Name: an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds
Uploaded: 2018-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dall'agenzia di promozione di ricerca austriaco (FFG; numero di progetto 850681), la University of Applied Sciences superiore Austria base Funding initiative (progetto GlucoSTAR) e il centro per l'innovazione tecnologica in medicina (TIMed Center) che riceve il finanziamento base di provincia dell'Alta Austria.

Secondo la direttiva 2010/63/UE, esperimenti con embrioni aviari non-covato durante i primi due terzi dello sviluppo embrionale non bisogno del permesso da un comitato etico.
1. conservazione e allevamento delle uova
<ol><li>Ottenere le uova di gallina fecondate (Tabella materiali) da un allevatore locale. Nota: Uova possono essere conservate a 14 ° C in atmosfera umidificata per fino a 10 giorni dopo la posa prima dell'uso per gli esperimenti.</li>
	<li>Incubare le uova a 38 ° C con un'umidità media del 40-60% per 10 o 11 giorni in un'incubatrice che trasforma costantemente le uova.</li>
</ol>2. selezione delle uova
<ol><li>Controllare le uova per la fecondazione dopo incubazione di fino a 11 giorni. Utilizzare una luce speratura per questo passaggio. Immergere la frangia della lampada speratura in un inkpad e candela il lato aguzzo dell'uovo.</li>
	<li>Per identificare la vescica di aria, controllare per differenze di luminosità sulla parte superiore l'uovo. Nota: La vescica di aria appare come una regione rotonda, più trasparente, mentre l'albume è più scura quando l'uovo è temperatura.</li>
	<li>Dopo il rilevamento della vescica aria, segnare la posizione premendo la lampada leggermente contro l'uovo con l'inchiostro applicato in precedenza.</li>
	<li>Escludere le uova non fecondate a questo punto, che non mostrano una differenza di luminosità tra l'albume e la vescica di aria.</li>
</ol>3. iniezione di sostanze
<ol><li>Preparare la sostanza di interesse (ad es., l'Estratto di erbe o insulina) diluendo la sostanza della concentrazione desiderata nel buffer di soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hank. Ad esempio, 3.3 U/mL di un'analogico in HBSS di insulina disponibile in commercio.</li>
	<li>Per l'applicazione del composto selezionato, attentamente beccare il guscio d'uovo con un aguzzo paio di pinzette in zona marcata della vescica aria. Non fanno un buco più grande del diametro dell'ago della siringa. Iniettare la soluzione tampone (300 µ l) contenenti la sostanza di interesse nell'area pecked tramite una siringa. Nota: Utilizzare siringhe monouso sterile, 1 ml, puntali per pipette e vasi. Indossare guanti e un camice da laboratorio per gli esperimenti.</li>
	<li>Per determinare l'effetto di riduzione del glucosio nel sangue di una sostanza, mettere le uova in incubatrice per 60, 120 e 180 min, rispettivamente. Per determinare i livelli della glicemia basale, includere almeno 10-15 uova di controllo non trattato.</li>
</ol>4. prove di tossicità per
<ol><li>Dopo l'applicazione del composto selezionato per 24 h, equilibrare la membrana guscio d'uovo con tampone di fosfato (PBS) soluzione salina tamponata (sufficiente a coprire la membrana intero guscio d'uovo) per almeno 30 s.</li>
	<li>Rimuovere il tampone PBS in eccesso versandolo distanza.</li>
	<li>Staccare con cautela la membrana guscio d'uovo con un aguzzo paio di pinzette.</li>
	<li>Controllare i vasi sanguigni per lesioni e confermare la vitalità (ad es., movimento) di embrione di pollo. Nota: Vedere la Figura 1 per il confronto di vitale contro gli embrioni non vitali dopo l'applicazione di un Estratto di erbe tossico.</li>
</ol>5. misurazione del valore di glucosio del sangue
<ol><li>Presso il punto di tempo rispettivo, è attentamente rimuovere il guscio d'uovo sopra la vescica di aria ed equilibrare la membrana guscio d'uovo con il tampone PBS (sufficiente a coprire la membrana intero guscio d'uovo).</li>
	<li>Rimuovere il tampone PBS in eccesso versandolo distanza.</li>
	<li>Staccare con cautela la membrana guscio d'uovo con un aguzzo paio di pinzette.</li>
	<li>Tagliare e rimuovere la membrana corio-allantoidea con una micro-forbice, per consentire il buon accesso ai vasi sanguigni adatti. Tagliate la membrana almeno 2-3 cm. Non tagliare qualsiasi grandi imbarcazioni nella membrana stessa per evitare la perdita di sangue indesiderate dell'embrione.</li>
	<li>Individuare la grande nave proveniente dall'addome dell'embrione. Sollevare questo vaso fuori l'albume con una micro-forbice chiusa e posizionarlo su una striscia di plastica pH. Spostare la striscia di pH sotto la nave, che si tiene con il micro-forbice, e tirare indietro la micro-scissor distanza attentamente.</li>
	<li>Rimuovere 1-2 mL di liquido sotto la membrana corio-allantoidea con una pipetta per evitare la diluizione del sangue nel passaggio successivo. Asciugare il vaso e il nastro di pH con carta da filtro, prima che la nave è tagliata.</li>
	<li>Tagliare il vaso sanguigno con attenzione con un micro-forbice su un lato. Non tagliare completamente la nave. Nota: La nave è spessa circa 1 mm. Non tagliare più della metà della nave per evitare di tagliare attraverso il vaso interamente, come può scivolare fuori dalla strip e nessun prelievo di sangue è possibile.</li>
	<li>Raccogliere il sangue colante da pH-strip utilizzando una pipetta. Dieci microlitri di sangue sono necessari per determinare i livelli di glucosio utilizzando il misuratore di glucosio nel sangue.</li>
</ol>6. valutazione statistica
<ol><li>Calcolare il valore medio di almeno 10 uova individuali al punto temporale e normalizzare questi valori tra i controllo ovociti (non o tampone trattato).</li>
	<li>Successivamente, determinare la percentuale di diminuzione. Inoltre, è possibile utilizzare l'insulina come controllo positivo. Nota: Ripetere ogni esperimento almeno tre volte.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Defronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+Lecture.+From+the+triumvirate+to+the+ominous+octet:+a+new+paradigm+for+the+treatment+of+type+2+diabetes+mellitus.">Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).</li><li>American_Diabetes_Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).</li><li>Han Cho, N., Cavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDF Diabetes Atlas. 7, (2015).</li><li>Bailey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individualized+glycaemic+targets+and+pharmacotherapy+in+type+2+diabetes.">Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes.</a> Diabetes &amp; vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).</li><li>Maruthur, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Medications+as+Monotherapy+or+Metformin-Based+Combination+Therapy+for+Type+2+Diabetes:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).</li><li>Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Advances+in+the+Biochemical+and+Physiological+Aspects+of+the+Treatment+of+Type+2+Diabetes+Mellitus+with+Thiazolidinediones.">Current Advances in the Biochemical and Physiological Aspects of the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus with Thiazolidinediones.</a> PPAR research. , 7614270 (2016).</li><li>Cohen, F. J., Neslusan, C. A., Conklin, J. E., Song, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+antihyperglycemic+prescribing+trends+for+US+privately+insured+patients+with+type+2+diabetes.">Recent antihyperglycemic prescribing trends for US privately insured patients with type 2 diabetes.</a> Diabetes care. 26 (6), 1847-1851 (2003).</li><li>Desai, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+medication+initiation+in+newly+diagnosed+diabetes+mellitus:+quality+and+cost+implications.">Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications.</a> The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).</li><li>Martel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-obesogenic+and+antidiabetic+effects+of+plants+and+mushrooms.">Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms.</a> Nature reviews. Endocrinology. , (2016).</li><li>Lanzerstorfer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+insulin+mimetic+drugs+by+quantitative+total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).</li><li>Onur, S., St&#246;ckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Extract+Collection+Kiel+in+Schleswig-Holstein+(PECKISH)+Is+an+Open+Access+Screening+Library.">The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library.</a> Journal of Food Research. 2 (4), (2013).</li><li>Haselgrubler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluc-HET,+a+complementary+chick+embryo+model+for+the+characterization+of+antidiabetic+compounds.">Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds.</a> PloS one. 12 (8), e0182788 (2017).</li><li>Stadlbauer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+Characterization+of+Putative+Antidiabetic+Herbal+Extracts.">Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts.</a> PloS one. 11 (1), e0148109 (2016).</li><li>Greywe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+and+robustness+of+the+hen's+egg+test+for+analysis+of+micronucleus+induction+(HET-MN):+results+from+an+inter-laboratory+trial.">Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial.</a> Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).</li><li>Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryotoxicity+of+mirtazapine:+a+study+using+Chick+Embryotoxicity+Screening+Test.">Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test.</a> Neuro endocrinology letters. 31, 8-10 (2010).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).</li><li>Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+diabetes+model+in+chick+embryos+treated+with+streptozotocin.">Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin.</a> Biological &amp; pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).</li><li>Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new+methodological+aspects+of+the+hen's+egg+test+for+micronucleus+induction+(HET-MN).">Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN).</a> Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il dosaggio di HET-CAM è un sistema ampiamente utilizzato test alternativi alla sperimentazione animale nel settore12. Il sistema di in-ovo descritto qui rappresenta una versione modificata del test HET-CAM. Mentre nella sua forma originale, HET-CAM sono esperimenti per studiare le proprietà irritanti di composti e formulazione o l'analisi di angiogenesi14,15,16, abbiamo adattato l'approccio alla prova composti con caratteristiche insulino-mimetici putativo12. Secondo la direttiva 2010/63/UE, esperimenti con embrioni aviari non-covato durante i primi due terzi dello sviluppo embrionale non bisogno del permesso da un comitato etico poiché questi esperimenti non sono considerati gli esperimenti sugli animali. Recenti studi hanno dimostrato l'idoneità del sistema in-ovo per caratterizzare l'efficacia di estratti di erbe selezionati, che sono state identificate in un schermo primario basate su GLUT4-traslocazione10, per ridurre i livelli della glicemia nella assenza di insulina12,13. Punti critici per una buona prestazione del sistema in-ovo comprendono: primo, un allevatore affidabile consegnare le uova fecondate. Il pollo marrone classico Lohmann è una buona scelta di razza. In secondo luogo, l'attuazione di tossicità test per escludere effetti tossici delle esigenze composti studiati per essere fatto. Inoltre, la preparazione di un vaso sanguigno adatto per la raccolta del sangue è importante. È importante evitare il taglio di grandi vasi nella membrana corio-allantoidea stesso, come questo può portare a una perdita non-preferibile di sangue. Inoltre, prima che la nave è tagliata sulla striscia di pH, deve essere picchiettata asciutto utilizzando carta da filtro per evitare la diluizione del sangue raccolto. Infine, un numero sufficiente di esperimenti sembra essere importante. Si consiglia di utilizzare almeno 10 uova per ciascun punto di tempo e una triplice ripetizione dell'esperimento rispettivo.
Naturalmente, ci sono alcune limitazioni di questo approccio in ovo . Dato che ci vogliono fino a 30 minuti fino a quando le sostanze sono assorbite attraverso la membrana del guscio d'uovo ed entrano in stretto contatto con la membrana corio-allantoidea, non è possibile quantificare una risposta rapida dell'embrione al composto applicata. Inoltre, alcuni composti possono essere tossiche in concentrazione applicata, che spesso si traduce in lesioni dei vasi sanguigni della membrana corio-allantoidea. Così, la citotossicità test basati su incubazione a lungo termine dei composti per circa 24 ore appare ragionevole. Infine, abbiamo trovato che il sistema di buffer utilizzato per l'applicazione dei composti ha un effetto significativo sulle prestazioni del dosaggio. 12 attualmente, HBSS buffer viene utilizzato perché si traduce in più leggero effetto sui livelli di glucosio nel sangue dell'embrione.
Per le applicazioni future, possono essere testati sistemi buffer aggiuntivo come alternativa a HBSS. Inoltre, l'influenza di estratti di erbe su sangue ulteriori parametri come colesterolo, trigliceridi o lipoproteine potrebbe essere una domanda interessante.
Il nostro nuovo sistema di in-ovo è un importante e promettente strumento per testare le sostanze con caratteristiche insulino-mimetici in un organismo vivente senza la necessità di un esperimento sugli animali. Pertanto, colma il divario tra gli approcci in vitro e in vivo . Rispetto alle esistenti in ovo modello sistemi17 non c'è nessun bisogno di indurre il diabete dal trattamento di streptozotocin (STZ), come usiamo gli embrioni al giorno 10 o 11 di incubazione. In questa fase, non ha iniziato la produzione di insulina, ma gli embrioni sono già insulina sensibile. Inoltre, l'autorizzazione da un comitato etico potrebbe essere richiesto se usate17embrioni all'età di 14-17 giorni. Inoltre, rispetto a strategie alternative18, l'applicazione di composto come descritto qui è meno nocivo e laborioso, aumentando i tassi di attraverso-metta sperimentali.
Presi insieme, questo in-ovo approccio è un sistema interessante se un effetto sangue-diminuzione della sostanza insulino-mimetici deve essere testato in un organismo vivente.

Diabete mellito è una malattia metabolica caratterizzata da iperglicemia ed è causato da difetti nella secrezione dell'insulina o insulina azione1. Novanta per cento di tutti i casi di diabete sono categoria diabete mellito di tipo 2 (T2DM), dove gli individui dimostrano l'insulino-resistenza e per lo più insulina carenza2. Parecchi fattori sono conosciuti per aumentare l'incidenza globale di T2DM, compreso i cambiamenti nello stile di vita, specialmente quelle relative alla sovranutrizione, l'invecchiamento e l'inattività fisica. Circa 400 milioni di persone hanno il diabete mellito in tutto il mondo secondo l'International Diabetes Federation (IDF). Questo numero è destinato a raggiungere 600 milioni entro i prossimi 20 anni3.
Complicazioni diabetiche causate da iperglicemia ed insulino-resistenza, quali ipertensione, dislipidemia, intolleranza al glucosio, malattia coronarica e malattia vascolare cerebrale, portano ad una significativamente ridotta aspettativa di vita e qualità4. Gli individui commoventi richiedono abbassamento farmacoterapia; Tuttavia, l'utilizzo di farmaci, come la metformina5 spesso è associato con drammatici effetti collaterali6,7,8. Pertanto, sono necessari ulteriori approcci antidiabetici che sono sicura, ampiamente disponibile ed economica.
Nutraceuticals, estratti, piante e diversi composti a base di erbe sono state attribuite alla proprietà insulino-mimetici di funzione modulando varie funzioni cellulari. Una caratteristica importante è la stimolazione della traslocazione del trasportatore del glucosio (GLUT4) 4 alla membrana plasmatica da scompartimenti di immagazzinaggio intracellulare, risultante in un maggiore assorbimento del glucosio in muscolo e tessuto adiposo in assenza di insulina, noto come Proprietà insulino-mimetici9. In precedenza, abbiamo implementato un approccio di base di microscopia di fluorescenza per quantificare il processo di traslocazione di GLUT410. Analisi di numerosi estratti vegetali da un Estratto di libreria11 usando questa analisi ha portato alla identificazione di candidati promettenti. Tuttavia, ulteriori prove negli organismi viventi sono necessari. L'approccio descritto in dettaglio in questa carta, un modello di embrione di pulcino modificate, ha dimostrato di essere un modello promettente per l'identificazione di sostanze con proprietà insulino-mimetici. Esso rappresenta uno strumento attraente l'ampio divario fra gli studi in vitro e in vivo di riempimento e offre diversi vantaggi rispetto ai sistemi esistenti quali costi accettabili, le procedure di movimentazione semplice e adeguata velocità di trasferimento. Inoltre, l'autorizzazione da un comitato etico non è necessaria.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30268.02</td><td></td></tr><tr><td>NovoRapid</td><td>Novo Nordisk</td><td>8-0905-82-304-6</td><td></td></tr><tr><td>Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)</td><td>Local Breeder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accu-check performa</td><td>Roche</td><td>6454011</td><td></td></tr><tr><td>Accu-check Inform II Teststreifen</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>5942861</td><td></td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp; HEKA- Turbo 288</td><td>HEKA Brutger&amp;auml;te</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe Omnican F 1 mL</td><td>Braun</td><td>09161502S&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Extracts</td><td>PEKISH extract library</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamp Tempo Nr. 119</td><td>ORBAN</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds

I livelli elevati della glicemia nel diabete mellito di tipo 2 (T2DM), una malattia metabolica complessa e multifattoriale, sono causati da errori della β-cellula e resistenza di insulina. Varie strategie, tra cui l'iniezione di insulina o l'utilizzo di farmaci insulino-sensibilizzanti, sono state perseguite per trattare T2DM o almeno ridurre i sintomi. Inoltre, l'applicazione di composti a base di erbe ha attirato l'attenzione aumentante. Pertanto, è necessario trovare sistemi di test efficiente di identificare e caratterizzare composti insulino-mimetici. Qui abbiamo sviluppato un modello di embrione di pulcino modificate, che consente il test di composti sintetici ed estratti di erbe con proprietà insulino-mimetici. Utilizzando un fluorescenza basati su microscopia schermo primario, che quantifica la traslocazione del trasportatore del glucosio (Glut4) 4 alla membrana plasmatica, siamo stati in grado di identificare i composti, principalmente estratti di erbe, che conducono ad un aumento di glucosio intracellulare concentrazioni nei adipocytes. Tuttavia, l'efficacia di queste sostanze richiede ulteriore verifica in un organismo vivente. Così, abbiamo usato un approccio in-ovo per identificare le proprietà di riduzione del glucosio nel sangue. L'approvazione di un comitato etico non è necessaria poiché l'utilizzo di embrioni di pollo durante i primi due terzi dello sviluppo embrionale non è considerato un esperimento sugli animali. Qui, l'applicazione di questo modello è descritto in dettaglio.

Descrizione dell'approccio Gluc-HET:
Dopo incubazione con le sostanze di interesse, le uova fecondate sono aperti e preparate per la raccolta del sangue da rimozione del guscio d'uovo (Figura 2). Ulteriore preparazione include equilibrazione e rimozione della membrana guscio d'uovo per ottenere l'accesso alla membrana corio-allantoidea. Questa membrana è quindi tagliata attentamente per fornire l'accesso a un vaso sanguigno adatto per la raccolta del sangue. Preferibilmente, la grande nave proveniente dall'addome dell'embrione è collocata su una striscia di plastica pH. Per evitare la diluizione del sangue durante la raccolta, la nave e la pH-striscia è asciugati con carta da filtro. Il vaso sanguigno viene poi tagliato e colatura sulla striscia di pH del sangue è raccolto per l'analisi utilizzando una pipetta.
Effetti di estratti di erbe selezionati sui livelli di glucosio nel sangue:
Con un recente costituzione GLUT4-traslocazione quantificazione schermo basato su primaria, siamo in grado di identificare le sostanze con un caratteristico insulino-mimetici10. Lo screening di centinaia di estratti di erbe solubile in acqua ha portato alla identificazione di parecchi colpi. Questi estratti sono stati testati nel nostro modello di ovo in. Gli estratti preparati da Combretum indicum (creeper Rangoon) e un estratto non forniti (chiamato Estratto 0845) sono stati utilizzati per questi esperimenti. Abbiamo sciolto gli estratti nel buffer di HBSS a 300 mg/L, una concentrazione che si è rivelato per essere appropriato in precedenti studi12,13. Le sostanze sono state applicate agli embrioni incubati per 11 giorni. Come indicato nella Figura 3, l'estratto dalla pianta rampicante Rangoon non ha provocato un significativo sangue glucosio riduzione in ovo. Tuttavia, la concentrazione di glucosio nel sangue è stato ridotto con successo con Estratto 0845, con una diminuzione secondaria dopo 60 min, che è paragonabile all'effetto osservato usando un'analogico di insulina disponibile in commercio. Un effetto significativo è stato osservato quando il tempo di incubazione delle uova è stato prolungato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg"> Figura 1: influenza di composti tossici sulla vitalità dell'embrione. Uova sono state incubate per 11 giorni (A e C) o trattate con un Estratto di erbe tossico il giorno 10 per altre 24 ore (B e D). Applicazione dell'estratto hanno portato a gravi lesioni dei vasi sanguigni della membrana corio-allantoidea (D) e l'embrione (B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg"> Figura 2: Descrizione del modello in-ovo . Da sinistra a destra: apertura e la rimozione del guscio d'uovo (1 - 2); equilibratura e la rimozione della membrana guscio d'uovo con membrana chorioallantoic esposti (3); recipiente di preparato su un nastro di pH (4); la raccolta di sangue e misurazione della concentrazione di glucosio utilizzando un misuratore di glucosio (5). Adattato da Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg"> Figura 3: effetto di estratti di erbe sui livelli di glucosio nel sangue rispetto alle uova non trattate o trattati con insulina. Le uova sono state incubate per 11 giorni e trattate con le sostanze indicate (commercialmente disponibile insulina analogico: 3.3 U/mL; estratti: 300 mg/L) dissolto nel buffer di HBSS (300 µ l di volume) per fino a 3 h. sangue i livelli del glucosio sono stati determinati utilizzando un misuratore di glucosio del sangue. Risultati sono mostrati senza l'effetto del buffer. Barre di errore sono basati sull'errore standard della media. * P < 0.05 e * * * P < 0,0001, significativa diminuzione rispetto alle uova HBSS-trattati dello stesso tempo di incubazione. Adattato da Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds at JoVE.com

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

In questo studio, descriviamo un sistema in-ovo come un promettente strumento per testare composti insulino-mimetici in un organismo vivente. I principali vantaggi includono un'adeguata velocità di trasferimento e costi accettabili, che consentano l'identificazione di sostanze fitochimiche con proprietà insulino-mimetici.

Un modello In Ovo per testare composti insulino-mimetici

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

an-in-ovo-model-for-testing-insulin-mimetic-compounds

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Insulin and Hypoglycemic Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Views.  University of Applied Sciences Upper Austria. In questo studio, descriviamo un sistema in-ovo come un promettente strumento per testare composti insulino-mimetici in un organismo vivente. I principali vantaggi includono un'adeguata velocità di trasferimento e costi accettabili, che consentano l'identificazione di sostanze fitochimiche con proprietà insulino-mimetici.

Video: An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Ricerca

Bioingegneria

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

L&#39;insulina per iniezione ed estrazione emolinfa per misurare la sensibilità all&#39;insulina nei adulti Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Biologia

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Medicina

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues contributes to type 2 diabetes mellitus (T2DM) development and appetite regulation in the hypothalamus. Chemokine CCL5 and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) levels have been suggested to mediate arteriosclerosis and glucose intolerance in type 2 diabetes mellitus (T2DM). In addition, CCL5 plays a neuroendocrine role in the hypothalamus by regulating food intake and body temperature, thus, prompting us to investigate its function in hypothalamic insulin signaling and the regulation of peripheral glucose metabolism.
The micro-osmotic pump brain infusion system is a quick and precise way to manipulate CCL5 function and study its effect in the brain. It also provides a convenient alternative approach to generating a transgenic knockout animal. In this system, CCL5 signaling was blocked by intracerebroventricular (ICV) infusion of its antagonist, MetCCL5, using a micro-osmotic pump. The peripheral glucose metabolism and insulin responsiveness was detected by the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signaling activity was then analyzed by protein blot from tissue samples derived from the animals.
After 7-14 days of MetCCL5 infusion, the glucose metabolism and insulin responsiveness was impaired in mice, as seen in the results of the OGTT and ITT. The IRS-1 serine302 phosphorylation was increased and the Akt activity was reduced in mice hypothalamic neurons following CCL5 inhibition. Altogether, our data suggest that blocking CCL5 in the mouse brain increases the phosphorylation of IRS-1 S302 and interrupts hypothalamic insulin signaling, leading to a decrease in insulin function in peripheral tissues as well as the impairment of glucose metabolism.

This protocol studies the role of chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5) in the hypothalamus by delivering an antagonist, MetCCL5, into the mouse brain using a micro-osmotic pump brain infusion system. This transient inhibition of CCL5 activity interrupted hypothalamic insulin signaling, leading to glucose intolerance and peripheral systemic insulin sensitivity.

Studiando il segnale ipotalamico insulina ad intolleranza al glucosio periferico con un sistema di infusione del farmaco continuo nel cervello del Mouse

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

Studio In Vivo del metabolismo del glucosio nei topi di dieta-federazione di grassi utilizzando Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e Test di tolleranza dell'insulina (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous insulin assays have existed for decades, the recent advent of homogeneous time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer (HTRF) technology has significantly simplified these measurements. This is a rapid, cost-effective, reproducible, and robust optical assay reliant upon antibodies conjugated to bright fluorophores with long lasting emission which facilitates time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer. Moreover, HTRF insulin detection is amenable for the development of high-throughput screening assays. Here we use HTRF to detect insulin secretion in INS-1E cells, a rat insulinoma-derived cell line. This allows us to estimate basal levels of insulin and their changes in response to glucose stimulation. In addition, we use this insulin detection system to confirm the role of dopamine as a negative regulator of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). In a similar manner, other dopamine D2-like receptor agonists, quinpirole, and bromocriptine, reduce GSIS in a concentration-dependent manner. Our results highlight the utility of the HTRF insulin assay format in determining the role of numerous drugs in GSIS and their pharmacological profiles.

Here, we present homogeneous time resolved FRET (HTRF) as an efficient method for rapid detection of insulin secreted from cells.

Förster Time-resolved omogeneo risonanza energia basati su trasferimento test per la determinazione della secrezione dell'insulina

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Acclimation Prior to an Intraperitoneal Insulin Tolerance Test to Mitigate Stress-Induced Hyperglycemia in Conscious Mice

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that involves measurement of blood glucose levels over time following a single intraperitoneal injection of insulin. Given that it is performed in the conscious state and blood is often collected via a tail snip, it has the potential to elicit a stress response from animals due to anxiety associated with handling and blood collection. As such, a stress-induced rise in blood glucose can occur, making it difficult to detect and interpret the primary endpoint measure, namely an insulin-mediated reduction in blood glucose. This has been seen in many mouse strains, and is quite common in diabetic db/db mice, where glucose levels can increase, rather than decrease, after insulin administration. Here, we describe a method of acclimating mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test. We find that this lowers stress-induced hyperglycemia and results in data that more accurately reflects whole body insulin sensitivity.

Stress-induced elevations in glucose levels can confound interpretation of data derived from a conscious intraperitoneal insulin tolerance test in mice. In this article, we describe a method to acclimate the mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test in order to limit stress-induced hyperglycemia.

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

Misurazione e risposta alla somministrazione di glucosio alla stimolazione dell&#39;insulina in<em&gt; In vitro</em&gt; Myotubes primario umano coltivato

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, depending on the specific assay. Secreted luciferase assays expedite results and lower the assay cost per sample substantially. Here we present a relatively underused approach to gauge insulin secretory activity from pancreatic &#946; cells by using Gaussia luciferase genetically inserted within the C-peptide. During proteolytic processing of proinsulin, the C-peptide is excised releasing the luciferase within the insulin secretory vesicle where it is co-secreted with insulin. Results can be obtained within minutes after sample collection because of the speed of luciferase assays. A limitation of the assay is that it is a relative measurement of insulin secretion and not an absolute quantitation. However, this protocol is economical, scalable, and can be performed using most standard luminescence plate readers. Analog and digital multichannel pipettes facilitate multiple steps of the assay. Many different experimental variations can be tested simultaneously. Once a focused set of conditions are decided upon, insulin concentrations should be measured directly using antibody-based assays with standard curves to confirm the luciferase assay results.

This protocol describes how to perform rapid low-cost luciferase assays at medium-throughput using an insulin-linked Gaussia luciferase as a proxy for insulin secretion from beta cells. The assay can be performed with most luminescence plate readers and multichannel pipettes.

Misurazione della secrezione relativa dell'insulina utilizzando un surrogato Luciferase co-secreted

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Un modello In Ovo per testare composti insulino-mimetici

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo

L'insulina per iniezione ed estrazione emolinfa per misurare la sensibilità all'insulina nei adulti Drosophila melanogaster