירה על שייקר ב 200 סל&quot;ד הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון נוגדן ראשוני, ולהוסיף פתרון 0.3% PBST, דגירה על שייקר ב 200 סל&quot;ד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לשאוב PBST וחזור כל 30 דקות במשך 3-4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 4.7 ו -4.8, הפעם דוגר עם פתרון הנוגדנים משני. עוטפים את הכלים בתרבית רקמה עם רדיד אלומיניום על מנת למנוע photobleaching של נוגדנים משני. לאחר הפינהלשטוף l, ניתן לאחסן דגימות מוכתמות 1x PBS על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש דוגמאות, להשתמש מטרת NA 10X / 0.30 התמקדה midplane של רקמות אפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש בגרעיני תאים, דגימות קבעו את דימויה שסומנו בסמן גרעיני באמצעות מטרת NA 10X / 0.30 תחת תאורת UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש דגימות מוכתמות עבור חלבון של עניין, תמונה באמצעות מטרת NA 10X / 0.30 על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור מפות תדירות חלבון מכתים של רקמות מרובות (בדרך כלל 50 או יותר) של גיאומטריה ראשונית זהה, היבוא ראשון כל אחד את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה רגילה (ראה חומרים) ולהמיר אותם 8 סיביים בגוונים אפורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי סף תמונות אלה, להמיר אותם לפורמט בינארי (כלומר, halftone / שחור ולבן) על ידי הגדרת נקודת חיתוך בגווני אפור; grayscale ערכים מתחת לסף להיות שחורים, ואלה מעל הסף הפכו לבן. ואז, לשלבכל אחת מהתמונות בינארי הבודדות לתוך ערימת תמונה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לרשום את התמונות המוערמות (כלומר, ליישר או להתאים אותם) בתוכנת הניתוח. חבילות תוכנה לניתוח תמונה רבות מגיעות עם תוסף רישום זמין בחינם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכל תמונה בערימה כתבנית עבור היישור של התמונה הבאה, כך התמונות בערימה כולו מיושרות על ידי התפשטות. לבסוף, כיסוי (פרויקט) את התמונות בערימת התמונה המיושרת המבוססות על עצמה ממוצעת כדי ליצור תמונה אחת עם מפת תדר פיקסל. תמונה זו אז יכולה להיות בצבעים באמצעות תוכנה לעריכת תמונות של בחירת 10,11. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Affolter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+signaling+in+the+regulation+of+branching+morphogenesis.">PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis.</a> Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).</li><li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+stages+in+mammary+gland+development:+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis.">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).</li><li>Fata, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK(ERK-1,2)+pathway+integrates+distinct+and+antagonistic+signals+from+TGFalpha+and+FGF7+in+morphogenesis+of+mouse+mammary+epithelium.">The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium.</a> Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).</li><li>Ip, M. M., Darcy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+mammary+primary+culture+model+systems.">Three-dimensional mammary primary culture model systems.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).</li><li>Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+three-dimensional+models+to+study+mammary+gland+branching+morphogenesis+and+functional+differentiation.">Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).</li><li>Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+geometry+determines+sites+of+mammary+branching+morphogenesis+in+organotypic+cultures.">Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures.</a> Science. 314 (5797), 298-300 (2006).</li><li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+patterns+of+mechanical+stress+are+required+for+branching+morphogenesis.">Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).</li><li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mechanical+strains+and+stresses+around+quiescent+engineered+three-dimensional+epithelial+tissues.">Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues.</a> Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).</li><li>Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+tensile+forces+drive+collective+cell+migration+through+three-dimensional+extracellular+matrices.">Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices.</a> Sci Rep. 5, 11458 (2015).</li><li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+regulates+branch+initiation+and+extension+of+cultured+mammary+epithelia+via+Akt+and+Rac1+respectively.">PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively.</a> Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).</li><li>Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+and+alveolar+morphogenesis+of+primary+mammary+cultures+on+reconstituted+basement+membrane.">Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane.</a> Development. 105 (2), 223-235 (1989).</li><li>Hirai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+functions+as+a+key+morphoregulator+for+mammary+epithelial+cells.">Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells.</a> J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).</li><li>Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stroma+induces+branching+morphogenesis+of+engineered+epithelial+tubules.">Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules.</a> Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the initial architecture make this system amenable for the study of branching morphogenesis of epithelial cells. There are several critical steps in the protocol. The first is lifting the PDMS molds straight upwards from the gelled collagen prior to cell seeding. Any horizontal movement during this step will distort the cavities, and they will no longer retain the desired geometry. Then, after the cavities have been seeded with cells, it is important to carefully wash off any excess cells that remain on the surface, as these may interfere with the behavior of the patterned tissues, particularly if they are very close to the tissues. Washing too rigorously, however, may result in cells being washed out of the cavities. Lastly, in the final micropatterning step when the cell-containing collagen gels are being immersed in culture medium, it is important to add the medium slowly and directly on top of the coverslip. Adding medium to the side of the dish away from the coverslip may result in detachment of the coverslip and the collagen lid. Each of these steps needs to be performed with care to achieve the best results.
Over the past few decades, several culture models have emerged for the study of epithelial morphogenesis, many of which involve the ex vivo culture of intact organs or explants of organs. Major advantages of culturing tissue taken directly from an animal are that tissue architecture remains intact and that cell-cell interactions are maintained. However, these models are not readily amenable to studies investigating the specific effects of a particular cell type or physical microenvironment. Additionally, organs and organ explants can be fragile and difficult to culture ex vivo. Others used primary mammary epithelial cells12, in which gene expression can be more readily manipulated, though this method does not conserve in vivo tissue architecture. Moreover, like intact organs, these cells can also be difficult to culture for long periods of time5. There is a need, therefore, for more robust culture models of epithelial morphogenesis that can be more precisely controlled and readily perturbed to gather reproducible data. 
A widely used 3D cell culture technique is the formation of epithelial cell clusters embedded in collagen or other ECM proteins11,13. Disadvantages of this technique, however, include the inability to precisely control or predict the location of clusters within the gel, cluster size and shape, and branching sites. In addition, it is difficult to manipulate or measure the mechanical cues experienced by cells in different regions of the tissue clusters. Engineered tissues enable better control of these parameters.
The engineered tissue protocol described here is an easy to use, versatile, and reproducible 3D cell culture method that eliminates the heterogeneity commonly found in ex vivo culture systems and 3D clusters. Such engineered cell culture models provide a platform for more precise control of physical and biochemical signals, and results can be easily combined with computational models to predict the effects of perturbations or measure cellular forces using techniques such as traction force microscopy (TFM)9,10. A caveat of the model system, however, is that it does not completely replicate the cellular, chemical, and physical microenvironment within the mammary gland in vivo. Nonetheless, essentially all parts of the system are modifiable: including the cells used (in which gene expression can also be altered by transfection), tissue geometry, ECM composition, and other biochemical factors (ex. growth factors). Primary mammary epithelial cells can also be cultured in this system; they form a lumen and undergo branching morphogenesis from the same locations as immortalized cell lines7. Moreover, the model can be modified to incorporate other cell types to more appropriately represent the native mammary gland microenvironment14, or to investigate the underlying mechanisms that give rise to any branched organ.

ההתפתחות של רקמות אפיתל מסועפות, המכונות הסתעפות morphogenesis, מוסדרת על ידי נגזר תאים, פיסיים, וגורמים סביבתיים. בלוטת החלב, הסתעפות morphogenesis הוא תהליך חוזר ונשנה שדרכו מודרך נדידת תאים קולקטיבית יוצרת אדריכלות עץ דמוי. השלב הראשון הוא היווצרות ניצן ראשית ממנהל צינוריות החלב, ואחריו ייזום סניף ואת התארכות 1,2. פלישה של סניפים לתוך stroma שמסביב היא מושרה על ידי השחרור המערכתי של הורמוני סטרואידים בגיל ההתבגרות. ניצנים ראשוניים חדשים ולאחר מכן ליזום מקצות סניפים קיימים, ותהליך זה ממשיך ליצור עץ אפיתל 3. למרות אותות ביוכימיים רבים חשוב זוהו, הבנה מקיפה של מנגנונים ביולוגיים תא המנחים תהליך התפתחותי מורכב זה כרגע חסר. יתר על כן, מחקרים מכניסטית על ההשפעות של רמזים ספציפיים שקשה לפרק מן ההתנסותמפעלי in vivo, פרעות spatiotemporal מדויקות כפי ומדידות הם בדרך כלל לא אפשריים. תלת ממדי (3D) טכניקות תרבות, כגון תרבות איבר שלמה, organoids העיקרי, ומודלי תרבית תאים, הם כולים שימושיים באופן שיטתי חוקר את מנגנוני רקמת המורפוגנזה 4-6. אלה יכולים להיות שימושיים במיוחד לקביעת ההשפעות של גורמים ספציפיים בנפרד, כגון כוחות מכאניים אותות ביוכימיים, על מגוון רחב של התנהגויות תא, כולל הגירה, שגשוג, והבחנה. 6 דגמי תרבית תאים מהונדסים, בפרט, בקלות לאפשר ההפרעות של תאים בודדים microenvironment שלהם. מודל תרבות אחת כזו משתמש בגישה מבוססת microfabrication להנדס רקמות אפיתל חלב מודל עם מבנה 3D מבוקר בעקביות reproducibly יוצרות סניפים נודדים קולקטיבי כאשר מושרה עם אגורמי גדילה ppropriate. היתרון העיקרי של המודל הוא היכולת לתפעל בדיוק ולמדוד את ההשפעות של גורמים פיסיים ביוכימיים, כגון דפוסי לחץ מכאני, עם ביטחון סטטיסטי גבוה. טכניקה זו, יחד עם מודלים חישוביים, כבר נעשה שימוש כדי לקבוע את התרומה היחסית של אותות פיזיים ביוכימיים הדרכתו של התפתחות תקינה של רקמות אפיתל החלב epithelia קנים אחרים 7-11. אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לבניית רקמות מודל אלה, אשר יכול להתארך בקלות לסוגים אחרים של תאים תאי מטריקס (ECM) ג&#39;לים, ואשר משמש ככלי פוטנציאל בדיקה של הרפוי.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS curing agent</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Lithographically patterned silicon master</td><td>self-made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plastic weigh boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-115</td><td></td></tr><tr><td>100-mm-diameter Petri dishes</td><td>BioExpress</td><td>D-2550-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>American Safety Razor</td><td>620179</td><td></td></tr><tr><td>1:1 Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium : Ham&amp;rsquo;s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1)</td><td>Hyclone</td><td>SH30023FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine type I collagen (non-pepsinized)</td><td>Koken</td><td>IAC-50</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Curved stainless steel tweezers</td><td>Dumont</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-diameter tissue culture dishes</td><td>BioExpress</td><td>T-2881-6</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>BioExpress</td><td>C-3394-2</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter</td><td>Bellco Glass Inc.</td><td>Special order</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 1x Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300260</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H 9661</td><td>Resuspended in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O at 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse FAK antibody</td><td>Life Technologies</td><td>AMO0672</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Used for color-coding pixel frequency maps.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.</td></tr></tbody></table>

engineering three-dimensional epithelial tissues embedded within extracellular matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

סכמטית כללית של microfabrication רקמות אפיתל חלב סכימטי כללי של הליך microfabrication מתאר את זרימת העבודה הניסויית מוצג באיור 1. התוצאה הסופית היא מערך של רקמות אפיתל של גיאומטריה זהה וריווח מוטבעים לחלוטין בתוך ג&#39;ל ECM. ניסוי נציג משתמשת בתאי אפיתל החלב עכבר EpH4 בתרבית ג&#39;ל מסוג שור אני קולגן בריכוז של 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל. כדי להבטיח את האיכות הגבוהה של רקמות מהונדסות, הטכניקות המתוארות הפרוטוקול צריכים להיות במעקב צמוד. דמויות 2A ולהראות 2B נוף בהגדלה נמוכה וגבוהה של מערכים של בארות מלבניות כי כבר יצוקים לתוך טיפוס שאני קולגן ג&#39;ל לפני זריעת תאים. צורת הבארות נקבעה על ידי הצורה של התכונות על המאסטר סיליקון. חשוב להרים הדואר PDMS עובש היישר מן קולגן כדי לא לעוות את גיאומטרית החלל. איור 2C מציג בארות מלבנות טיפוס שאני קולגן ג&#39;ל כי מולא עם תאי אפיתל חלב (תאים עודפים נשטפו מעל פני השטח של קולגן). בדוגמה זו, היטב כל מלבני 200 מיקרומטר x 50 מיקרומטר מכיל כ 80-100 התאים. תוספת של גורמי גדילה גורם morphogenesis 24 שעות לאחר הזריעה, הרקמות ניתן לטפל עם גורמי גדילה כגון HGF או EGF ותרבותיים על פני כמה ימים לבנות מודל הסתעפות המורפוגנזה. בדרך כלל, סניפים מתחילים להיווצר מוקדם ככל 4 שעות לאחר גירוי גורם הגדילה. איור 3 א מציג תוצאות נציג מרקמות אפיתל החלב מלבני בתוך טיפוס שאני קולגן ג&#39;ל 24 שעות לאחר ההליך microfabrication, שלאחריו cells דבק קולגן זה לזה. אין סניפים הם נצפו לפני תוספת גורם גדילה. איור 3 ב מציגים רקמה מלבנה נציג שעברה הסתעפות 24 שעות לאחר התוספת של HGF ב 10 ng / ml. במקרה זה, סניפים להתרחש בקצות הרקמות (להבדיל באמצע), שבו התאים לחוות את הלחץ המכני הגבוה ביותר 9. רקמות מרובות של גיאומטריה ראשונית זהה באותו ג&#39;ל ניתן הדמיה מכן כדי לקבוע ממוצעי אוכלוסיית מיקום סניף ואורך סניף, המאפשרים ניתוח תפוקה גבוהה. מכתים Immunofluorescence לדמיין לוקליזציה חלבון מכתים immunofluorescence של מערכי רקמות במודל התרבות מאפשר לנו לקבוע לוקליזציה חלבון בתוך רקמה בביטחון סטטיסטי גבוה. איור 4 א מראה repre<html> תוצאות sentative מתוך רקמה מלבני חלב אפיתל הסתעפות המוכתמת עבור קינאז הדבקה מוקדים (FAK). יצירת מפות תדירות רקמות של גיאומטריה זהה יכול לשמש כדי לחזות לוקליזציה מרחבית הממוצע של חלבונים בעלי עניין בתוך הרקמות, אשר ניתן להשוות ל הלוקליזציה של חלבונים אחרים, כמו גם פעילות הסתעפות. איור 4B מראה מפה תדירה FAK מכתים ממוצע עבור 50 רקמות מראות העשרת FAK בקצים הקצרים של רקמות מלבניות, שם הסתעפות מתרחש בדרך כלל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי המתאר את הליך microfabrication. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> n-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig2.jpg" /> תמונות איור 2. שצולמו במהלך תהליך microfabrication. (א) נמוך (B) ותמונות שלב בניגוד והגברה גדולות של חללים מלבנים סוג אני קולגן שנוצרו באמצעות עובש PDMS אלסטומרי. (C) חללים מ (א) ו- (ב) מלאים תאי אפיתל חלב. ברי סולם, 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig3.jpg" /> איור 3. microfabricated רקמות עוברים הסתעפות morphogenesis. (א) התמונה ניגודיות שלב של microfabrication מלבני רקמת 24 שעות לאחר נציג. (ב) תמונה בניגוד שלב של מחדשרקמת מלבני presentative כי החלה לעבור הסתעפות 24 שעות לאחר תוספת של HGF ב 10 ng / ml. חיצים לבנים מציינים ענפים שהוקמו זה עתה. ברי סולם, 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig4.jpg" /> איור 4. מכתים Immunofluorescence של רקמות microfabricated. (א) מכתים Immunofluorescence עבור FAK בתוך רקמות אפיתל החלב לאחר תחילת הסניף. (ב) מפה תדירה מכתים FAK הממוצע ב -50 רקמות. ברי סולם, 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix at JoVE.com

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

כתב יד זה מתאר טכניקה רכה המבוסס ליתוגרפיה להנדס מערכים אחידים של תלת ממדי (3D) רקמות אפיתל של גיאומטריה מוגדרת מוקפות תאי מטריקס. שיטה זו ניתנת למגוון רחב של סוגי תאים והקשרים ניסיוניים מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה של משכפל זהה.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

engineering-three-dimensional-epithelial-tissues-embedded-within

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Views.  Princeton University.  כתב יד זה מתאר טכניקה רכה המבוסס ליתוגרפיה להנדס מערכים אחידים של תלת ממדי (3D) רקמות אפיתל של גיאומטריה מוגדרת מוקפות תאי מטריקס. שיטה זו ניתנת למגוון רחב של סוגי תאים והקשרים ניסיוניים מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה של משכפל זהה. 

Video: Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

ניתוח התקשורת בין ומונוציטים ו תאים סרטניים בשד ראשי במטריצה חוץ-תאית לחלץ (ECME)-מבוסס מערכת תלת מימדי

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Cancer Research

Fibroblast-Derived 3D Matrix System Applicable to Endothelial Tube Formation Assay

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ECM also participates in cell migration, proliferation, and differentiation. Fibroblasts are the main type of cells modifying ECM fiber arrangement and production. In cancer, CAFs (cancer associated fibroblasts) are in permanent activation status, participating in ECM remodeling, facilitating tumor cell migration, and stimulating tumor-associated angiogenesis, among other pro-tumorigenic roles. The objective of this method is to create a three-dimensional matrix with a fiber composition that is similar to in vivo matrices, using immortalized fibroblasts or human primary CAFs. Fibroblasts are cultured in pre-treated cell culture plates and grown under ascorbic acid stimulation. Then, fibroblasts are removed and matrices are blocked for further cell seeding. In this ECM model, fibroblasts can be activated or modified to generate different kinds of matrix, whose effects can be studied in cell culture. 3D matrices are also shaped by cell signals, like degradation or cross-linking enzymes that might modify fiber distribution. In this context, angiogenesis can be studied, along with other cell types such as epithelial tumor cells.

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. Fibroblasts are seeded in a pre-treated culture plate and stimulated with ascorbic acid for matrix generation. Matrices are decellularized and blocked to culture relevant cells (e.g., endothelial cells).

מערכת מטריצה תלת-ממדית פיברובלסט הישימה בשיטת היווצרות שפופרת אנדותל

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional (3D) structures. One of the main functions of epithelia is the formation of barriers that protect the underlining tissues against physical and chemical insults and infectious agents. In addition, epithelia mediate the transport of nutrients, hormones, and other signaling molecules, often creating biochemical gradients that guide cell positioning and compartmentalization within the organ. Owing to their central role in determining organ-structure and function, epithelia are important therapeutic targets for many human diseases that are not always captured by animal models. Besides the obvious species-to-species differences, conducting research studies on barrier function and transport properties of epithelia in animals is further compounded by the difficulty of accessing these tissues in a living system. While two-dimensional (2D) human cell cultures are useful for answering basic scientific questions, they often yield poor in vivo predictions. To overcome these limitations, in the last decade, a plethora of micro-engineered biomimetic platforms, known as organs-on-a-chip, have emerged as a promising alternative to traditional in vitro and animal testing. Here, we describe an Open-Top Organ-Chip (or Open-Top Chip), a platform designed for modeling organ-specific epithelial tissues, including skin, lungs, and the intestines. This chip offers new opportunities for reconstituting the multicellular architecture and function of epithelial tissues, including the capability to recreate a 3D stromal component by incorporating tissue-specific fibroblasts and endothelial cells within a mechanically active system. This Open-Top Chip provides an unprecedented tool for studying epithelial/mesenchymal and vascular interactions at multiple scales of resolution, from single cells to multi-layer tissue constructs, thus allowing molecular dissection of the intercellular crosstalk of epithelialized organs in health and disease.

The present protocol describes the capabilities and the essential culture modalities of the Open-Top Organ-Chip for the successful establishment and maturation of full-thickness organ-on-chip cultures of primary tissues (skin, alveolus, airway, and intestine), providing the opportunity to investigate different functional aspects of the human epithelial/mesenchymal and vascular niche interface in vitro.

שחזור ציטוארכיטקטורה ותפקוד של רקמות אפיתל אנושיות על שבב-איבר פתוח

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

<meta charset="utf8"></head><body>מערכת תרבית משותפת תלת-ממדית דו-שכבתית מתקדמת לתאי אפיתל ופיברובלסטים

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: קידום מערכות קוקולטורה תלת-ממדית עם PVA-PCL ממברנות ננו-סיביות

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...