Name: an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds
Uploaded: 2018-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds at JoVE.com

עבודה זו היה ממומן על ידי אוסטריה מחקר קידום הסוכנות (FFG; מספר הפרוייקט 850681), יוזמת האוניברסיטה של יישומי מדעי העליונה אוסטריה קרנות בסיסי (פרוייקט GlucoSTAR) ואל המרכז לחדשנות טכנולוגית בתחום הרפואה (מתוזמן במרכז) זה מקבל בסיסי מימון על ידי מחוז של אוסטריה עילית.

על פי הוראת 2010/63/האיחוד האירופי, ניסויים עם עוברי העופות שאינם סס במהלך הראשון לשני-שליש התפתחות לא צריך הרשאה על ידי ועדת האתיקה.
1. רבייה של ביצי ואחסון
<ol><li>השג ביצי תרנגולת מופרית (טבלה של חומרים) תרבית מקומית. הערה: ביצים ניתן לאחסן ב 14 מעלות צלזיוס באווירה humidified עד 10 ימים לאחר הנחת לפני השימוש לניסויים.</li>
	<li>דגירה הביצים ב 38 ° C עם לחות ממוצעת של 40-60% 10 או 11 ימים בתוך אינקובטור כל הזמן שהופך את הביצים.</li>
</ol>2. בחירה של ביצים
<ol><li>בדוק את הביצים לדישון לאחר דגירה של עד 11 ימים. השתמש אור candling בשלב זה. טבלו את השוליים של המנורה candling inkpad, נרות הצד המחודד של הביצה.</li>
	<li>כדי לזהות שלפוחית השתן אוויר, בדוק הבדלי בהירות על הביצה. הערה: שלפוחית השתן אוויר מופיעה כאזור עגול, שקופים יותר, בזמן אלבומין הוא כהה יותר, כאשר הביצה הוא candled.</li>
	<li>לאחר גילוי של שלפוחית השתן אוויר, סמן את המיקום על-ידי הקשה על המנורה מעט נגד הביצה עם הדיו שהוחלו בעבר.</li>
	<li>הכללת שאינה מופרית ביצים בשלב זה, אשר אינם מראים הבדל בהירות בין אלבומין שלפוחית אוויר.</li>
</ol>3. הזרקה של חומרים
<ol><li>הכן את החומר של הריבית (למשל, תמצית צמחים או אינסולין) על ידי דילול החומר בריכוז הרצוי במאגר מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) של האנק. לדוגמה, 3.3 U/mL של אינסולין זמינים מסחרית אנלוגי ב- HBSS.</li>
	<li>עבור היישום של המתחם הנבחר, בזהירות פק קליפת עם זוג מלקחיים באזור המסומן של שלפוחית השתן אוויר המחודד. לא יוצרים חור גדול יותר מקוטר המחט של המזרק. להזריק את בופר (300 µL) המכילה את החומר עניין לאזור שמנוקרים באמצעות מזרק. הערה: השתמש מזרקים חד-פעמיים סטרילי, 1-ml, טיפים פיפטה וכלי הדם. ללבוש כפפות, חלוק מעבדה לניסויים.</li>
	<li>כדי לקבוע את האפקט להפחתת גלוקוז בדם של חומר, מקם את הביצים לתוך החממה 60, 120, 180 דקות, בהתאמה. כדי לקבוע את רמות הגלוקוז בדם הבזליים, כוללים לפחות 10-15 שליטה שאינם מטופלים ביצים.</li>
</ol>4. בדיקות רעילות
<ol><li>לאחר היישום של המתחם הנבחר במשך 24 שעות ביממה, equilibrate את קרום הדקה עם פוספט תמיסת מלח במאגר (PBS) מאגר (מספיק כדי לכסות את הקרום כל הדקה) לפחות ב-30 s.</li>
	<li>להסיר עודפי PBS מאגר על ידי למזוג משם.</li>
	<li>משוך את קרום הדקה בזהירות עם זוג פינצטה מחודדת.</li>
	<li>בדיקת כלי דם לחבלות ואשר חיוניות (למשל, תנועה) של העובר צ'יק. הערה: ראה איור 1 להשוואה של חיוני נגד עוברי שאינם חיוניים לאחר היישום של תמצית צמחים רעילים.</li>
</ol>5. מדידה של ערך הגלוקוז בדם
<ol><li>בנקודת הזמן המתאים, בזהירות להסיר את קליפת מעל שלפוחית השתן אוויר, equilibrate את קרום הדקה עם מאגר PBS (מספיק כדי לכסות את הקרום כל הדקה).</li>
	<li>להסיר עודפי PBS מאגר על ידי למזוג משם.</li>
	<li>משוך בזהירות את קרום הדקה עם זוג פינצטה מחודדת.</li>
	<li>לחתוך ולהסיר את הקרום chorioallantoic עם מיקרו-מספריים, כדי לאפשר גישה טובה לכלי הדם מתאים. לחתוך את הקרום לפחות 2-3 ס מ. Not גזור כל כלי גדול ממברנה עצמו כדי למנוע איבוד דם לא רצויים של העובר.</li>
	<li>אתר את קיבול גדול שמקורם הבטן של העובר. להרים את כלי השיט הזה מתחום אלבומין עם מיקרו-מספריים סגורה ומניחים אותו על pH-רצועת פלסטיק. להזיז את רצועת ה-pH מתחת הספינה, אשר מתקיים עם המיקרו-המספריים, ומשוך לאחור את המיקרו-המספריים משם בקפידה.</li>
	<li>הסר 1-2 מ"ל של הנוזל מתחת קרום chorioallantoic עם פיפטה כדי למנוע דילול הדם בשלב הבא. ייבש את הכלי ואת חשפנות-pH עם נייר סינון, לפני הספינה נחתך.</li>
	<li>חותכים את כלי הדם בזהירות עם מיקרו-מספריים בצד אחד. לא לחתוך כלי הקיבול לחלוטין. הערה: כלי הקיבול הוא בערך 1 מ מ עבה. Not גזור יותר ממחצית הספינה כדי למנוע חיתוך באמצעות הכלי לחלוטין, זה עלול להחליק מהרצועה, איסוף דם לא אפשרית.</li>
	<li>לאסוף את הדם דולף על רצועת ה-pH באמצעות פיפטה. Microliters עשר של דם נדרשים לקבוע רמות הגלוקוז באמצעות מד גלוקוז בדם.</li>
</ol>6. הערכות סטטיסטיות
<ol><li>לחשב את הערך הממוצע לפחות 10 ביצים בודדות לכל נקודת זמן, לנרמל את הערכים האלה כדי לאחד הביצים שליטה (ביצים שאינם או מאגר-מטופלים).</li>
	<li>לאחר מכן, לקבוע את אחוזי ירידה. בנוסף, משתמשים אינסולין כפקד חיובי. הערה: חזור על ניסוי לפחות שלוש פעמים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Defronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+Lecture.+From+the+triumvirate+to+the+ominous+octet:+a+new+paradigm+for+the+treatment+of+type+2+diabetes+mellitus.">Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).</li><li>American_Diabetes_Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).</li><li>Han Cho, N., Cavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDF Diabetes Atlas. 7, (2015).</li><li>Bailey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individualized+glycaemic+targets+and+pharmacotherapy+in+type+2+diabetes.">Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes.</a> Diabetes &amp; vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).</li><li>Maruthur, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Medications+as+Monotherapy+or+Metformin-Based+Combination+Therapy+for+Type+2+Diabetes:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).</li><li>Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Advances+in+the+Biochemical+and+Physiological+Aspects+of+the+Treatment+of+Type+2+Diabetes+Mellitus+with+Thiazolidinediones.">Current Advances in the Biochemical and Physiological Aspects of the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus with Thiazolidinediones.</a> PPAR research. , 7614270 (2016).</li><li>Cohen, F. J., Neslusan, C. A., Conklin, J. E., Song, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+antihyperglycemic+prescribing+trends+for+US+privately+insured+patients+with+type+2+diabetes.">Recent antihyperglycemic prescribing trends for US privately insured patients with type 2 diabetes.</a> Diabetes care. 26 (6), 1847-1851 (2003).</li><li>Desai, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+medication+initiation+in+newly+diagnosed+diabetes+mellitus:+quality+and+cost+implications.">Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications.</a> The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).</li><li>Martel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-obesogenic+and+antidiabetic+effects+of+plants+and+mushrooms.">Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms.</a> Nature reviews. Endocrinology. , (2016).</li><li>Lanzerstorfer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+insulin+mimetic+drugs+by+quantitative+total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).</li><li>Onur, S., St&#246;ckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Extract+Collection+Kiel+in+Schleswig-Holstein+(PECKISH)+Is+an+Open+Access+Screening+Library.">The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library.</a> Journal of Food Research. 2 (4), (2013).</li><li>Haselgrubler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluc-HET,+a+complementary+chick+embryo+model+for+the+characterization+of+antidiabetic+compounds.">Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds.</a> PloS one. 12 (8), e0182788 (2017).</li><li>Stadlbauer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+Characterization+of+Putative+Antidiabetic+Herbal+Extracts.">Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts.</a> PloS one. 11 (1), e0148109 (2016).</li><li>Greywe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+and+robustness+of+the+hen's+egg+test+for+analysis+of+micronucleus+induction+(HET-MN):+results+from+an+inter-laboratory+trial.">Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial.</a> Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).</li><li>Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryotoxicity+of+mirtazapine:+a+study+using+Chick+Embryotoxicity+Screening+Test.">Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test.</a> Neuro endocrinology letters. 31, 8-10 (2010).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).</li><li>Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+diabetes+model+in+chick+embryos+treated+with+streptozotocin.">Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin.</a> Biological &amp; pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).</li><li>Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new+methodological+aspects+of+the+hen's+egg+test+for+micronucleus+induction+(HET-MN).">Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN).</a> Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

וזמינותו הט-קאם היא מערכת חלופה מבחן בשימוש נרחב לניסויים בבעלי חיים התעשייה12. המערכת ב- ovo המתוארים כאן מייצג גירסה שונה של מצלמת הט וזמינותו. בעוד בצורתו המקורית, מצלמת הט ניסויים מבוצעים ללמוד את מאפייני מעצבן של תרכובות ניסוח או הניתוח של אנגיוגנזה14,15,16, לנו יש להתאים את הגישה כדי לבדוק תרכובות עם מאפיינים אינסולין-מימטי בשם12. על פי הוראת 2010/63/האיחוד האירופי, ניסויים עם עוברי העופות שאינם סס במהלך הראשון לשני-שליש התפתחות לא צריך הרשאה על ידי ועדת האתיקה מאז ניסויים אלו אינם נחשבים ניסויים בבעלי חיים. מחקרים אחרונים הוכיחו ההתאמה של המערכת ב- ovo לאפיין את היעילות של תמציות צמחים שנבחרו, אשר זוהו GLUT4 רוברטסונית מבוססת על המסך הראשי10, כדי להפחית את רמות הגלוקוז בדם, היעדרות של אינסולין12,13. נקודות קריטיות עבור הופעה ממש טובה של המערכת ב- ovo כוללים: הראשון, תרבית אמין אספקת הביצים. לומן. עוף חום קלאסי הוא בחירה טובה של הגזע. שנית, היישום של רעילות בדיקות כדי לא לכלול את ההשפעות הרעילות של הצרכים מתחם ובדוקים להיעשות. בנוסף, הכנת כלי דם מתאים עבור איסוף דם חשובה. חשוב למנוע את חיתוך כלי גדול ממברנה chorioallantoic עצמו, כמו זה יכול להוביל לאובדן שאינו עדיפה של דם. יתר על כן, לפני הספינה הוא נחתך על רצועת ה-pH, זה חייב להיות טפחו יבש באמצעות נייר סינון כדי למנוע דילול הדם שנאספו. בסופו של דבר, מספר מספיק של ניסויים נראה חשוב. מומלץ להשתמש לפחות 10 ביצים על כל נקודת זמן, וחזרה לתרגיל של הניסוי בהתאמה.
באופן טבעי, ישנן כמה מגבלות של גישה זו ב- ovo . מכיוון שצריך עד 30 דקות עד שהחומרים הם נספג דרך קרום הדקה באים במגע קרוב עם קרום chorioallantoic, זה אינה מאפשרת לכמת מענה מהיר של העובר למתחם יישומית. יתר על כן, תרכובות מסוימות עשויים להיות רעילים בריכוז יישומית, אשר לעתים קרובות התוצאות נגעים של כלי דם ברקמה chorioallantoic. לפיכך, cytotoxicity בדיקות בהתבסס על דגירה לטווח ארוך של תרכובות למשך 24 שעות מופיע סבירה. לבסוף, מצאנו כי מערכת מאגר המשמש עבור היישום של תרכובות יש השפעה משמעותית על הביצועים של וזמינותו. 12 . כעת, HBSS המאגר משמש כי התוצאה היא ההשפעה הקטן ביותר על רמות הגלוקוז בדם של העובר.
עבור יישומים עתידיים, המאגר הנוסף מערכות כחלופה HBSS עשוי להיבדק. יתר על כן, ההשפעה של תמציות צמחים על פרמטרים נוספים דם כגון כולסטרול, טריגליצרידים או lipoproteins יכול להיות שאלה אטרקטיבי.
המערכת החדשה שלנו ב- ovo הוא כלי מבטיח וחשוב לבחון חומרים עם מאפיינים אינסולין-מימטי של אורגניזם חי ללא הצורך של ניסוי בבעלי חיים. לכן, הוא ממלא את הפער בין הגישות הפריה , ב- vivo . לעומת הקיים ב- ovo דגם מערכות17 שאין צורך לזירוז סוכרת על ידי טיפול streptozotocin (STZ), כפי שאנו משתמשים עוברי ביום 10 או 11 של דגירה. בשלב זה, ייצור האינסולין לא התחיל, אך העוברים כבר רגישים לאינסולין. בנוסף, אישור על ידי ועדת האתיקה ייתכן שיהיה צורך אם העוברים בגילאי 14-17 ימים נמצאים בשימוש17. יתר על כן, בהשוואה לאסטרטגיות אלטרנטיביות18, מתחם היישום כפי שמתואר כאן הוא פחות מזיקים ולא מייגעת, הגדלת ניסיוני דרך. תוריד מחירים.
יחדיו, זה ב- ovo הגישה היא מערכת אטרקטיביים אם תופעת דם-הפחתת חומר אינסולין-מימטי צריך להיבחן. אורגניזם חי.

סוכרת היא מחלה מטבולית מאופיינת היפרגליקמיה והיא נגרמת על ידי ליקויים-הפרשה של אינסולין או פעולה אינסולין1. תשעים אחוז מכל מקרי הסוכרת הם קטגוריה סוכרת סוג 2 (T2DM), שבו אנשים להדגים תנגודת לאינסולין בעיקר אינסולין מחסור2. מספר גורמים ידועים כדי להגביר את השכיחות העולמית של T2DM, כולל שינויים באורח החיים, במיוחד אלה הקשורים overnutrition, הזדקנות, חוסר פעילות גופנית. כ- 400 מיליון אנשים יש סוכרת ברחבי העולם על פי הבינלאומי לסוכרת הפדרציה (צה ל). מספר זה צפוי להגיע 600 מיליון בתוך 20 שנה הבאה3.
סיבוכים סוכרת הנגרמת על ידי היפרגליקמיה ותנגודת לאינסולין, כגון יתר לחץ דם, dyslipidemia, אי סבילות גלוקוז, מחלת לב כלילית, מחלת כלי דם מוחי, להוביל תוחלת החיים מופחתת באופן משמעותי באיכות4. אנשים מושפעים דורשים להורדת גלוקוז pharmacotherapy; עם זאת, השימוש של תרופות, כגון מטפורמין5 קשורה לעיתים קרובות עם תופעות לוואי דרמטי-6,-7,-8. לכן, נוסף גישות antidiabetic בטוח, זמינה וזולה נרחב נחוצים.
יש כבר ייחסה תרכובות צמחים שונות, תמציות, צמחייה בריאותיים למאפיינים אינסולין-מימטי תכונה על-ידי להתכוונן תאיים שונים. תכונה חשובה היא גירוי של רוברטסונית של נשא גלוקוז 4 (GLUT4) קרום פלזמה מעל תאי אחסון תאיים, וכתוצאה מכך ספיגה מוגברת של גלוקוז בשריר, רקמת שומן, בהעדר אינסולין, המכונה מאפייני אינסולין-מימטי9. בעבר, אנחנו מיושמת גישה מבוסס מיקרוסקופיה של קרינה פלואורסצנטית לכמת את התהליך טרנסלוקציה של GLUT410. ניתוח של תמציות צמחים רבים מן הספרייה תמצית11 שימוש assay הזה הביא הזיהוי של מועמדים מבטיחים. עם זאת, בדיקות נוספות היצורים החיים נדרשים. הגישה המתוארת בפירוט רב את הנייר הזה, מודל העובר אפרוח שונה, הוכיחה להיות דוגמנית מבטיח לזיהוי חומרים עם אינסולין-מימטי מאפיינים. הוא מייצג כלי אטרקטיבי מילוי הפער רחב בין הפריה מחקרים ב- vivo ומציע מספר יתרונות בהשוואה למערכות קיימות כגון עלויות מקובלת, נהלי הטיפול הפשוט תפוקה הולמת. בנוסף, אישור על ידי ועדת האתיקה אינה נדרשת.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30268.02</td><td></td></tr><tr><td>NovoRapid</td><td>Novo Nordisk</td><td>8-0905-82-304-6</td><td></td></tr><tr><td>Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)</td><td>Local Breeder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accu-check performa</td><td>Roche</td><td>6454011</td><td></td></tr><tr><td>Accu-check Inform II Teststreifen</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>5942861</td><td></td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp; HEKA- Turbo 288</td><td>HEKA Brutger&amp;auml;te</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe Omnican F 1 mL</td><td>Braun</td><td>09161502S&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Extracts</td><td>PEKISH extract library</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamp Tempo Nr. 119</td><td>ORBAN</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds

רמות גלוקוז גבוהות בדם, סוכרת סוג 2 (T2DM), מחלה מטבולית multifactorial ומורכבת, נגרמות על ידי אינסולין ההתנגדות ו β-cell כשל. אסטרטגיות שונות, כולל ההזרקה של אינסולין או השימוש של תרופות sensitizing אינסולין, נרדפים כדי לטפל T2DM או לפחות להפחית את הסימפטומים. בנוסף, היישום של תרכובות צמחיות משכה תשומת לב גדלה והולכת. לכן, זה הכרחי למצוא מערכות הבדיקה יעילה כדי לזהות ולאפיין אינסולין-מימטי תרכובות. כאן פיתחנו מודל העובר אפרוח שונה, אשר מאפשרת בדיקה של תרכובות סינתטי ותמציות צמחי מרפא עם אינסולין-מימטי מאפיינים. באמצעות קרינה פלואורסצנטית מבוסס מיקרוסקופיה הראשי מסך, אשר מכמת את טרנסלוקציה של נשא גלוקוז 4 (Glut4) כדי קרום פלזמה, הצלחנו לזהות תרכובות, בעיקר תמציות צמחים, אשר יוביל לעליה של גלוקוז תאיים ריכוזים ב adipocytes. עם זאת, יעילותם של חומרים אלה דורש אימות של אורגניזם חי. לפיכך, השתמשנו ב- ovo גישה לזהות את תכונותיהם בהפחתת גלוקוז בדם. באישור ועדת אתיקה אינה דרושה מאז השימוש של עוף העוברים במהלך הראשון לשני-שליש התפתחות אינו נחשב ניסוי בבעלי חיים. . הנה, היישום של מודל זה מתואר בפירוט.

תיאור/הוראות: הגישה Gluc-הט
לאחר דגירה עם חומרים מעניינים, הביצים נפתח, שהוכן עבור איסוף דם על-ידי הסרה של קליפת (איור 2). הכנה נוספת כולל equilibration והסרה של קרום קליפת הביצה כדי לקבל גישה קרום chorioallantoic. זה קרום ואז נחתך בקפידה כדי לספק גישה לכלי דם מתאים עבור איסוף דם. רצוי, כלי גדול שמקורם הבטן של העובר מושם על pH-רצועת פלסטיק. כדי למנוע דילול הדם בזמן האיסוף, כלי השיט ורצועת pH מלוטף יבש עם נייר סינון. כלי הדם ואז נחתך, נוזלת על רצועת ה-pH הדם נאסף עבור ניתוח באמצעות פיפטה.
ההשפעות של תמציות צמחים שנבחרו על רמות הגלוקוז בדם:
עם הוקמה לאחרונה GLUT4-רוברטסונית המבוסס על כימות הראשי מסך, אנו מסוגלים לזהות חומרים האופייניים אינסולין-מימטי10. הקרנה של מאות תמציות צמחים מסיסים במים גרמו הזיהוי של מספר להיטים. תמציות אלו נבדקו במודל שלנו ב-ovo. ניסויים אלה שימשו תמציות מקריסטלים של Combretum indicum (רנגון מטפס), תמצית שאינו גלוי (הנקרא תמצית 0845). שאנחנו התפזרנו תמציות במאגר HBSS-300 mg/L, ריכוז זה התברר המתאים מחקרים קודמים12,13. חומרים הוחלו על העוברים הדגירה למשך 11 ימים. כמצוין באיור3, החילוץ מ מטפס רנגון לא לגרום הפחתה גלוקוז הדם משמעותי ב- ovo. עם זאת, ריכוז הגלוקוז בדם בהצלחה צומצם עם תמצית 0845, עם ירידה קטנה לאחר 60 דקות, אשר דומה לאפקט שנמדדו באמצעות זמינים מסחרית אינסולין אנלוגי. אפקט משמעותי נצפתה כאשר תקופת דגירה הביצים הייתה ממושכת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg"> איור 1: השפעתה של תרכובות רעילים על חיוניות העובר. הביצים מודגרות למשך 11 ימים (A ו- C) או מטופלים עם תמצית צמחים רעילים ביום 10 עבור עוד 24 שעות (B ו- D). היישום של התמצית הובילה חמור נגעים של כלי דם קרום chorioallantoic (ד) , העובר (B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg"> איור 2: תיאור של הדגם ב- ovo . משמאל לימין: פתיחת והסרה של קליפת (1 - 2); equilibration והסרה של קרום הדקה עם קרום chorioallantoic חשוף (3); כלי השיט מוכן חשפנות-pH (4); האוסף של דם ומדידה של ריכוז הגלוקוז באמצעות גלוקוז מטר (5). מ Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg"> איור 3: ההשפעה של תמציות צמחים על רמות הגלוקוז בדם בהשוואה ביצים אינו מטופל או שטופלו אינסולין. הביצים היו הדגירה למשך 11 ימים ו שטופלו החומרים המצוין (זמינים מסחרית אינסולין אנאלוגי: 3.3 U/mL; תמציות: 300 מ ג/ליטר) מומס HBSS מאגר (300 µL נפח) עבור עד 3 ה דם רמות הגלוקוז נקבעו באמצעות מד גלוקוז בדם. התוצאות מוצגות ללא ההשפעה של המאגר. קווי שגיאה מבוססים על שגיאת התקן של הממוצע. * P < 0.05 ו * * * P < 0.0001, משמעותית ירידה ביחס שטופלו HBSS ביצים באותו זמן הדגירה. מ Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds at JoVE.com

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

במחקר זה, אנו מתארים מערכת ב- ovo ככלי מבטיח לבדוק אינסולין-מימטי תרכובות אורגניזם חי. היתרונות העיקריים כוללים תפוקה הולמת ועלויות מקובל, המאפשרים הזיהוי של פיטוכימיקלים עם אינסולין-מימטי מאפיינים.

מודל ב Ovo לבדיקת תרכובות מימטי-אינסולין

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

an-in-ovo-model-for-testing-insulin-mimetic-compounds

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Insulin and Hypoglycemic Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Views.  University of Applied Sciences Upper Austria. במחקר זה, אנו מתארים מערכת ב- ovo ככלי מבטיח לבדוק אינסולין-מימטי תרכובות אורגניזם חי. היתרונות העיקריים כוללים תפוקה הולמת ועלויות מקובל, המאפשרים הזיהוי של פיטוכימיקלים עם אינסולין-מימטי מאפיינים.

Video: An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שימוש פוליפוני מתכלה (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) מיקרוסכמות

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Bioengineering

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Biology

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Medicine

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues contributes to type 2 diabetes mellitus (T2DM) development and appetite regulation in the hypothalamus. Chemokine CCL5 and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) levels have been suggested to mediate arteriosclerosis and glucose intolerance in type 2 diabetes mellitus (T2DM). In addition, CCL5 plays a neuroendocrine role in the hypothalamus by regulating food intake and body temperature, thus, prompting us to investigate its function in hypothalamic insulin signaling and the regulation of peripheral glucose metabolism.
The micro-osmotic pump brain infusion system is a quick and precise way to manipulate CCL5 function and study its effect in the brain. It also provides a convenient alternative approach to generating a transgenic knockout animal. In this system, CCL5 signaling was blocked by intracerebroventricular (ICV) infusion of its antagonist, MetCCL5, using a micro-osmotic pump. The peripheral glucose metabolism and insulin responsiveness was detected by the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signaling activity was then analyzed by protein blot from tissue samples derived from the animals.
After 7-14 days of MetCCL5 infusion, the glucose metabolism and insulin responsiveness was impaired in mice, as seen in the results of the OGTT and ITT. The IRS-1 serine302 phosphorylation was increased and the Akt activity was reduced in mice hypothalamic neurons following CCL5 inhibition. Altogether, our data suggest that blocking CCL5 in the mouse brain increases the phosphorylation of IRS-1 S302 and interrupts hypothalamic insulin signaling, leading to a decrease in insulin function in peripheral tissues as well as the impairment of glucose metabolism.

This protocol studies the role of chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5) in the hypothalamus by delivering an antagonist, MetCCL5, into the mouse brain using a micro-osmotic pump brain infusion system. This transient inhibition of CCL5 activity interrupted hypothalamic insulin signaling, leading to glucose intolerance and peripheral systemic insulin sensitivity.

לומדים את האות ההיפותלמוס אינסולין סובלנות גלוקוז היקפי עם מערכת עירוי רציף סמים לתוך המוח העכבר

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

חקר In Vivo מטבוליזם הגלוקוז עכברים הניזונה דיאטה עתירת שומן באמצעות בדיקת הגלוקוז אוראלי סובלנות (OGTT) ובדיקה עמידות לאינסולין (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous insulin assays have existed for decades, the recent advent of homogeneous time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer (HTRF) technology has significantly simplified these measurements. This is a rapid, cost-effective, reproducible, and robust optical assay reliant upon antibodies conjugated to bright fluorophores with long lasting emission which facilitates time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer. Moreover, HTRF insulin detection is amenable for the development of high-throughput screening assays. Here we use HTRF to detect insulin secretion in INS-1E cells, a rat insulinoma-derived cell line. This allows us to estimate basal levels of insulin and their changes in response to glucose stimulation. In addition, we use this insulin detection system to confirm the role of dopamine as a negative regulator of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). In a similar manner, other dopamine D2-like receptor agonists, quinpirole, and bromocriptine, reduce GSIS in a concentration-dependent manner. Our results highlight the utility of the HTRF insulin assay format in determining the role of numerous drugs in GSIS and their pharmacological profiles.

Here, we present homogeneous time resolved FRET (HTRF) as an efficient method for rapid detection of insulin secreted from cells.

פורסטר זמן לפתור הומוגנית תהודה אנרגיה מבוססת על העברת Assay גילוי של הפרשת האינסולין

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Acclimation Prior to an Intraperitoneal Insulin Tolerance Test to Mitigate Stress-Induced Hyperglycemia in Conscious Mice

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that involves measurement of blood glucose levels over time following a single intraperitoneal injection of insulin. Given that it is performed in the conscious state and blood is often collected via a tail snip, it has the potential to elicit a stress response from animals due to anxiety associated with handling and blood collection. As such, a stress-induced rise in blood glucose can occur, making it difficult to detect and interpret the primary endpoint measure, namely an insulin-mediated reduction in blood glucose. This has been seen in many mouse strains, and is quite common in diabetic db/db mice, where glucose levels can increase, rather than decrease, after insulin administration. Here, we describe a method of acclimating mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test. We find that this lowers stress-induced hyperglycemia and results in data that more accurately reflects whole body insulin sensitivity.

Stress-induced elevations in glucose levels can confound interpretation of data derived from a conscious intraperitoneal insulin tolerance test in mice. In this article, we describe a method to acclimate the mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test in order to limit stress-induced hyperglycemia.

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

גלוקוז ספיגה מדידה ותגובה גירוי אינסולין ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מיוטובים ראשוניים אדם מתורבת

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, depending on the specific assay. Secreted luciferase assays expedite results and lower the assay cost per sample substantially. Here we present a relatively underused approach to gauge insulin secretory activity from pancreatic &#946; cells by using Gaussia luciferase genetically inserted within the C-peptide. During proteolytic processing of proinsulin, the C-peptide is excised releasing the luciferase within the insulin secretory vesicle where it is co-secreted with insulin. Results can be obtained within minutes after sample collection because of the speed of luciferase assays. A limitation of the assay is that it is a relative measurement of insulin secretion and not an absolute quantitation. However, this protocol is economical, scalable, and can be performed using most standard luminescence plate readers. Analog and digital multichannel pipettes facilitate multiple steps of the assay. Many different experimental variations can be tested simultaneously. Once a focused set of conditions are decided upon, insulin concentrations should be measured directly using antibody-based assays with standard curves to confirm the luciferase assay results.

This protocol describes how to perform rapid low-cost luciferase assays at medium-throughput using an insulin-linked Gaussia luciferase as a proxy for insulin secretion from beta cells. The assay can be performed with most luminescence plate readers and multichannel pipettes.

מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

מודל ב Ovo לבדיקת תרכובות מימטי-אינסולין

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster